全 文 ：127※基础研究 食品科学 2009, Vol. 30, No. 03
制备型高速逆流色谱分离纯化长松萝中的松萝酸
迟春艳 1，石 波 1,*，程永强 2，梁 平 1，李静梅 3
(1.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；
3.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)
摘 要：利用制备型高速逆流色谱分离纯化长松萝中的松萝酸，经过高效液相色谱、核磁共振检测，确定其纯
度及结构。将长松萝破碎后用石油醚(60～90℃)回流浸提4h，浸提液经过滤浓缩后得到松萝酸粗提物。采用正己
烷:乙腈:乙酸乙酯:水(8:7:5:0.8，V/V)的两相体系将所得的粗提物进行制备型高速逆流色谱的分离纯化，一次进样
25mg，可得到11.2mg样品。利用高效液相色谱检测该样品纯度达到99%。将得到的样品进行1H-NMR、13C-NMR
检测确定其化学结构，并确定该样品为松萝酸。实验证明制备型高速逆流色谱可以成功地将长松萝中的松萝酸进行
分离纯化。
关键词：制备型高速逆流色谱；长松萝；松萝酸；分离；纯化
Isolation and Purification of Usnic Acid from Usnea longissima by Prep rative High-speed
Counter-current Chromatography
CHI Chun-yan1，SHI Bo1,*，CHENG Yong-qiang2，LIANG Ping1，LI Jing-mei3
(1. Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China；
2. College of Food and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；
3. Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract ：Preparative high-speed counter-current chromatography (HSCCC) was used for the isolation and purification of usnic
acid from Usnea longissima. Crude extract was firstly obtained by reflux extraction with petroleum ether at 60 to 90 ℃ for 4 h
from dried Usnea longissima. Then hexane-acetonitrile-ethyl acetate-water (8:7:5:0.8, V/V) was used as the two-phase solvent
system for purification. Finally the collected components were analyzed using high-performance liquid chromatography (HPLC)
and the structure of main component was identified using 1H-NMR a d 13C-NMR. By this way, the 11.2 mg of usnic acid is
obtained from 25 mg of the crude extract of dried Usnea longissima with the purity of 99%.
Key words：high-speed counter-current chromatography；Usnea longissima；usnic acid； s lation；purification
中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)03-0127-03
收稿日期：2008-02-28
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD12B05-02-01)
作者简介：迟春艳(1982-)，女，硕士研究生，主要从事天然产物活性成分分离纯化研究。E-mail：chichunyan3702@163.com
*通讯作者：石波(1964-)，男，研究员，博士，主要从事功能活性研究。E-mail：shibo@mail.caas.net.cn
长松萝(Usnea longissima)为松萝科松罗属的一种地
