全 文 ：王不留行抑制血管形成作用的研究
冯　磊 1 ,花　慧 1 ,邱丽颖 1 ,张莲芬 2 ,金　坚 2＊
(江南大学 1.医药学院天然药物研究室;2.工业生物技术教育部重点实验室 ,江苏 无锡 214122)
　　摘要　目的:探讨王不留行对血管生成的抑制作用。方法:采用 MTT法及 Matrigelplug法测定王不留行提取
物对人血管内皮细胞(HMEC)增殖 、迁移及小管形成的影响。结果:王不留行提取物可显著抑制 HMEC细胞的体
外增殖(IC50为 50 μg/mL)与迁移 ,并呈明显的量效关系 ,同时还能抑制 Matrigelplug模型中的血管新生。结论:王
不留行提取物能显著抑制血管生成 , 有可能成为一种有效的血管生成抑制剂。
关键词　王不留行;血管生成;Matrigelplug方法
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)08-1256-04
StudyonAntiangiogenesisEffectofVaccariasegetalis
FENGLei1 , HUAHui1 , QIULi-ying1 , ZHANGLian-fen2 , JINJian2＊
(1.LaboratoryofNaturalMedicine;2.TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology, MinistryofEducation, JiangnanUniversity, Wuxi
214122, China)
Abstract　Objective:TostudytheinhibitingeffectofVaccariasegetalisextractsonneovascularization.Methods:TheefectofVac-
cariasegetalisextractsontheproliferation、migrationinvitroandtubeformationonMatrigelofendothelialcell(HMEC)invivowereex-
aminedbyMTTassayandMatrigelplugassay.Results:TheproliferationandmigrationofHMECwereinhibitedsignificantlybyVaccar-
iasegetalisextractsinadose-dependentmanner(IC50 =50 μg/mL).ItalsoinhibitedangiogenesisinMatrigelplugmouse
model.Conclusion:Vaccariasegetalisextractscaninhibitangiogenensisobviously, anditcouldbedevelopedasaneffectiveantiangio-
genicdrug.
Keywords　Vaccariasegetalis(Neck)Garche.;Angiogenensis;Matrigelplugassay
收稿日期:2008-10-07基金项目:国家自然科学基金(30772586)作者简介:冯磊(1974-),男 ,副教授 ,博士 ,主要从事天然药物的研究与开发;E-mail:feng2000lei@yahoo.com.cn。＊通讯作者:金坚 , E-mail:jinjian31@ 126.com。
　　侵袭性 、转移性及异常增长是肿瘤细胞生物学
特性中最为关键的内容 ,已有的研究认为其与肿瘤
的血管生成密切相关。新生成的血管可以把肿瘤和
人体的循环系统连接起来 ,使得供肿瘤生长的营养
物质得以交换 ,并促使肿瘤细胞输送 、转移至其它组
织。因此 ,抗血管生成已经成为肿瘤治疗的重要手
段之一〔1-4〕。
王不留行为石竹科麦蓝菜 [ Vaccariasegetalis
(Neck)Garche.]的种子 ,味苦 ,性平 ,入肝 、胃经 ,有
行血通经 、催生下乳 、消肿敛疮等功效 ,可治疗多种
妇科疾病 ,对妇女闭经 、乳汁不通 、难产以及血淋 、痈
肿 、金疮出血等有良好的疗效 。其植物资源丰富 ,尤
以河北产量最大。王不留行中主要含有黄酮苷 、环
肽 、三萜皂苷 、类脂及脂肪酸 、单糖等化合物〔5-8〕。本
实验对王不留行的抗血管生成作用进行了初步研究。
1　材料与仪器
1.1　实验动物　8周龄雌性裸鼠(SwissNude),体
质量 18 ～ 20 g,购于中国科学院动物所。实验动物
使用许可证:SYXK(苏)2007-0003。
