全 文 ：云南民族大学学报:自然科学版，2015，24(2):140 － 143 CN 53 － 1192 /N ISSN 1672 － 8513
doi:12． 3969 / j． issn． 1672 － 8513． 2015． 02． 015 http:/ / xb. ynni. edu. cn
收稿日期:2015 － 01 － 09．
基金项目:国家民委科研资助项目(12YNZ007);云南民族大学化学与生物技术学院大学生创新性实验项目(2013HXSＲT08)．
作者简介:刘满红(1962 －)，女，硕士，教授，硕士生导师．主要研究方向:物理化学．
云南肺衣中活性物质提取工艺与抗氧化性能研究
刘满红1，2，刘晓芳1，2，戴建辉1，2，杨华伦1，2，合雪阳1，2
(1. 云南民族大学 云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南 昆明 650500;
2. 云南民族大学 民族药资源化学国家民委 －教育部重点实验室，云南 昆明 650500)
摘要:对云南肺衣活性物质提取工艺与抗氧化活性进行了研究，结果表明，云南肺衣抗氧化活性
物质最佳提取工艺为:70%乙醇，料液比为 1∶5，温度 60 ℃，提取时间 3. 0 h，提取液对·OH清除
率为 96. 9%，IC50为 14. 7 mg /mL．
关键词:云南肺衣;提取工艺;抗氧化活性;羟自由基
中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1672 － 8513(2015)02 － 0140 － 04
地衣(lichens)是植物界一个特殊类群，是真菌
(fungi)和藻类(algae)高度结合的共生复合体，全世
界约有地衣植物 500 余属，26 000 多种．它们分布极
为广泛，从南北两极到赤道，从高山到平原，从森林
到荒漠均有地衣植物的存在．地衣含有松萝酸、珠光
酸、苔色酸等多种独特的次生代谢产物，具有多方面
的生物活性［1］．近几年的文献报道从地衣植物中分
离得到了许多具有活性的新化合物或新天然产物，
而国内对地衣化学成分方面的研究已有一些报
道［2 － 3］．而我国有丰富的地衣植物资源，尤其是在我
国的西南地区，地衣植物在民间可以做药用和食用，
其中的云南肺衣(俗名青蛙皮)被大理白族视为纯
天然山珍食品．云南肺衣(Lobaria yunnanensis)为肺
衣科(Lobariaeeae)肺衣属(Lobaria)地衣植物，常附
生于藓及树皮上，在外形上相似于东方肺衣、三苔色
肺衣和中华肺衣．
自由基是指能独立存在的含有 1 个或 1 个以上
的不配对电子的任何原子或原子团，是机体正常代
谢的中间产物，在机体内有很强的氧化反应能力且
易产生连锁反应，对蛋白质、核酸、脂质等产生伤害
作用，从而导致机体的损伤［4］． 大量的科学实验证
实，氧自由基与机体损伤有着非常密切的关系［5］，
生物的抗病性、抗逆性及延缓衰老与抗氧化能力密
切相关，为当前的研究热点之一．本实验所采用的材
料是来自云南大理苍山的云南肺衣，对肺衣的抗氧
化活性进行研究，有助于发现具有较好生物活性的
天然产物，对地衣植物的分类也有一定的参考价值．
目前国内还未见到用苍山云南肺衣活性物质提
取工艺优化及抗氧化研究报道．本文用回流提取法提
取植物中活性物质，采用分光光度法，用邻二氮菲 －
Fe2 +氧化法检测 H2O2 /Fe
2 +产生的羟自由基，作为评
价清除羟基自由基(·OH)的抗氧化能力，考察了提
取时间、提取温度、乙醇溶液浓度、料液比 4 个单因素
的提取液对清除羟自由基的能力，并在单因素实验基
础上进行正交实验，以云南肺衣提取物对羟自由基的
清除率为评价值，对云南肺衣抗氧化成分的提取工艺
进行优化，旨在得到最佳的抗氧化活性物的提取工
艺，对开发具有天然抗氧化功能的产品，实现云南肺
衣资源的综合利用具有重要的意义．
1 实验部分
1. 1 材料与设备
材料:云南肺衣(购于云南大理)，将肺衣洗净
去除其它附属藻类植物，自然凉干，用粉碎机打碎成
肺衣粉，封口袋密封保存．
试剂:邻二氮菲溶液、无水乙醇、氢氧化钠、磷酸
氢二钾、硫酸亚铁、pH 7. 4 磷酸缓冲溶液(PBS)、
H2O2 溶液;均为分析纯．
仪器:HH － 4 数显恒温水浴锅(会坛市富华仪
器有限公司)，9200 型紫外分光光度计(北京瑞利分
析仪器公司)，循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪
器厂)，回流装置，抽滤装置．
