全 文 ：罗勒毛状根的诱导及培养
闻玉莉，杨世海* (吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118)
摘要 ［目的］利用 4种发根农杆菌 R1，R1601，1025，1000诱导药用植物罗勒产生毛状根，建立毛状根培养体系。［方法］利用共培养法
研究不同外植体、菌株、预培养时间、感染时间以及外源激素等对罗勒毛状根诱导率的影响。［结果］利用发根农杆菌 1025，预培养 2 d
的叶片为转化材料，感染 6 ～8 min，加入 0. 1 mg /L NAA的诱导率最高。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察，确立罗勒
毛状根在 1 /2MS 培养基中的最佳继代时间为 21 d。［结论］罗勒毛状根离体培养的建立，为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠
定了基础。
关键词 罗勒;发根农杆菌;毛状根
中图分类号 S603. 6 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2010)04 －01727 －04
Induction and in vitro Culture of Hairy Roots of Ocimum basilicum
WEN Yu-li et al (College of Chinese Medicinal Material，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118)
Abstract ［Objective］Hairy root of Ocimum basilicum were induced by the infection of four kinds of Agrobacterium rhizogenes strains R1，
R1601，1025 and 1000 and an in vitro culture system of the hairy roots was established. ［Method］Hairy roots were induced by co-culture.
Effects of explants，Agrobacterium rhizogenes，preculture time，infecting time and phytohormone on the induction rate were studied. ［Result］
The highest induction rate was obtained from blade leaf with 2 d preculture which were induced by 1025 for 6 － 8 min. The transformation rate
could be raised by culture media with 0. 1 mg /L NAA. Through the screen of basic media and the research of growth curve of hairy roots，the
optimum inoculum time was selected in 21 days or so in 1 /2MS medium. ［Conclusion］Establishment of hairy root culture of Ocimum basilicum
provided a foundation for the industrial production of active drug component.
Key words Ocimum basilicum L.;Agrobacterium rhizogenes;Hairy roots
作者简介 闻玉莉(1982 －) ，女，吉林白城人，硕士研究生，研究方向:
中药资源与生物技术。* 通讯作者。
收稿日期 2009-10-23
罗勒(Ocimum basilicum L.)属于唇形科罗勒属，1 年生
草本植物，全草具芳香，花苞含精油，从叶中提取的精油为黄
绿色，成分为甲基黑椒酚、芳樟醇、桉叶油素等，是具有较高
开发前景的香料植物［1］。罗勒辛温，发汗解表，祛风除湿，散
淤止痛［2］，常用于治疗风寒感冒、头痛、胃腹胀满、消化不良、
胃痛肠炎腹泻等症。罗勒在医药、食品、香料工业和畜禽饲
料行业具有很大的开发利用价值［3］。近年来，利用毛状根转
化技术获得药用植物次生代谢产物的研究，主要集中在一些
价格高、有效成分含量低、需求量大的药物成分上。目前，已
有大量关于毛状根诱导效率的研究。据不完全统计，国内外
已对 26科 96种药用植物进行了毛状根诱导的研究，有些已
建立了长期的毛状根培养系统［4］，如银杏［5］、短叶红豆杉［6］、
萝芙木［7］、人参［8］、青蒿［9］、桔梗［10］、丹参［11］等。目前国内外
学者对罗勒的研究主要集中于化学成分方面，而对毛状根诱
导的研究尚未见报道。
1 材料与方法
1. 1 无菌外植体的制备 供试罗勒种子采自吉林农业大学
药园，由吉林农业大学中药材学院刘霞教授鉴定为唇形科植
物罗勒(Ocimum basilicum L.)。挑选成熟饱满的罗勒种子，