1.2　实验细胞系　SV40病毒转染的人脐静脉内
皮细胞传代株(HMEC),法国国家卫生医学研究院
U553研究所(INSERMU553)陆核教授馈赠。
1.3　药品与试剂　王不留行 、甘草药材购自江苏
省无锡市山禾药业股份有限公司 ,经南京中医药大
学陈健伟教授鉴定为正品 。表皮生长因子(EGF)、
MTT、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Matrigel胶
(Sigma公司), MCDB-131细胞培养基(GibcoBRL
公司),胰酶 、小牛血清 、L-谷氨酰胺(华美生物工程
公司),其他试剂均为国产分析纯。
1.4　主要仪器　Model3110细胞培养箱(Thermo-
Form公司), MK3型酶标仪 (Thermo-Labsystems公
司), BX-40光学显微镜(Olympus公司)。
2　方法
2.1　王不留行提取物的制备　王不留行药材用水
煎煮提取 2次(1.5、1 h),合并提取液过滤 ,减压浓
缩成浸膏 ,经冷冻干燥后得到王不留行提取物粉末 。
同法制备甘草提取物 。
2.2　细胞培养　MCDB-131细胞培养基 、1 μg/mL
氢化可的松 、 10 ng/mLEGF、 15%小牛血清和
0.01%L-谷氨酰胺配制成 MCDB-131培养液。培养
·1256· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 8期 2009年 8月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.08.052
的细胞株置于 37 ℃、5%CO2 、饱和湿度下常规培养
传代 ,观察细胞生长状况并确保细胞生长良好。实
验均用处于对数生长期的细胞。
2.3　细胞增殖抑制实验(MTT法)　用 0.25%胰
酶将细胞消化并制成单细胞悬液 ,以 6 ×103 ～ 7 ×
10
3 /孔接种于 96板 , 37 ℃、5% CO2过夜 ,加入不同
浓度的样品溶液 ,分别以单纯的培养液与未经药物
作用的细胞作为空白对照和阴性对照 ,每组设 8个
复孔 ,继续培养 48 h。每孔加 MTT(5 mg/mL)20
μL,继续培养 4 h,弃上清液 ,每孔加 DMSO150 μL,
37 ℃孵育 10 min,酶标仪检测 570 nm波长处的光
密度 D(λ)值 ,并计算平均抑制率 。
抑制率(%)=D(λ)阴性对照 -D(λ)实验样品D(λ)阴性对照 -D(λ)空白对照 ×100%
2.4　人血管内皮细胞迁移能力的抑制实验　将 24
孔板呈 60°倾斜 ,在每孔底部的 1/2处加 1%琼脂
糖 ,待凝固后用培养基洗涤 ,无琼脂糖的一侧加
HMEC,每孔 1 ×105个细胞。细胞贴壁后分别加生
理盐水及不同质量浓度(10 ～ 50 μg/mL)的王不留
行提取物 ,培养 72 h后用倒置显微镜观察并拍照记
录 ,观察不同质量浓度的药物对 HMEC细胞向琼脂
糖一侧迁移的影响 。
2.5　体内 Matrigelplug法血管抑制实验　参考文
献方法〔9〕 ,取 4 ℃下液态 Matrigel胶 300 μL分别腹
侧皮下注射入 8周龄雌性裸鼠后 ,动物随机分为:空
白对照组(等容积 2%葡萄糖水溶液)、模型组(bF-
GF0.1 μg)、甘草提取物组(bFGF0.1 μg+1 g/mL
甘草提取物 0.1 mL)、王不留行提取物组(bFGF0.1
μg+1 g/mL王不留行提取物 0.1 mL),每组 5只 ,
分别灌胃给予相应药物。 7 d后处死小鼠 ,取出 Ma-
trigel小包 ,乙醇固定 ,石蜡包埋切片并做 PECAM-1
血管内皮细胞免疫组化 ,显微镜下摄片(×200),计
算在 1个视野内迁移入 Matrigel小包血管的数量 。
2.6　统计学处理　采用 SPSS11.0统计软件进行
分析 。
3　结果
3.1　王不留行提取物对人血管内皮细胞增殖的影
响　王不留行提取物在体外对人血管内皮细胞增殖
有显著的抑制作用 ,其半数抑制量为 50 μg/mL,且
其抑制作用呈剂量依赖性。见图 1。
3.2　王不留行提取物对内皮细胞迁移的影响　空
白对照组的内皮细胞向琼脂糖层迁移数量较多 ,而
王不留行提取物干预后 ,细胞迁移数显著减少 ,且呈
剂量依赖性 ,表明王不留行提取物有抑制血管内皮
细胞迁移的作用。见图 2。
图 1　王不留行提取物对人血管内
皮细胞(HMEC)增殖的影响
图 2　王不留行提取物对内皮细胞 HMEC迁移的影响
3.3　王不留行提取物对 Matrigel小包内血管生成的
