全 文 ：菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 November 2013, 32(6): 1028-1033
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q © 2013 IMCAS, all rights reserved.
*Corresponding author. E-mail: liuhw@im.ac.cn
收稿日期: 2012-09-10, 接受日期: 2012-11-28
黄白侧耳大米固体发酵次级代谢产物分析
王少娟 1,2 王雅琪 3 宝丽 1 杨晓莉 1 文华安 1 刘宏伟 1*
1中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室 北京 100101
2中国科学院大学 北京 100049
3江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 江西 南昌 330004
摘 要：从黄白侧耳 Pleurotus cornucopiae大米固体发酵物中分离得到 4个苯酞类化合物，2个为新结构化合物：
2-(ethoxymethyl)-3,5-diethoxybenzyl acetate（1）、2-(acetoxymethyl)-4,6-dimethoxybenzyl tridecanoate（2），2个为已知
化合物：5,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one（3）、4,6-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one（4）。对化合物进行生物
活性评价发现，化合物 3、4具有抑制肿瘤细胞 HeLa生长活性，IC50值分别为 66.2和 65.7μmol/L；化合物 3和 4对
LPS诱导的 RAW264.7细胞释放 NO有抑制作用，IC50值分别为 17.2和 67.9μmol/L。
关键词：黄白侧耳，苯酞，细胞毒活性，NO释放抑制活性
Isolation and identification of secondary metabolites from the
solid culture of Pleurotus cornucopiae
WANG Shao-Juan1, 2 WANGYa-Qi3 BAO Li1 YANG Xiao-Li1 WEN Hua-An1
LIU Hong-Wei1*
1State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
2University of Chinese Academy of Sciences (UCAS), Beijing 100049, China
3Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Jiangxi University of Traditional Chinese
Medicine, Nanchang, Jiangxi 330004, China
Abstract: Two novel natural products, 2-(ethoxymethyl)-3,5-dimethoxybenzyl acetate (1), 2-(acetoxymethyl)-4,
6-dimethoxybenzyl tridecanoate (2), and two known compounds, 5,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (3),
4,6-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (4) were isolated from the solid culture of Pleurotus cornucopiae. Compounds 3 and
4 showed moderate cytotoxicity against HeLa cell line with the IC50 values of 66.2 and 65.7μmol/L, respectively. Compounds
3 and 4 inhibited NO production in LPS-activated murine macrophage RAW264.7 cells with the IC50 values of 17.2 and
67.9μmol/L, respectively.
Key words: Pleurotus cornucopiae, phthalides, cytotoxic activity, NO inhibition
DOI:10.13346/j.mycosystema.2013.06.004
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菌物学报
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近年来，从高等真菌中不断发现结构新颖、
具有显著生物活性的化合物，这些化合物可以为
新药物发现提供有利条件；而且高等真菌具有易
栽培、易发酵的特点，为将来工业化生产提供可
能（刘吉开 2004），因而，高等真菌的研究目前
受到广泛的关注。食用真菌在我国已有数千年的
使用历史，分布广泛，中国食用菌名录收录了
936种、23变种、3亚种和 4变型，是我国重要
的生物资源（戴玉成等 2010）。食用真菌具有高
蛋白、低脂肪的营养特点；且因含有多糖、萜类
等生物活性成分，而具有抗肿瘤、抗病毒、降血
脂等药理作用（Jang et al. 2001；Lee et al. 2011），
部分食用真菌兼做药用（戴玉成和杨祝良
2008）。
黄 白 侧 耳 Pleurotus cornucopiae (Paulet)
Rolland俗称姬菇、美味侧耳，隶属于担子菌门
Basidiomycota、伞菌纲 Agaricomycetes、伞菌目
Agaricales、侧耳科 Pleurotaceae，是世界性分布
的食用蕈菌，在我国河北、黑龙江、吉林、山东、
江苏、四川、安徽、江西、河南、广西、新疆、
云南等地均有分布（卯晓岚 1998）。黄白侧耳最
早引种于日本，因具有独特的食用口感，且价格
低廉，成为中国百姓餐桌上的佳品。目前国内外
针对黄白侧耳的研究主要集中于蛋白、多糖等初
级代谢产物（Jang et al. 2011；Zhao et al. 2011），
较少涉及次级代谢产物。我们通过前期筛选，
发现一株黄白侧耳的大米固体发酵物具有产率
高、次级代谢产物丰富的特点。因而，对这株
黄白侧耳大米固体发酵产物的化学成分进行研
究，从其乙酸乙酯提取物中分离得到 4个苯酞
类 化 合 物 ， 结 构 鉴 定 为
2-(ethoxymethyl)-3,5-dimethoxybenzyl acetate
（ 1 ）、 2-(acetoxymethyl)-4,6-dimethoxybenzyl
tridecanoate（2）、5,7-dimethoxyisobenzofuran-1
(3H)-one （ 3 ）、 4,6-dimethoxyisobenzofuran-
1(3H)-one（4）（图 1），其中化合物 1、2为新结
构化合物，化合物 1–4是首次从该真菌中分离得
到的。
图 1 黄白侧耳中分离得到的化合物结构
Fig. 1 Structures of 14 isolated from Pleurotus cornucopiae.