用无菌水清洗 3次，然后用浓度 70%酒精消毒 40 s后，用无
菌水清洗 3次;用浓度 0. 1%HgCl2 浸泡 10 min之后，用无菌
水冲洗 3次，用无菌滤纸将种子表面的水分吸干，将种子接
种到 MS0 琼脂培养基(不添加任何激素)中，在温度 25 ℃、
光强 2 000 lx、光照 12 h /d条件下培养。待叶片完全张开后，
作为遗传转化用的外植体。
1. 2 发根农杆菌的活化 在无菌条件下，用接种针挑取保
存菌液，在 YEB固体平板上划线培养，28 ℃放置于黑暗条件
下培养，直到长出单菌落。挑取 1 个单菌落接种于 20 ml 附
加有 50 mg /L Kan 的液体 YEB 培养基中，28 ℃、摇床摇速
180 r /min条件下培养 24 h复苏。此时，YEB 液体培养基由
接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡黄色，证明细菌已正常
长出。长出的菌液还要进行再次活化，活化时取 0. 6 ml复苏
菌液于30 ml YEB液体培养基中，28 ℃、180 r /min培养12 h，
活化菌液达到对数生长期，此时菌液可作为感染用。
1. 3 发根农杆菌对罗勒的遗传转化 在无菌条件下将罗勒
无菌苗的幼嫩叶片剪成 0. 5 cm2 大小的片段，茎段剪成长约
0. 5 cm。每个样品的MS固体培养基上接种 10片，黑暗中 25
℃下预培养 2 d。在超净工作台上将预培养后的叶片转移至
已灭菌的锥形瓶中，再将活化好的感染菌液倒入其中，感染 8
min。在感染过程中，轻轻地摇晃锥形瓶，然后用无菌滤纸吸
干表面菌液，接种到原固体平板培养基上，在 25 ℃黑暗条件
下共培养 2 d，再转接到含有500 mg /L Cef的MS固体平板培
养基上于 25 ℃黑暗条件下培养，同时以未被菌液感染的外
植体作为对照。每周转接 1 次，待开始发根后，逐步降低抗
生素浓度，及时转移和扩增在无激素MS培养基上，多次继代
直至达到完全除菌后再去掉抗生素继续培养。30 d后统计
诱导出的毛状根数，并且计算平均诱导率。罗勒毛状根诱导
率按以下公式计算。
诱导率 =(长出毛状根的外植体数 /接种外植体的总块
数)×100%
预培养培养基组成为:MS +蔗糖 3% +琼脂 0. 7%;共培
养培养基组成为:MS +蔗糖 3% +琼脂 0. 7%;除菌培养基组
成为:MS +500 mg /L Cef +蔗糖 3% +琼脂 0. 7%。取完全除
菌的毛状根转移到 MS0液体培养基中，建立毛状根离体培养
体系。
1. 4 毛状根生长培养基的筛选 取相同重量、除菌完全、生
长速度快的毛状根分别在无激素 1 /2MS、MS、N6 等液体培养
基中培养，观察毛状根的生长状况。液体培养基每瓶(100
ml三角瓶)装培养液 50 ml，在摇床上培养，每个处理重复 3
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci. 2010，38(4):1727 － 1730 责任编辑 刘月娟 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.04.090
次，21 d后称取毛状根鲜重，计算毛状根的鲜重、增殖倍数。
1. 5 不同蔗糖浓度对罗勒毛状根生长的影响 为探讨蔗糖
浓度对罗勒毛状根生长的影响，在 1 /2MS液体培养基中加入
不同浓度(0、1%、2%、3%、4%、5%、6%)的蔗糖，每个处理
重复 3次，21 d后测定罗勒毛状根的鲜重、增殖倍数。
1. 6 罗勒毛状根生长周期的测定 取 1 /2MS液体培养基中
培养的毛状根，每隔 3 d测定 1次。先用镊子取出根，挤净根
中所含培养基，用分析天平称鲜重，计算增殖倍数。用蒸馏
水漂洗 1 min，50 ℃烘干，称干重，保存，备用。其计算公式为:
增长倍数 =(收获后鲜重 －接种鲜重)/接种鲜重
2 结果与分析
2. 1 不同因素对罗勒毛状根诱导率的影响
2. 1. 1 外植体。利用 R1、R1601、1025、1000 发根农杆菌，采
用共培养法对罗勒无菌苗的茎段和叶进行浸染。由表 1 可
知，选用的外植体不同，毛状根的诱导率也不同。1000、
R1601、1025、R1菌株对叶片均有较好的诱导能力;而对于茎
段，4 种菌株诱导效果较差。因此，罗勒叶片为最佳诱导
材料。
表 1 不同外植体对罗勒毛状根诱导率的影响
Table 1 Effects of different explants on the induction rate of hairy
roots
外植体
Explants
菌株
Strain
感染外植体数
Infected explant
number
生根外植体数
Rooting explant
number
诱导率∥%
Induction rate
叶片 1000 30 10 33. 33
Leaves R1601 30 13 43. 33
1025 30 15 50. 00
R1 30 9 30. 00
对照 30 0 0
茎段 1000 30 7 23. 33
Stem R1601 30 5 16. 67
1025 30 11 36. 67
R1 30 5 16. 67
对照 30 0 0
2. 1. 2 发根农杆菌菌株。在相同的培养条件下，采用相同
的方法，利用 R1、R1601、1025、1000 发根农杆菌对罗勒叶片
进行诱导，发现这 4 种菌株对罗勒毛状根诱导均有作用，约