影响　bFGF能够诱导 Matrigel小包形成丰富的微血
管 ,甘草提取物对此种 bFGF刺激形成的血管生长无
明显影响 ,而王不留行提取物能显著减少侵入 Matri-
gel小包的内皮细胞数量 ,显著抑制 Matrigel小包的微
血管生成。见图 3及表 1。
　表 1　　　　王不留行提取物对 Matrigel小包
内血管生成的影响( x±s, n=5)
　　　组别 血管生成指数
空白对照组 2.5±1.4
模型组 31.6±8.3
甘草提取物组 29.1±1.8
王不留行提取物组 9.6±3.3＊
　　注:与模型组比较 , ＊P <0.05
·1257·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 8期 2009年 8月
图 3　王不留行提取物对 Matrigel小
包内血管生成的影响(×200)
4　讨论
血管新生与实体瘤的发生 、转移有着密切的关
系。以新生血管为靶点的血管生成抑制剂已成为当
今国内外新型抗肿瘤药物研究最活跃的领域之一。
与直接杀伤肿瘤细胞的常规化疗药物相比 ,血管生
成抑制剂的最大优点是抗瘤谱广 、不易产生耐药性 ,
对各种实体瘤均有效。研发血管生成抑制剂已引起
各国制药业的激烈竞争。目前开发的血管抑制剂
Angiostatin、Endostatin等存在着不能口服 ,有效剂量
大 ,治疗费用昂贵的缺点 ,难以广泛应用于临床。目
前该领域的新药研究应着重于解决口服有效 、无毒 、
价廉等关键问题。
王不留行是妇科常用药 ,具有通经行血 、催乳的
功效 ,目前未见国内外学者对王不留行抑制血管生
成作用进行相关报道。本实验对王不留行对人血管
内皮细胞的增殖 、迁移 、血管形成等血管生成过程的
影响进行了探讨。
血管内皮细胞的持续性增殖和迁移是血管生成
的首要步骤 ,同时血管内皮细胞也可分泌血管生长
因子促进血管内皮细胞自身乃至肿瘤细胞的增殖 ,
对血管内皮细胞的抑制可抑制肿瘤细胞的增殖 ,增
加转移肿瘤细胞的凋亡 ,故以增殖和迁移中的血管
内皮细胞为靶点的抗血管生成疗法是令人满意的肿
瘤治疗手段之一。笔者研究发现 ,王不留行提取物
在体外低浓度下(<100 μg/mL)对 HMEC细胞的增
殖和迁移表现出明显的抑制作用 ,并呈现量效关系 ,
IC50为 50 μg/mL。在 30 μg/mL的浓度下 , HMEC
细胞向琼脂糖层的迁移数目很少 ,迁移行为几乎完
全被阻断 ,提示抑制内皮细胞增殖和迁移是王不留
行提取物抗血管生成的重要机制。目前认为 ,肿瘤
细胞 、肿瘤浸润的巨噬细胞及肥大细胞能分泌大量
促进血管生长的血管生长因子 ,以旁分泌效应的形
式刺激肿瘤血管内皮细胞 ,促进内皮细胞增殖和迁
移 ,使肿瘤形成新的血管而快速生长 ,并提高血管通
透性 ,引起周围组织纤维蛋白沉着 ,促进单核细胞 、
成纤维细胞和内皮细胞的浸润 ,有利于肿瘤基质形
成及肿瘤细胞进入新生血管 ,促进肿瘤转移 〔10〕。据
文献报道甘草有较好的抗肿瘤效果 ,但其作用机制
与抑制肿瘤新生血管无关 ,而是直接针对肿瘤细胞
作用〔11-13〕 ,故本实验在进行小鼠体内 Matrigelplug
法实验时 ,以甘草提取物为对照组来对比观察分析
王不留行对血管生成的影响 ,实验结果表明甘草提
取物确实对体内 matrigel小管形成的影响不明显 ,
而王不留行提取物在体内对 bFGF刺激引起的内皮
细胞管状结构的形成有明显的抑制作用 ,能够阻断
bFGF刺激血管新生的信号途径 ,拮抗由 bFGF诱导
的血管新生 ,这可能是王不留行抗血管生成的机制
之一。
王不留行的抗血管生成作用是多方面 、多途径
的 ,不仅能抑制 HMEC内皮细胞的增殖 、迁移 ,还能
抑制血管生长因子诱导的血管样结构形成 ,故王不
留行具有开发为抑制血管生成药物的前景 。
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黄芩苷 、小檗碱及黄芪多糖对醛糖还原酶
的体外作用及合并效应研究
杨红舟 1 ,周明眉 1 ,赵爱华 2 ,邢淑宁 1 ,范自全 1 ,贾　伟 1
(1.上海中医药大学 /中医方证与系统生物学中心 ,上海 201203;2.上海交通大学药学院 ,上海 200240)
　　摘要　目的:建立醛糖还原酶(AldoseReductase, AR)抑制剂的体外筛选模型 , 考察黄芩苷 、小檗碱及黄芪多糖
对 AR的体外抑制作用及三者配伍的合并效应。方法:测定不同质量浓度的黄芩苷 、小檗碱 、黄芪多糖以及阳性对
照药(依帕司他)对 AR的抑制率;结合正交 t值法评价 3种药物配伍后对 AR作用的合并效应。结果:300 μg/mL