1. 2 实验方法
1. 2. 1 提取试剂的确定
以水、石油醚、乙醇、丙酮、乙酸乙酯做溶剂，对
云南肺衣抗氧化活性成分的提取进行了初探，其中
乙醇提取液效果较好，故选择乙醇作为提取溶剂．
1. 2. 2 云南肺衣总抗氧化活性物质的提取
准确称取肺衣粉末 2. 00 g于 50 mL具圆底烧瓶
中．加入 25. 00 mL的乙醇，采用回流提取法提取，过
滤倒入具塞锥形瓶中，以提取时乙醇浓度为溶剂，定
容至 50. 00 mL作为待测液．
1. 2. 3 云南肺衣提取物清除羟自由基的抗氧化能
力测定
根据文献［6 － 7］，PBS 试液中含 40%乙醇，其
方法为:量取 5. 00 mL PBS(50 mmol /L，下同)、2. 00
mL蒸馏水和 3. 00 mL乙醇于试管中，混匀作为空白
参比管(A空参);量取 5. 00 mL PBS、1. 00 mL 邻二
氮菲(7. 50 mmol /L，下同)、1. 00 mL FeSO4(7. 50
mmol /L，下同)、2. 00 mL 乙醇和 1. 00 mL 蒸馏水于
试管中，混匀作为未损伤管(A 未损);量取 5. 00 mL
PBS、1. 00 mL邻二氮菲、1. 00 mL FeSO4、2. 00 mL乙
醇和1. 00 mL H2O2(0. 1%)于试管中，混匀作为损
伤管(A损伤);量取 5. 00 mL PBS、1. 00 mL样品液、
2. 00 mL蒸馏水和 2. 00 mL 乙醇于试管中，混匀作
为样品参比管(A 参比);量取 5. 00 mL PBS、1. 00
mL邻二氮菲、1. 00 mL FeSO4、1. 00 mL 乙醇、1. 00
mL样品液和 1. 00 mL H2O2 于试管中，混匀作为样
品管(A样参)． 将上述试管同时置恒温水浴锅中，
37 ℃保温 60 min，于 536 nm 处测吸光度(A)值，每
管重复 3 次，取其平均值，计算对羟自由基清除率:
羟自由基 =(·OH)清除率 =
A样品 －A样参
A空白 －A样参
×100%．
2 实验结果与讨论
2. 1 云南肺衣乙醇提取物清除羟自由基抗氧化活
性单因素影响
2. 1. 1 提取时间对抗氧化活性的影响
以 60%乙醇溶液为溶剂，料液比为 1∶10，回流温
度为 60 ℃，改变提取时间，其余按 1. 2. 3 节对羟自由
基清除率的测定进行，实验结果见图 1．由图 1 可知:
·OH清除率随着回流时间的增大而增大，提取时间
为 3 h 达到最大，但提取时间超过 3 h 后清除率开始
减少，提取时间过长，溶液又有一定的温度，可能破坏
了肺衣中抗氧化物质，清除率降低，因此提取时间控
制在 3 h内较为合适．
2. 1. 2 提取温度对抗氧化活性的影响
提取条件为料液比 1∶ 10，提取时间 3 h，改变回
流温度，对羟自由基清除率的测定如前，实验结果见
图 2，由图 2 可知:清除率随回流温度的增大而增
大，提取温度 60 ℃为达到最大，但温度超过 60 ℃后
清除率开始下降，可能是活性物质在高温受损，因此
回流温度控制在 60 ℃内较为合适．
2. 1. 3 乙醇体积分数对抗氧化活性的影响
提取条件为料液比 1∶ 10，提取时间 3 h，回流温
度 60℃，改变乙醇体积分数分别为 40%、50%、
60%、70%、80%，对羟自由基清除率的测定如前，实
验结果见图 3．图 3 中可看出，清除率随乙醇体积分
数的增大而增大，体积分数在 60% ～ 70%时增加的
比较快，体积分数大于 70%后得率开始减小，故选
用乙醇体积分数为 70%比较适宜．
141第 2 期 刘满红，刘晓芳，戴建辉，等:云南肺衣中活性物质提取工艺与抗氧化性能研究
2. 1. 4 料液比对抗氧化活性的影响
提取条件:提取时间 3 h，回流温度 60℃，乙醇
浓度为 70%，改变料液比，料液比按 1∶ 5、1∶ 8、1∶ 10、
1∶15 分别提取，对羟自由基清除率的测定如前，实
验结果见表 1，由表 1 可看出，清除率在开始时随料
液比的增大而减小，因此料液比不宜过小，以 1∶5 比
较合适．
2. 2 正交实验
基于单因素实验结果，准确称取云南肺衣粉
末 2. 00 g，以不同的提取时间、温度、料液比、乙
醇体积分数作为考察的 4 个因素 ． 各取 3 个水
平，选用 L9(3
4)正交表进行实验［ 8 － 9］，以·OH
清除率为指标，研究这几个因素对羟自由基清除
率的影响，因素水平和实验结果及极差分析分别
见表 2、表 3 ．
表 1 提取料液比对云南肺衣乙醇提取物抗氧化活性的影响
料液比 /