衣植物，亦称天蓬草，主要生长于新疆、内蒙古、云
南、甘肃、西藏、黑龙江、吉林、辽宁、湖北等
地，具有清热解毒、止咳化痰、消炎等功效。松萝
酸是长松萝的主要生物活性成分之一，对金黄色葡萄球
菌显示出较强的抑制效应，对大肠杆菌、霉菌、酵母
菌及病原菌也有一定的抑制作用，可作为天然防腐剂用
于食品和饲料中[1-2]。其结构见图1。
松萝酸的制备一般采用有机溶剂提取，再经过反复
重结晶或硅胶柱层析纯化的方式，获得高纯度的产物[3-4]。
图1 松萝酸结构
Fig.1 Structure of (+)-usnic acid
OH
H3C
O
OH
CH3
O
O
O
CH3
HO
H3C
6
5a
9b
9a
4a
1
3
4
2
由于多次重结晶以及硅胶柱层析会对目标产物造成较大
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的损失，使得收率大大降低，同时其过程繁琐冗
长，因此如何简易方便的制备高纯度的松萝酸就显得
较为重要。
高速逆流色谱(HSCCC)是日本学者Ito博士发明的一
种新的液液分离纯化技术。与以前的分离纯化技术相比
具有进样量大、分离能力强、分离时间短、没有样品
损失以及分离纯化与制备可同步完成等优点。因此高速
逆流色谱的越来越受到制备工业的重视，已经利用高速
逆流色谱制备了大量的纯度较高的生物活性成分应用于生
物医药、食品、化学等多个领域，并取得满意的效果。
本实验利用制备型高速逆流色谱对长松萝中的松萝酸
进行制备纯化，从而找到最佳的分离纯化条件。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
长松萝由河南项城恒祥有限公司提供，产地为湖
北，经河南省中医研究院鉴定为长松萝。将长松萝放
在阴凉处风干，破碎。
石油醚(60～90℃)、正己烷及乙酸乙酯均为国产分
析纯；实验用水水为重蒸水。
1.2仪器与设备
HSCCC-1000高效逆流色谱 美国Pharma-tech Re-
search 公司；EC-2000色谱工作站 大连依利特分析仪器
有限公司；Waters 2695高效液相色谱仪(配有光电二极
管阵列检测器，PDA) 美国Waters公司； RE-3000旋
转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂； APEXII型FT-ICR 质
谱仪 美国Bruker Daltonic公司； Bruker ARX-400 核磁
共振仪 瑞士Bruker公司。
1.3方法
1.3.1松萝酸粗品的制备
粉碎后的长松萝100g装入2000ml的圆底烧瓶中，加
入600ml石油醚(60～90℃)回流4h，热过滤。将滤液45℃
真空浓缩除去石油醚得到含有松萝酸的粗提物。4℃冰
箱保存用于以后的分离实验。
1.3.2高速逆流色谱分离纯化松萝酸粗提物
采用正己烷-乙腈-乙酸乙酯-水(8:7:5:0.8，V/V)做
为HSCCC的两相溶剂系统。首先配制上述体积比的溶
剂体系，将其充分混合后，静置分相后脱气30min。取
上相作为固定相，下相为流动相。将固定相以6ml/min
的流速泵入高速逆流色谱的分离柱中，启动高速逆流色
谱主机，调节分离柱转速为600r/min左右，然后将流
动相以1.5ml/min的流速由首端向尾端泵入。当流动相从
尾端流出时，说明两相体系已经在高速逆流色谱的分离
柱中达到流体动力学平衡。此时可以将预先准备好的样
品打入样品环进样。样品的制备：取25mg松萝酸粗提
物溶解在5ml上相和5ml下相中。分离柱出口与紫外检
测器及色谱工作站连接，在254nm处进行检测。使用
自动部分收集器收集流出的流动相。根据色谱工作站谱
图收集处理不同组分峰的样品。
1.3.3松萝酸粗提物和高速逆流色谱制备纯化产品的液
相色谱分析
称取一定量的松萝酸粗提物，用乙腈溶解并定容
后，上机测定。同时根据高速逆流色谱分离所得到的
谱图将不同组分峰的样品分段收集，氮气吹干后，用
高效液相色谱仪分析其纯度。
高效液相色谱(HPLC)测定条件：色谱柱：Agilent
反相C18柱(150×4.6mm，10μm)；流动相：乙腈-0.1%
乙酸(60:40，V/V)；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；
检测温度：30℃；上样量：10μl。
2 结果与分析
2.1高速逆流色谱溶剂体系的选择
采用高速逆流色谱分离目标产物首先要确定合适的
溶剂体系。而溶剂体系的确定则主要依据目标物在溶剂
体系中的分配系数(K)。一般而言高速逆流色谱的分配
系数K介于0.5～1之间具有最佳的分离效果[5]。由于松
萝酸本身难溶于水，微溶于乙腈和甲醇，本实验选择