1 材料与方法
1.1 菌株与发酵
1.1.1 供试菌株：黄白侧耳 P. cornucopiae由中国
科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室文
华安研究员提供。
1.1.2 培养基：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，水
1,000mL，pH自然（平板加琼脂 18–20g）；大米
固体培养基：大米 80g，蒸馏水 120mL。
1.1.3 发酵：取斜面菌种接入平板后放入培养箱
中，25℃下，避光培养 7d至长满平板。取 4块
0.5cm2生长旺盛的平板菌丝块接种于装有种子
培养基的 500mL锥形瓶中，25℃摇床培养 7d。
吸取 5mL种子发酵液加入装有大米固体培养基
的 500mL锥形瓶中，于 25℃静止培养 40d。
1.1.4 仪器、材料：Bruker APEX III 7.0 T型高
分辨质谱仪、Bruker AV-500 型核磁共振仪
（TMS 内标）、Agilent-1200 系列高效液相色
谱仪、Shimadzu UV-240型紫外可见分光光度
仪、RP-18（250mm×20mm，Shimadzu Pak，
2.5mL/min）色谱柱。薄层色谱用硅胶 GF254
（10–40μmol/L）、柱色谱用硅胶（50–71μmol/L）
为青岛海洋化工厂生产。所用溶剂为市售 HPLC
纯、分析纯。显色剂为体积分数 10% 硫酸乙醇
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溶液。其他分离用填料包括 Sephadex LH-20
（Amersham Biosciences）和 ODS（40–63μmol/L，
Merck）。
1.2 提取分离
将 24瓶（1.9kg）黄白侧耳大米发酵产物合
并后用乙酸乙酯（1×4L）浸泡、超声提取 3次，
经减压浓缩得到浸膏（10.0g）。粗提物经硅胶柱
色谱分离，氯仿:甲醇（洗脱比例分别为 100:0、
100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、0:1，v/v）梯度
洗脱。氯仿洗脱部分继续用硅胶柱色谱（正己烷:
乙酸乙酯，洗脱比例分别为 100:0、100:1、50:1、
20:1、10:1、0:1，v/v）梯度分离，得到 12个子
流分（Fr.1–Fr.12）。Fr.10经 RP-HPLC纯化（甲
醇:水，55:45，v/v），得到化合物 1（2.3mg，tR
26.0min），Fr.8同样经 RP-HPLC纯化（甲醇:水，
90:10，v/v），得到化合物 2（2.0mg，tR 22.0min），
Fr.6经 Sephadex LH-20（氯仿:丙酮，1:1，v/v）
柱色谱，得到化合物 3（200.0mg），Fr.5 经
Sephadex LH-20（氯仿:丙酮，1:1，v/v）柱色谱，
得到化合物 4（100.0mg）。
1.3 HeLa 细胞体外生长抑制活性测试
化合物体外抗肿瘤活性采用 MTT 法
（Carmichael et al. 1987），选择人宫颈癌细胞株
HeLa，阳性对照药为 VP-16。取对数生长期的
HeLa细胞，用胰蛋白酶消化，制成 1×105个/mL
的单细胞悬液，接种于 96 孔板内（每孔加
200μL），每组设 3个平形孔。贴壁 24h后加入 5
种不同浓度的化合物培养 48h，化合物溶解在
DMSO中，并使每孔 DMSO的终浓度为 0.1%。
孵育结束后，除去每个孔中的培养基，加入 50μL
MTT培养基溶液，在 37℃孵育 3h。MTT培养
基溶液：MTT溶解在 DMEM培养基中，浓度为
0.5mg/mL。3h后除去 MTT培养基，每孔加入
100μL DMSO溶液，在 60r/min震荡 5min，使蓝
紫色结晶完全溶解，并除去气泡，用酶标仪在
490nm下测定吸光度（OD值）。同时设空白对
照组和阳性对照组。计算不同浓度下受试物对
HeLa细胞的抑制率（%），公式如下：
细胞生长抑制率=（1-A 实验组/A 对照组）×100%
1.4 NO 释放系统抑制活性测试
化合物对脂多糖（LPS）诱导 RAW264.7细
胞释放 NO抑制活性参考 Giang et al.（2003）的
