全 文 ：一叶秋碱诱导K562细胞凋亡
刘卫军1　顾振纶　周文轩　郭次仪
(苏州医学院药理学教研室 , 苏州　215007)
1997-11-27收稿 , 1998-03-03修回
1 中国医学科学院血液学研究所 ,天津　300020
作者简介:刘卫军 ,男 , 26岁 ,硕士;
顾振纶 ,男 ,教授 ,博士生导师
中国图书分类号　R 284.1;R 329.25;R 733.7;R 979.1
文献标识码 A　 文章编号 1001-1978(1999)02-0135-04
摘要　目的　研究一叶秋碱(SEC)能否诱导 K562 细胞凋
亡。方法　细胞增殖抑制采用 M TT 法;形态学研究采用电
子和荧光显微镜;流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
断裂。 结果　SEC 10 ～ 160 mg·L-1呈剂量依赖性抑制
K562 细胞增殖(r=0.9613 , P <0.05);SEC 作用 48 h 后 ,电
镜下可见细胞膜完整 , 核染色质边聚和凋亡小体;荧光显微
镜下核染色质凝聚成点状结构;流式细胞仪出现凋亡峰;
DNA琼脂糖凝胶电泳可见“梯状”图谱。结论　SEC 可诱导
K562 细胞调亡。
关键词　一叶秋碱;K562细胞;凋亡
　　一叶秋碱(securinine , SEC)是从大戟科植物一
叶秋〔(securinega suff ruticosa (Pall.)Rhed.)〕中提
取的生物碱 , 临床上用于再生障碍性贫血的治
疗〔1〕 ,本实验室发现 SEC 具有一定的抑瘤活性 ,且
能拮抗环磷酰胺的骨髓抑制作用〔2〕 。本文观察
SEC在体外对人白血病细胞 K562增殖的影响及能
否诱导 K562细胞凋亡
1　材料和方法
1.1　药物与试剂　SEC ,黄色粉剂 ,江苏省宜兴制
药厂提供 。无水乙醇配成 32 g·L-1储存液 , 4℃保
存 ,临用时用培养液稀释至所需浓度 ,乙醇最大体积
分数为 0.5%。四甲基偶氮唑盐(MTT), 4 , 6-二脒
基二苯基吲哚(DAPI)和碘化丙锭 (PI)均为 Sigma
产品 。
1.2　细胞培养　人白血病细胞 K562购自中国科
学院上海细胞生物所 ,用含体积分数 10%灭活小牛
血清 RPM I 1640培养基在 37℃, 0.05 CO2 条件下
培养 ,2 d传代 1次。取对数生长期细胞用于实验 。
1.3　细胞增殖抑制试验〔3〕　K562 细胞 5×108·
L-1接种于 96 孔板中 ,每孔 10 μl。各孔继加入 20
μl不同浓度 SEC , 使其终浓度为 10 , 20 , 40 , 80 及
160 mg·L-1 ,每组 6个平行孔。另设阴性对照组
(加入等量培养液)、溶剂对照组(0.5%乙醇),置
0.05 CO2 ,37℃培养 48 h 。作用结束前 4 h 加入 5 g
·L-1MTT 10μl ,继续孵育4 h后 ,加入酸化的 100 g
·L-1 SDS 100μl过夜终止反应。以 DG3022A 型酶
标仪在 570 nm 处检测吸光度值(A 值)。计算不同
浓度的 SEC 对 K562细胞的抑制率和 IC50 。
1.4　细胞形态观察
1.4.1　荧光显微镜观察〔4〕　收集不同浓度 SEC作
用 48 h后的 K562细胞 , 30 g·L-1多聚甲醛室温固
定 30 min , 10 g·L-1 Triton-X-100破膜 4 min , PBS
洗涤后 ,加入 0.5 mg·L-1 DAPI , 24℃孵育1 h后重
悬于 PBS 中 , 10 μl 滴片 ,紫外光激发观察细胞核
DNA荧光 。
1.4.2　透射电镜观察〔5〕　不同浓度 SEC作用 48 h
后的 K562细胞 40 g·L-1戊二醛前固定 ,10 g·L-1
锇酸后固定 ,常规梯度脱水 ,环氧树脂包埋 ,切片 ,染
色后透射电镜观察细胞形态 。
1.5　流式细胞仪检测细胞凋亡〔6〕　不同浓度 SEC
处理 48 h细胞 ,用体积分数为 70%冷乙醇 4℃固定
过夜 ,PI 50 mg·L-1染色 , EPICS XL 流式细胞仪进
行细胞周期分析 ,低于 G1 期 DNA 含量细胞为凋亡
细胞。
1.6　DNA抽提及电泳〔7〕　离心收集不同浓度 SEC