在浸染8 d后开始有毛状根长出。这些诱导出来的根均具有
典型的毛状根特征，具白色根毛，向上生长失去向地性。由
表 2可知，不同发根农杆菌对罗勒毛状根的诱导率不同。
1025菌株对罗勒毛状根的诱导率较其他菌株高。这 4 种菌
对罗勒毛状根的诱导率从高到低依次是 1025、R1601、1000、
表 2 不同发根农杆菌对罗勒毛状根诱导率的影响
Table 2 Effects of four kinds of A. rhizogenes on the induction rate of
hairy roots
菌株类型
Strain types
感染外植体数
Infected explant
number
生根外植体数
Rooting explant
number
诱导率∥%
Induction rate
R1 30 7 23. 33
R1601 30 11 36. 67
1025 30 16 53. 33
1000 30 9 30. 00
对照 30 0 0
R1。其中，1025菌株对罗勒的诱导率可达 53. 33%，而 R1只
有 23. 33%。因此，后续试验均采用 1025 菌株诱导。此外，
还发现越接近叶柄和主叶脉处的伤口发根越多，其他切口几
乎不发根。这可能是因为叶柄、叶脉具有发育成根的特性。
2. 1. 3 预培养时间。选用 1025 菌株感染罗勒叶片诱导毛
状根，分别将待转化的外植体预培养后计算诱导率。由表 3
可知，外植体材料经过不同的预培养时间培养后，诱导率有
所不同。未经过预培养的材料在受感染后迅速死亡，而经预
培养的外植体诱导率有所提高。其中，预培养 2 ～3 d可以使
诱导率提高到 45% ～54%，预培养超过 3 d诱导率降低。试
验表明，2 ～3 d是预培养的最佳时间。
表 3 不同预培养时间对罗勒毛状根诱导率的影响
Table 3 Effects of different preculture time on the transformation rate
of hairy roots
预培养时间∥d
Preculture time
感染外植体数
Infected explant
number
生根外植体数
Rooting explant
number
诱导率∥%
Induction rate
0 30 0 0
1 30 9 30. 00
2 30 17 56. 67
3 30 14 46. 67
4 30 10 43. 33
2. 1. 4 浸染时间。浸染时间对罗勒毛状根诱导率有直接的
影响。适宜的浸染时间有助于农杆菌对植物细胞的附着和
转化。如果浸染时间太短，那么农杆菌来不及侵入细胞内
部;如果浸染时间太长，那么农杆菌易对外植体细胞造成伤
害，导致外植体的存活率下降。用发根农杆菌 1025 进行浸
染，30 d后计算诱导率。由表 4、图 1a ～ e 可知，不同浸染时
间对发根诱导率的影响特别明显。随着浸染时间的增加，诱
导率也随之升高，浸染 8 min后诱导率有所下降。浸染时间
在 6 ～8 min时诱导效果较好，浸染 10 min 之后平均诱导率
急剧下降，浸染 12 min时诱导率仅 13. 33%。
表 4 不同浸染时间对罗勒毛状根诱导率的影响
Table 4 Effects of different infecting time on the induction rate of
hairy roots
浸染时间∥min
Infecting time
接种外植体数
Inoculated explant
number
生根外植体数
Rooting explant
number
诱导率∥%
Induction rate
0 30 0 0
4 30 10 33. 33
6 30 15 50. 00
8 30 16 53. 33
10 30 9 30. 00
12 30 4 13. 33
2. 1. 5 外源激素。外源激素对诱导毛状根有一定的促进作
用。不同外源生长素对罗勒毛状根的诱导率不同。由表 5、
图1f ～ i可知，6-BA，2，4-D和 NAA都能提高罗勒毛状根的诱
导率，但是 NAA的作用要明显高于 6-BA和 2，4-D。经过含
NAA的 MS固体培养基预培养和共培养可以使诱导率达到
88. 89%，提高了 1倍左右，效果最为明显。加入 2，4-D，使外
植体愈伤化比较严重。
8271 安徽农业科学 2010 年
图 1 罗勒毛状根诱导、培养照片
Fig. 1 Photos of induction and culture of lairy roots
表 5 不同外源激素对罗勒毛状根诱导率的影响
Table 5 Effects of different phytohormones on the induction rate of
hairy roots
培养基
Medium
感染外植体数
Infected plant
number
生根外植体数
Rooting explant
number
诱导率∥%
Induction rate
MS +2，4-D 27 21 77. 78
MS +6-BA 27 15 55. 56
MS + NAA 27 24 88. 89
MS 27 13 48. 15
注:2，4-D，6-BA和 NAA浓度均为 0. 1 mg /L。
Note:The concentration of 2，4-D，6-BA and NAA is 0. 1 mg /L.