方法。小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7培养于含
10%热灭活（56℃，30min）胎牛血清（FBS）
的高糖 DMEM培养液中，37℃下，5% CO2的恒
温培养箱中孵育。胰蛋白酶消化生长对数期细
胞，制成 1×105个/mL的单细胞悬液，加入 96
孔板中（每孔 200μL），每组设 3个平行孔，3h
后每孔加入终浓度为 1μg/mL的 LPS后，分别加
入不同浓度化合物（3μmol/L到 200μmol/L）。24h
以后，每孔取 100μL 上清液与等量的 Griess
reagent（Griess reagent A：0.1% N-萘乙二胺盐酸
盐溶液；Griess reagent B：1%对氨基苯磺酰胺溶
液+5%磷酸溶液，使用前 1:1混合）于 96孔板
混合，室温静止 15min后，用酶标仪在 570nm
处测定吸光度（OD值）。同时设定 LPS组，空
白对照组，阳性对照组（氢化可的松）。
NO抑制率（%）= [ALPS-A（LPS+样品）/A（LPS-A 空白）]×100%
2 结果与分析
2.1 结构鉴定
化合物 1：白色粉末（二氯甲烷），UV λmax：
205、230、285nm，IR（neat）σ：2,933、1,739、
1,607、1,594、1,488、1,464、1,236、837cm-1。
HR-ESI-MS：m/z [M + Na]+ 291.1207（calcd. for
C14H20O5Na，291.1203）。1H-NMR（500MHz，
CDCl3-d6）给出 4组甲基质子信号，δ 3.78（3H，
s，H3-13）、δ 3.79（3H，s，H3-14）、δ 2.09（3H，
s，H3-12）、δ 1.18（3H，t，J = 7.0Hz，H3-9），
其中δ 3.79、3.78分别为苯环上的甲氧基质子信
号；两个苯环质子信号δ 6.53（1H，d，J = 2.4Hz，
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H-3）、δ 6.41（1H，d，J = 2.4Hz，H-5）；3个与
氧相连的亚甲基质子信号δ 5.19（2H，s，H-10）、
δ 4.53（2H，s，H-7）和δ 3.50（2H，q，J = 7.0Hz，
H-8）。13C -NMR（125MHz，CDCl3-d6）给出 14
个碳信号，其中 1 个酯羰基碳信号 δ 171.0
（C-11）；6个 sp2杂化碳信号，分别为δ 160.6
（C-4）、δ 159.4（C-6）、δ 138.3（C-2）、δ 117.9
（C-1）、δ 105.9（C-3）及δ 98.5（C-5），确定化
合物 1中含有苯环结构；5个连氧碳信号δ 65.8
（C-8）、δ 64.1（C-10）、δ 62.6（C-7）、δ 56.1
（C-14）及δ 55.6（C-13）；两个 sp3杂化碳信号
δ 21.3（C-12）与δ 15.6（C-9）。HMBC谱中，
H-3（δ 6.53）与 C-1（δ 117.9）和 C-5（δ 98.5）；
H-5（δ 6.41）与 C-3（δ 105.9）和 C-4（δ 160.6）；
H3-12（δ 2.09）与 C-11（δ 171.0）；H-10（δ 5.19）
与 C-11（δ 171.0）、C-2（δ 138.3）、C-3（δ 105.9）
和 C-1（δ 117.9）；H-7（δ 4.53）与 C-2（δ 138.3）、
C-6（δ 159.4）和 C-1（δ 117.9）；H-8（δ 3.50）
与 C-9（δ 15.6）和 C-10（δ 64.1）；H3-13（δ 3.79）
与 C-4（δ 160.6）；H3-14（δ 3.79）与 C-6（δ 159.4）
有远程相关信号（图 2）。根据以上信息可以确
定 化 合 物 结 构 ， 命 名 为
2-(ethoxymethyl)-3,5-dimethoxybenzyl acetate。表
1为化合物 1的核磁数据。
图 2 化合物 1、2 主要的 HMBC 相关信号
Fig. 2 Key HMBC correlations of compounds 1 and 2.