作用 48 h后的细胞 ,加入 DNA裂解液混匀 ,使细胞
密度为 1×1010·L-1 , 50℃水浴反应 3 h ,然后加入
125 mg·L-1RNase ,50℃水浴反应 1 h。用等体积苯
酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提 1次 ,400×g 离心
5 min ,上层水相适量移入 Eppondorf管中 ,加 DNA
上样缓冲液按4∶1比例混和 , 65℃变性 10 min ,立即
插入冰水中冷却。制备 18 g·L-1琼脂糖凝胶(含溴
化乙锭 1 mg·L-1),在TBE电泳缓冲液中电泳 2 ～ 3
h 。在紫外透射仪上观察 DNA电泳情况 。
1.7　统计处理　所有数据均以 x ±s 表示 ,两样本
均数配对 t 检验进行分析。
2　结果
2.1　SEC对 K562 细胞增殖抑制作用 　SEC 对
K562细胞体外增殖具有显著的抑制作用 ,并呈剂量
依赖性(r =0.9613 , P <0.05), IC50为 10.6 mg·
·135·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　1999 Apr;15(2):135 ～ 8
L-1(见表 1)。
Tab 1　Inhibitory effect of SEC on growth
of K562 cells in vit ro( x±s , n=6)
Dose
/mg·L-1 A value
inhibitory percentage
/ %
SEC 0 1.93±0.15
10 1.06±0.08＊＊ 44
20 0.72±0.06＊＊ 62
40 0.34±0.02＊＊ 82
80 0.23±0.06＊＊ 87
160 0.15±0.02＊＊ 93
Ethanol 0.005 1.78±0.08 8
　　＊＊P<0.01 vs SEC 0 mg·L-1
2.2　细胞形态观察 　图 1 示对照组及不同浓度
SEC作用 48 h后的 K562细胞核 DAPI 荧光染色 。
对照组细胞核均匀染色 ,呈圆形(图 1A);而 20 , 80
mg·L-1 SEC 作用 48 h 后 K562 细胞核染色质固
缩 ,呈颗粒性荧光 ,细胞核直径明显小于未处理组
(图 1 B ,C)。
　　透射电镜下 ,对照组细胞核内染色质呈不均一
分布 ,表现出肿瘤细胞特征(图 2A);而 20 ,80 mg·
L-1SEC作用 48 h 后的细胞则可见细胞膜基本完
整 ,出现凋亡性改变 。SEC 20 mg·L-1组细胞可见
核断裂 ,核染色质边聚(图 2 B);80 mg·L -1组细胞
出现膜包裹的凋亡小体(图 2 C)。
2.3　流式细胞仪鉴别凋亡细胞　由于细胞固定后
质膜通透 ,降解 DNA被释放 。DNA 组方图出现低
于 G1 期 DNA 含量的凋亡峰(Ap 峰)。SEC 40 ～
160 mg·L-1作用 24 h 后 , 开始出现 Ap峰(结果未
显示)。处理时间延长到 48 h ,从图3可见各组均出
现明显的Ap峰。说明 SEC 诱导 K562 细胞凋亡表
现出时间和剂量依赖性。
2.4　DNA凝胶电泳　如图 4所示 , SEC 作用 48 h
后 ,40 ～ 160 mg·L-1组出现典型的“梯状”图谱。
3　讨论
SEC具有中枢兴奋作用 ,对再生障碍性贫血 、
面神经麻痹等疾病有较好疗效。最近有报道该药在
体外具有抗 HSV-1 病毒效应〔8〕 。本实验室发现 ,
SEC可抑制小鼠S180实体瘤和人肿瘤细胞株
Fig 1　Fluorescence staining of K562 cells
exposed to SEC for 48 h by DAPI
A:Cont rol(×400);B:SEC 20 mg·L -1(×400);C:SEC
80 mg·L -1(×400)
Fig 2　Ultrastructral appearance of K562 cel ls treated with SEC for 48 h
A:Cont rol(×8 000);B:SEC 20 mg·L -1(×6 000);C:SEC 80 mg·L -1(×6 000)
·136· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　1999 Apr;15(2)