(g·mL －1)
乙醇体积
分数 /%
温度 /
℃
提取时间 /
h
清除率 /
%
1∶5 60 60 3 95. 7
1∶8 60 60 3 48. 2
1∶10 60 60 3 29. 1
1∶15 60 60 3 9. 70
表 2 正交实验因素水平表
因素
水平
提取时间
A /h
温度
B /℃
料液比 C /
(g·mL －1)
乙醇体积
分数 D /%
1 2 50 1∶5 50
2 3 60 1∶8 60
3 4 70 1∶13 70
表 3 L9(3
4)正交实验结果及极差分析
实验
提取时间
A
温度
B
料液比
C
乙醇体积
分数D
清除率
/%
1 1 1 1 1 48. 7
2 1 2 2 2 59. 5
3 1 3 3 3 45. 2
4 2 1 2 3 80. 1
5 2 2 3 1 15. 6
6 2 3 1 2 77. 7
7 3 1 3 2 34. 8
8 3 2 1 3 92. 8
9 3 3 2 1 9. 3
Ⅰ 154. 3 163. 6 219. 2 73. 6
Ⅱ 173. 4 167. 9 148. 9 172. 0
Ⅲ 136. 9 132. 2 95. 6 218. 1
Ⅰ /3 51. 1 54. 5 73. 1 24. 5
Ⅱ /3 57. 8 56. 0 49. 6 57. 3
Ⅲ /3 45. 6 44. 1 31. 9 72. 7
极差 12. 2 11. 9 41. 2 48. 2
从极差分析结果可以看出，各因素对羟自由基
清除率影响的主次顺序为:D ＞ C ＞ A ＞ B．即乙醇体
积分数 ＞料液比 ＞提取时间 ＞提取温度，最佳提取
条件为:D3C1A2B2，即乙醇体积分数为 70%、料液比
为 1∶5、提取时间 3 h、温度 60 ℃ ．
2. 3 精密度的测定
选取正交设计分析的最佳提取工艺条件，重复
3 次实验，对羟自由基清除率如表 4．
表 4 羟自由基清除率与分析 %
No 清除率
1 96. 4
2 97. 5
3 96. 9
X 96. 9
ＲSD 0. 55
2. 4 质量浓度换算
准确量取 6 mL 提取液，置于水浴中烘干，准确
称量，得出原始提取溶液质量浓度为 0. 027 mg /mL．
2. 5 提取物对羟自由基清除能力
羟基自由基(·OH)是已知的最强的氧化剂，
具有极强的反应性．由图 4 看出，云南肺衣提取物对
·OH 清除率的上升与质量浓度的增加呈现一定的
量效关系，IC50值为 14. 7 mg /mL．
2. 6 提取物抗氧化有效成分的初步鉴定
对肺衣植物提取物进行定性预实验［10］，结果见
表 5，从表 5 可初步判断出提取物中的活性成分归
属，含有酚类、鞣质、有机酸、多糖等．
表 5 云南肺衣提取物抗氧化活性成份的初步鉴定
活性成份 鉴定方法 显色情况
酚类、鞣质 1% FeCl3 试验 溶液呈紫绿色
黄酮 盐酸 －锌粉试验 不显色
有机酸 1% 溴酚兰试验 蓝色
多糖 碘试验 蓝黑色
蒽醌 1% H3BO3 试验 无荧光
生物碱 碘 －碘化钾试验 不显色
241 云南民族大学学报(自然科学版) 第 24 卷
在定性实验检出的几种成份中，酚类、鞣质具有酚
羟基的结构，酚羟基化合物清除自由基的最主要机制
是:酚羟基与自由基反应可形成稳定半酮式自由基结
构，从而终止自由基链式反应［10 －11］．有机酸的抗氧化
化用近年来受到关注［12 －13］，它具有清除自由基、抗氧
化等作用，对其它抗氧化剂具有协同增效作用，因此肺
衣植物提取物含有的酚类、有机酸等成分构成了其抗
氧化作用的物质基础．
3 结语
研究了苍山云南肺衣乙醇提取物的抗氧化能
力，在单因素实验基础上进行正交实验，得到提取的
最佳工艺条件为:乙醇体积分数为 70%、料液比为
1∶5、温度 60 ℃、提取时间 3 h，提取物对羟自由基清
除率 96. 9%，提取物对·OH的 IC50为 14. 7 mg /mL．
肺衣中含有酚类、鞣质、多糖、有机酸．
参考文献:
［1］张海娟．五种植物的化学成分及其生物活性研究［D］．
济南:山东大学，2007．
［2］张海娟，欧扬，娄红祥．光肺衣的化学成分研究［J］．中药
材，2007，30(6):651 － 655．
［3］李波，林中文，孙汉董．针芽肺衣的化成学成［J］．云南植
物研究，1990，12(4):447 － 451．
［4］陈瑾歆，唐聪明．氧自由基的研究进展［J］．海南医学院
学报，2004，10(3):206 － 208．
［5］谭榀新，叶涛，刘湘新，等． 植物提取物抗氧化成分及机