表 1 化合物 1的 1H 和 13C 核磁数据
Table 1 1H and 13C-NMR (500MHz, in CDCl3-d6) data for
compound 1
Position
1
δH, mult (J in Hz) δC
1 117.9
2 138.3
3 6.53 (d, 2.4) 105.9
4 160.6
5 6.41 (d, 2.4) 98.5
6 159.4
7 4.53 (s) 62.6
8 3.50 (q, 7.0) 65.8
9 1.18 ( t, 7.0) 15.6
10 5.19 (s) 64.1
11 171.0
12 2.09 (s) 21.3
13 3.78 (s) 55.6
14 3.79 (s) 56.1
化合物 2：白色粉末（二氯甲烷），UV λmax：
205、230、285nm，IR（neat）σ：3,099、3,030、
3,002、2,920、1,739、1,728、1,606、1,597、937cm-1，
HR-ESI-MS：m/z [M+Na]+ 459.2711（calcd. for
C25H40O6Na，459.2719）。1H-NMR（500MHz，
CDCl3-d6）给出两个苯环质子信号δ 6.53（1H，
d，J=2.4Hz）、δ 6.44（1H，d，J=2.4Hz）；给
出 4组甲基质子信号δ 3.79（3H，s，H3-24）、δ
3.80（3H，s，H3-25）、δ 2.06（3H，s，H3-23）
和δ 0.86（3H，t，J=6.4Hz，H3-20），其中δ 3.79、
3.80 分别为苯环上甲氧基质子信号；在 δ
1.22–1.24 处积分显示有 16 个质子信号存在。
13C-NMR（125MHz，CDCl3-d6）给出 25个碳信
号，其中 2个酯羰基碳信号分别为δ 174.2（C-8）
与δ 170.8（C-22）；6个 sp2杂化碳信号，分别为
δ 161.2（C-4）、δ 160.0（C-6）、δ 138.2（C-2）、
δ 115.5（C-1）、δ 106.2（C-3）和δ 98.7（C-5），
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判断化合物 2含有苯环结构；4个连氧碳信号分
别为δ 64.2（C-21）、δ 57.5（C-7）、δ 56.0（C-25）
和δ 55.6（C-24）；另外有 13个 sp3杂化碳信号，
δ 34.6（C-9）、δ 32.2（C-18）、δ 29.4–29.9（7个
碳信号）、δ 25.2（C-10）、δ 22.9（C-19）、δ 21.2
（C-23）和δ 14.4（C-20）。HMBC谱中，H-3（δ
6.53）与 C-1（δ 115.5）、C-5（δ 98.7）和 C-21
（δ 64.2）；H-5（δ 6.44）与 C-1（δ 115.5）、C-3
（δ 106.2）和 C-4（δ 161.2）；H3-20（δ 0.86）与
C-18（δ 32.2）和 C-19（δ 22.9）；H-9（δ 2.26）
与 C-8（δ 174.2）、C-10（δ 25.2）和 C-11（δ 29.4）；
H-7（δ 5.09）与 C-1（δ 120.5）、C-2（δ 138.2）、
C-6（δ 160.0）和 C-8（δ 174.2）；H-21（δ 5.13）
与 C-1（δ 115.5）、C-2（δ 138.2）、C-3（δ 106.2）
和 C-22（δ 170.8）；H3-23（δ 2.06）与 C-22（δ
170.8）；H3-24（δ 3.79）与 C-4（δ 161.2）；H3-25
（δ 3.80）与 C-6（δ 160.0）有远程相关信号（图
2），根据以上信息，并结合分子式 C25H40O6，确
定化合物中存在 13 个碳原子的脂肪酸侧链结
构。通过以上数据可以确定化合物 2的结构，命
名 为 2-(acetoxymethyl)-4,6-dimethoxybenzyl
tridecanoate。表 2为化合物 2的核磁数据。
化合物 3：白色片晶（二氯甲烷），UV λmax：
210、260、290nm，HR-ESI-MS：m/z [M+H]+
217.0413（calcd. for C10H10O4Na，217.0417）。1H-
NMR（500MHz，CDCl3-d6）：δ 6.42（1H，s）、δ
6.34（1H，s）、δ 5.08（2H，s）、δ 3.86（3H，s）
和δ 3.82（3H，s）。以上波谱数据与 Sargent et al.