正己烷、乙腈、乙酸乙酯为两相溶剂系统的主要组成
溶剂。为了获得两相溶剂系统，提高两相溶剂的分相
速率以及在HSCCC分离过程中的稳定性，本实验在此
三种有机溶剂中加入少量的水，即采用正己烷-乙腈-乙
酸乙酯-水作为HSCCC的两相溶剂系统，并根据分离效
果优化该溶剂系统的配比系数比。正己烷-乙腈-乙酸
乙酯-水的比例为8:7:5:1(V/V)时，出现三相体系；正己
烷-乙腈-乙酸乙酯:水的比例为8:7:5:0.8(V/V)时，三相变
图2 松罗酸高速逆流色谱谱图
Fig.2 HSCCC chromatograms of crude extract of Usnea
longissima
a.正己烷-乙腈-乙酸乙酯-水(8:7:5:0.8, V/V)为两相溶剂系统；b.正己烷-
乙腈-乙酸乙酯-水(8:7:5:0.5, V/V)为两相溶剂系统。
958
747
536
325
114
-97
峰 A
m
V
时间(min)
0 30 60 90 120150180
a
958
747
536
325
114
-97
峰 A
m
V
时间(min)
0 35 70 105145 175
b
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为两相；继续减少水的比例，当正己烷-乙腈-乙酸乙
酯-水的比例为8:7:5:0.5(V/V)时，仍保持两相体系，但
是上相体积量明显减少。当溶剂比为8:7:5:0.8，流动相
流速为1.5ml/min时，固定相的保留率为76%，组分峰
A的K值为0.48；而溶剂比例变为8:7:5:0.5时，固定相
的保留率为71%，组分峰A的K值为0.38。由色谱工
作站谱图来看，当溶剂比为8:7:5:0.8(图2a)时分离效果噪
音明显要好于溶剂比为8:7:5:0.5(图2b)。综合以上情况，
确定本实验HSCCC的溶剂体系为正己烷-乙腈-乙酸乙
酯-水，比例为8:7:5:0.8(V/V)。
2.2产品纯度的测定
称取一定量的松萝酸石油醚粗提物，用乙腈溶解并
定容后，上机测定，得到图3。可以看出，在254nm
条件下，浸膏中有三种主要成分，其中最大为组分A，
其纯度(以峰面积百分比计)为84.2%。
图3 石油醚提取的松萝酸粗品的HPLC谱图
Fig.3 HPLC chromatogram of crude petroleum ether extract of
Usnea longissima
0.60
0.40
0.20
0.00
峰A
m
V
时间(min)
0 2 4 6 8 10121416
图4 组分峰A的HPLC谱图
Fig.4 HPLC chromatogram of peak A in Fig.3
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
峰 A
m
V
时间(min)
0 2 4 6 8 10121416
图4是利用高速逆流色谱分离得到的组分峰A的高
效液相色谱图。可以看出，组分峰A中只含有一个主
要成分，且纯度较高，可达99%(以峰面积百分比计)。
2.3组分峰的结构鉴定
将HSCCC分离后得到的组分峰A分别收集，N2吹
干后进行1H-NMR、13C-NMR检测，确定其化学结构，
结果见图 5、6。
组分峰A：1H-NMR (300MHz，CDCl3)：76、2.10、
2.66、2.68(3H,s)、5.98、11.03、1 .33(1H,s)；13C-NMR
(75MHz,CDCl3)：197.80(s,C-1)、104.98(s,C-2)、205.10(s,
2-OCCH3)、27.58(q,2-OCCH3)、191.44(s,C-3)、98.06(d,
C-4)、179.10(s,C-4a)、101.27(s,C-6)、200.03(s,6-
OCCH3)、30.97(q,6-OCCH3)、154.95(s,C-5a)、63.6(s,C-
9)、103.69(s,C-7)、109.07(s,C-8)、7.25(q,8-CH3)、
157.25(s,C-9)、103.69(s,C-9a)、58.81(s,C-9b)、31.84(q,
9b-CH3)。根据以上实验数据，结合参考文献[6]，确
定组分峰A为松萝酸。
3 结 论
选择正己烷-乙腈-乙酸乙酯-水(8:7:5:0.8，V/V)作
为本实验制备型HSCCC的两相溶剂系统可成功地将长松
萝中的松萝酸分离纯化出来。松萝酸纯度达到99%。一
次进样松萝酸粗品25mg可获得松萝酸纯品11.2mg。
HSCCC用于制备性分离纯化长松萝中的松萝酸具有极大
的优越性。
参考文献：
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