Fig 3　DNA content frenquence histogram of K562 cell s treated with SEC for 48 h
A:Cont rol;B:SEC 10 m g·L-1;C:SEC 20 mg·L -1;D:SEC 40 mg·L-1;E:SEC 80 mg·L -1;F:SEC 160 mg·L -1
Fig 4　Gel electrophoresis of DNA fromK562
cells treated with SEC for 48 h
1:Cont rol;2～ 7:SEC 5 , 10 , 20 , 40 , 80 , 160 mg·L-1
K562 、SHG-44和 HOS-8603的体内生长 ,表明其具
有一定的抑瘤活性〔2〕 。本文结果进一步表明 , SEC
不仅抑制 K562 细胞增殖 , 还可诱导 K562 细胞凋
亡。
　　化疗药物诱导凋亡的机制还不明了 。各种不同
作用靶点的抗肿瘤药物均可诱导肿瘤细胞凋亡。原
癌基因如 p53 、c-myc、bcl-2是主要的凋亡调控基因 。
有人认为化疗药物或其他因素作为第一信号 ,通过
现在仍不清楚的传导机制引起第二信号如 cAMP 、
Ca2+升高 ,最终导致核酸内切酶活化是各种外界信
号诱导细胞凋亡的共同通路〔9〕 。SEC 对凋亡相关
基因表达和信号传导通路的影响值得进一步研究 ,
从而阐明其诱导 K562细胞凋亡的机制 。
参考文献
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Securinine induced apoptosis in K562 cells
LIU Wei-Jun1 , GU Zhen-Lun , CHOU Wen-Xuan , GUO Ci-Yi
(Dept of Pharmacology , Suzhou Medical College , Suzhou　215007)
ABSTRACT　AIM 　To study whether securinine ( SEC ) could induce apoptosis in K562 cells.
·137·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　1999 Apr;15(2)
肿瘤坏死因子对溶血卵磷脂引起脑微血管平滑
肌细胞增殖的影响及药物的保护作用＊
李　菲　储智勇　芮耀诚
(第二军医大学药学院药理学教研室 , 上海　200433)
中国图书分类号　R 322.74;R 322.81;R 730.3;R 543.5;
R 971
文献标识码 A　 文章编号 1001-1978(1999)02-0138-03
摘要　目的　研究肿瘤坏死因子(TNF-α)对溶血卵磷脂
(LPC)引起脑微血管平滑肌细胞(SMC)增殖的影响及维生
素 E(Vit E),普罗布考(PRB)的保护作用。方法　用结晶紫
染色测定密度(OD)值的方法观察 TNF-α对 LPC 引起牛脑
微血管平滑肌细胞(BCMSMC)增殖作用的影响。结果　
TNF-α在 2.5×104 ～ 1×105 U·L -1范围内能协同 LPC 引起
BCMSMC 增殖 , 8 h时增殖率就明显增加 , 16 h 增殖率达峰
值(67.2%)。 Vit E 20 , 50 , 100 μmo l·L-1 , PRB 10 , 20 , 50
μmol·L-1呈剂量依赖性地显著降低其增殖率 , 其最大抑制
率分别为 74.2%和 49.7%。结论　TNF-α对 LPC 引起的
BCMSMC 增殖有协同作用 ,药物 Vit E , PRB 可拮抗其增殖
作用。
关键词　肿瘤坏死因子;溶血卵磷脂;维生素 E;普罗布考;
平滑肌细胞;脑微血管;细胞培养
　　SMC 增生是动脉粥样硬化(AS)病变发生发展
过程中的重要环节。溶血卵磷脂(LPC)是氧化低密
度脂蛋白(OX-LDL)的主要成分 ,近年来多被用来
1998-02-10收稿 , 1998-07-02再修回
＊国家自然基金资助项目 , No 39670832
作者简介:李　菲 ,女 , 42岁 ,副主任药师;