2. 2 不同培养基上罗勒毛状根的生长情况 将毛状根接种
在不同的无激素液体培养基中进行培养。由表 6 可知，培养
基不同，毛状根生长速度也不同。培养 21 d 后，在 MS、
1 /2MS、N6 液体培养基中增殖倍数分别为 32. 35、40. 26、1. 64
倍，即1 /2MS培养基中培养的毛状根鲜重增殖倍数最高，并且
毛状根较长、较粗，具许多细小的分支。这说明 1 /2MS液体
培养基是适宜毛状根增殖的培养基。
2. 3 蔗糖浓度对罗勒毛状根生长的影响 许多研究已经证
实，碳源种类、浓度对发根生长、次生代谢物的产生均有影
响［9，12］。由图 1j ～ k、2可知，培养基中的蔗糖对毛状根的生
长有促进作用。起初随着蔗糖浓度的增加，蔗糖的促进作用
增强，当达到一定浓度时，蔗糖又有一定的抑制作用。当蔗
糖浓度达到 3%时，促进作用最强。毛状根培养 21 d 后，添
加 3%蔗糖的培养基培养的毛状根增殖倍数达 39. 25，其生
物量积累最快，增殖倍数最高。当蔗糖浓度大于或小于 3%
时，毛状根的生长速度都有所降低。
2. 4 罗勒毛状根生长周期 由图 3 可知，毛状根生长量随
培养时间的推移而逐渐增加;罗勒毛状根在不含激素的 MS
液体培养基中的生长趋势呈“S”型。接种后 1 ～12 d，毛状根
927138卷 4期 闻玉莉等 罗勒毛状根的诱导及培养
表 6 不同培养基上罗勒毛状根的生长情况
Table 6 Effects of different media on the growth of hairy roots of Oci-
mum basilicum
培养基种类
Kinds of media
接种量∥g
Inoculation amount
收获量∥g
Harvested yield
增殖倍数
Increased multiple
MS 0. 432 5 13. 992 5 32. 35
1 /2MS 0. 451 6 18. 180 4 40. 26
N6 0. 429 8 0. 705 5 1. 64
图 2 不同蔗糖浓度对罗勒毛状根生长的影响
Fig. 2 Effects of different sucrose concentrations on the growth
of hairy roots of Ocimum basilicum
的生长比较缓慢;接种后 13 ～ 18 d，毛状根生长加快，达到对
数生长期;但是，接种后 21 d毛状根的生长变缓，进入生长的
平台期。同时还观察到，随着培养时间的延长，毛状根由鲜
白色逐渐变为淡黄色，培养 21 d后变为淡黄褐色。所以，毛
状根的继代周期为 21 d。在该时期，应及时将毛状根进行继
代培养以维持不断生长的营养需求。
图 3 罗勒毛状根生长曲线
Fig. 3 Growth curve of hairy roots of Ocimum basilicum
3 讨论
关于罗勒的遗传转化目前还没有报道。该研究利用发
根农杆菌 1025转化罗勒叶片外植体，获得了激素自主、快速
生长、多分支、多根毛的毛状根株系，且在 1 /2MS液体培养基
中培养 21 d鲜重平均增殖达接种量的 39 倍，为今后进行罗
勒有效成分规模化生产奠定了理论基础。
蔗糖是毛状根离体培养必需的重要碳源和能源之一。
已有研究表明，它在培养基中的代谢与毛状根的生长、形态
及其次生物质的积累密切相关［9，13］。在培养青蒿毛状根时
发现，在一定的浓度范围内提高蔗糖浓度可刺激毛状根的生
长，但仅 2%蔗糖有利于青蒿素的产生。当蔗糖浓度大于
2%时，青蒿素含量下降;当蔗糖浓度达到 8%时，根的形态发
生变化，分枝减少，根变粗，极易断裂，颜色由淡黄色变成浅
黄色，生长速度也开始下降［9］。而在培养天仙子毛状根时，
培养基中的蔗糖浓度并不明显影响毛状根的生长，但浓度
3%蔗糖最适合生物碱的产生［14］。步怀宇等认为，2% ～ 3%
是骆驼刺毛状根培养的最适蔗糖浓度［15］。可见，蔗糖浓度
对毛状根生长及其次生代谢物的影响程度因植物而异。在
该研究中，培养基中添加浓度 3%蔗糖最有利于罗勒毛状根
的生长。该试验为今后进行罗勒次生代谢产物的规模生产
奠定了基础。
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0371 安徽农业科学 2010 年