（1987）报道的一致，故确定化合物 3 为
5,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one。
化合物 4：无色针晶（二氯甲烷），UV λmax：
210、260、290nm，HR-ESI-MS：m/z [M+H]+
217.0420（calcd. for C10H10O4Na，217.0417）。
1H-NMR（500MHz，CDCl3-d6）δ 6.85（1H，d，
J=1.8Hz）、δ 6.62（1H，d，J=1.7Hz）、δ 5.13
表 2 化合物 2的 1H 和 13C 核磁数据
Table 2 1H and 13C-NMR (500MHz, in CDCl3-d6) data for
compound 2
Position
2
δH, mult (J in Hz) δC
1 115.5
2 138.2
3 6.53 (d, 2.4) 106.2
4 161.2
5 6.44 (d, 2.4) 98.7
6 160.0
7 5.17 (s) 57.5
8 174.2
9 2.26 (t, 7.6) 34.6
10 1.56 (m) 25.2
11–17 1.22–1.24 (m) 29.4–29.9
18 1.22–1.24 (m) 32.2
19 1.27 (m) 22.9
20 0.86 (t, 6.4) 14.4
21 5.13 (s) 64.2
22 170.8
23 2.06 (s) 21.2
24 3.79 (s) 55.6
25 3.80 (s) 56.0
（2H，s）、δ 3.82（3H，s）和δ 3.80（3H，s）。
以上波谱数据与Watanabe et al.（1989）的报道
一 致 ， 故 化 合 物 4 鉴 定 为 4 ，
6-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one。
2.2 化合物生物活性测试
化合物体外抗肿瘤活性结果显示化合物 3
和 4对人宫颈癌细胞株 HeLa有一定的增殖抑制
作用，其 IC50值分别为 66.2和 65.7μmol/L（阳
性对照 VP-16的 IC50值为 1.4μmol/L）。另外，
化合物 3和 4对 LPS诱导 RAW264.7细胞释放
NO具有较好的抑制活性，IC50值分别为 17.2和
67.9μmol/L（阳性对照氢化可的松 IC50值为
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53.8μmol/L），而且化合物 1–4在 100μmol/L浓
度时，镜下观察 RAW264.7细胞状态良好，无细
胞毒活性。
3 讨论
采用大米固体发酵培养黄白侧耳，乙酸乙
酯提取其次级代谢产物，运用多种色谱技术
对提取物进行分离，根据理化性质和波谱数
据鉴定了 4 个苯酞类化合物，分别为
2-(ethoxymethyl)-3,5-dimethoxybenzyl acetate
（ 1 ）， 2-(acetoxymethyl)-4,6-dimethoxybenzyl
tridecanoate（ 2）， 5,7-dimethoxyisobenzofuran-
1(3H)-one （ 3 ）， 4,6-dimethoxyisobenzofuran-
1(3H)-one（4），化合物 1、2为新结构化合物。
这 4个化合物均为首次从该真菌中分离得到。化
合物生物活性评估发现化合物 3、4对 HeLa细
胞具有中等细胞毒活性，化合物 3对 LPS诱导
RAW264.7 细胞释放 NO 抑制活性比阳性药更
强。这些具有明显生物活性次级代谢产物的发
现，同时也为运用固体发酵黄白侧耳提供
依据。
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