芮耀诚 ,女 ,教授 ,博士生导师 ,中国药学会常务理事 ,中国
药理学会心血管专业委员会常委 ,国家新药评审委员会委
员 ,研究方向:心脑血管药理
研究其在 AS 中的作用。自 80 年代末 Steinberg
等〔1 , 2〕提出了 OX-LDL引起动脉脂质沉着 ,导致 AS
学说以来 ,此学说得到了日益广泛的重视和大量实
验资料的证实和支持。已有资料表明 , TNF-α是在
AS 斑块的 SMC 中发现的诸多细胞因子之一。
SMC及内皮细胞(EC),巨噬细胞均可氧化修饰体
内胆固醇的主要携带者低密度脂蛋白(LDL)为 OX-
LDL ,而 OX-LDL 可刺激血管 SMC , EC ,巨噬细胞
及 T 淋巴细胞等分泌趋化因子〔3〕 , 了解 TNF 与
LPC在 AS 发病机制中的相互关系 ,对深入了解 AS
的发病机制 ,从而寻找新的防治药物具有十分重要
的意义 。
TNF-α与 LPC 引起 BCMSMC增殖间的关系还
未见报道。本文在建立 LPC引起 BCMSMC增殖模
型的〔4〕基础上进一步考察了 TNF-α对其的影响及
Vit E , PRB 的拮抗作用 。
1　材料和方法
1.1　药品和试剂　PRB 为美国 Sigma产品;Vit E
由上海绿源实业有限公司提供;TNF-α由日本
Dainippon 制药公司 Kitaura 博士惠赠;LPC 为美
Sigma产品;Eagles MEM 培养基为 Gibco 产品;小
牛血清为杭州四季青生物材料研究所产品;结晶紫
为上海远航化工厂产品;其它试剂均为市售。
1.2　细胞培养　参照我室建立的方法〔5〕 ,取新生
小牛大脑皮层灰质部分 ,去软脑膜 ,用 D-Hanks洗
涤 4次 ,置玻璃匀浆器中 ,电动匀浆 20次 ,匀浆液用
METHODS　Cell inhibitory effect w as assessed by
M T T assay;Morphological assessment of apoptosis
w as performed wi th transmission electron microscopy
and fluorescence microscopy ;DNA fragmentation w as
determined by flow cy tometry and agarose gel elec-
trophoresis of DNA.RESULTS　The proliferat ion of
K562 cells w as inhibited by SEC in a dose-dependent
manner(r=0.9613 , P <0.05).Electron t ransmis-
sion microscopy of K562 cells t reated w ith SEC for 48
h showed characteristic chromatin condension , nucle-
ar f ragmentation and “apoptotic bodies” .Under the
f luo rescence microscopy , condensed chromatin stained
by DAPI formed “dot ted” chromatin.The apoptotic
peaks were found by flow cy tometry .Agarose gel
elect rophoresis of DNA from cells treated with SEC
fo r 48 h revealed “ ladder” pattern.CONCLUSION　
SEC may induce apoptosis in K562 cells.
KEY WORDS　securinine;K562 cells;apoptosis
1Institute of Hematology , Chinese Academy of medical
Science and Peking Union Medical college , Tianjin　300020
·138· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　1999 Apr;15(2):138～ 40