的黄芩苷和小檗碱对 AR的抑制率分别为(88.4±7.4)%、(69.0±9.4)%, 二者合用时对 AR的抑制作用表现为拮
抗;黄芪多糖则无 AR抑制活性。结论:黄芩苷 、小檗碱体外能显著抑制 AR的活性 , 是良好的醛糖还原酶抑制剂。
关键词　醛糖还原酶;黄芩苷;小檗碱;黄芪多糖;合并效应;正交 t值法
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)08-1259-03
StudyonEfectsofBaicalin, BerberineandAstragalusPolysaccharides
andTheirCombinativeEfectsonAldoseReductaseinvitro
YANGHong-zhou1 , ZHOUMing-mei1 , ZHAOAi-hua2 , XINGShu-ning1 , FANZi-quan1 , JIAWei1
(1.CenterforChineseMedicalTherapyandSystemsBiology, ShanghaiUniversityofTCM, Shanghai201203, China;2.SchoolofPhar-
macy, ShanghaiJiaoTongUniversity, Shanghai200240, China)
Absrtact　Objective:Toobservetheactivitiesofbaicalin, berberineandAstragaluspolysaccharidesandtheircombinativeeffects
onaldosereductase(AR)byascreeningmodelofaldosereductaseinhibitor(ARI)invitro.Methods:TheinhibitionofARbybaica-
lin, berberineandAstragaluspolysaccharidesandpositivedrug(Epalrestat)indifferentconcentrationswereevaluated, andtheircom-
binativeefectswerestudiedaccordingtoorthogonaltdesign.Results:BaicalinandberberinehadremarkableinhibitoryeffectsonAR,
theinhibitoryrateswere(88.4±7.4)% and(69.0±9.4)% attheconcentrationof300μg/mL.However, thecombinativeeffectof
theinhibitiononARbythetwocompoundswasantagonisticaction.AstragaluspolysaccharideshadnoactivityofinhibitiononAR.
Conclusion:BaicalinandberberinearethepotentialARinhibitorsastheycaninhibittheactivityofARinvitro.
Keywords　Aldosereductase;Baicalin;Berberine;Astragaluspolysaccharides;Combinativeefects;Orthogonaltdesign
收稿日期:2008-08-12基金项目:上海市科委中药现代化招标项目(06DZ19713),上海市科委创新团队项目(06DZ05906)作者简介:杨红舟(1983-),男 ,硕士研究生 ,主要从事糖尿病中药新药的研究开发。＊通讯作者:周明眉 , Tel:021-51322642, E-mail:mingmei zhou@yahoo.com.cn。
　　黄芩 、黄连和黄芪是治疗糖尿病的常用中药 ,大
量研究表明其主要有效成分黄芩苷 、小檗碱及黄芪
多糖能有效治疗糖尿病及其并发症 〔1-3〕。本研究通
过建立与糖尿病并发症密切相关的醛糖还原酶抑制
剂(aldosereductaseinhibitor, ARI)体外筛选模型 ,评
价黄芩苷 、小檗碱及黄芪多糖在体外对醛糖还原酶
(aldosereductase, AR)的抑制作用 ,并结合正交 t值
法 〔4, 5〕考察三者在体外抑制 AR的合并效应 ,探讨黄
·1259·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 8期 2009年 8月