理研究进展［J］．食品科学，2010，31(15):288 － 292．
［6］金鸣，蔡亚欣，李金荣，等． 邻二氮菲 － Fe2 +氧化法检测
H2O2 /Fe
2 +产生的羟自由基［J］． 生物化学与生物物理
进展，1996，23(6):553 － 557．
［7］郭雪峰，岳永德，孟志芬，等． 用清除羟自由基法评价竹
叶提取物抗氧化能力［J］．食品科学，2008，28(7):1578
－ 1582．
［8］贝玉祥，郭英，和万芬，等．诃子中总多酚含量的测定及其超
声提取工艺的研究［J］．生物技术，2008，18(2):82 －84．
［9］朱慧，马瑞君，吴双桃，等． 薇甘菊总黄酮的提取及清除
羟自由基活性的测定［J］．光谱学与光谱分析，2010，31
(6):70 － 73．
［10］高云涛，戴建辉，王雪梅，等．双水相分离与超声提取耦
合从冬瓜籽中提取抗氧化活性物质［J］．食品与发酵工
业，2008，34(11):180 － 184 ．
［11］杨春涛，曾晓丽，戴建辉，等．麻栎树皮多酚量的测定及
抗氧化活性的研究［J］．云南民族大学学报:自然科学
版，2014，23(6):404 － 407．
［12］MAＲKOVIC J M，IGNJATOVIC L M，MAＲKOVI D A，et
al． Antioxidative capabilities of some organic acids and
their co － pigments with malvin，Part II［J］． Journal of e-
lectroanalytical chemistry，2003，553(30) :177 － 182．
［13］杨锦华，李博，籍保平． 我国常见食用和药用植物的抗
氧化性研究［J］．食品科学，2006，27(6):87 － 90．
Extracting technology and antioxidant activities of bio － active
components from Lobaria yunnanensis
LIU Man-hong1，2，LIU Xiao-fang1，2，DAI Jian-hui1，2，YANG Hua-lun1，2，HE Xue-yang1，2
(1． Engineering Ｒesearch Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan，Yunnan Minzu University，Kunming
650500，China;2． Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Ｒesources，State Ethnic Affairs
Commission and Ministry of Education of China，Yunnan Minzu University，Kunming 650031，China)
Abstract:The extracting technology and antioxidant activities of Lobaria yunnanensis were studied． The results
showed that the optimal parameters of the extraction technology were the following:the concentration of ethanol was
70%，the ratio of the extraction sample to the solution was 1∶5，the extraction temperature was 60 ℃，the extraction
time was 3 0 h． The extraction under these conditions presented a hydroxyl free radical scavenging ratio of 96． 9% ．
IC50 of scavenging ·OH for the extracts of Lobaria yunnanensis was 14． 7 mg /mL．
Key words:Lobaria yunnanensis;extracting technology;antioxidant activity;hydroxyl free radical
(责任编辑 庄红林)
341第 2 期 刘满红，刘晓芳，戴建辉，等:云南肺衣中活性物质提取工艺与抗氧化性能研究