全 文 ：东南大学学报 (医学版 )JSoutheastUniv(MedSciEdi)　2009, Aug;28(4):302-306
　　[作者简介 ] 黄丹丹(1981-),女 ,江西丰城人 ,在读硕士研究生。 E-mail:dora002374@ 126.com
　　[通讯作者 ] 张伟云 　E-mail:zhangwy@nju.edu.cn
垂盆草醇提物对人肝癌细胞 HepG2的
抑制作用及其机制初探
黄丹丹 ,张伟云
(南京大学医学院 江苏省分子医学重点实验室 ,江苏 南京　210093)
[摘要 ] 目的:观察垂盆草醇提物(CCW)对人肝癌细胞 HepG2生长及其肿瘤相关分子指标的影响。方法:MTT法测定 CCW
对 HepG2细胞增殖的作用;流式细胞术观察细胞周期的改变;分别用 RT-PCR及免疫细胞化学法检测 CCW对 VEGF、c-Myc基
因及蛋白水平的影响。结果:HepG2细胞的增殖在 CCW作用的第 24、48和 72 h均被显著地抑制;CCW(100、200 μg·ml-1)可
使 HepG2细胞阻滞于 G0 /G1期;CCW可显著下调 VEGF、c-Myc的 mRNA及蛋白水平的表达。结论:CCW对 HepG2细胞增殖
具有明显的抑制作用 , 并且能阻止细胞进入 G2 /M期 , 这可能与 c-Myc基因表达的下调密切相关;CCW能抑制 HepG2细胞的
VEGF分泌 ,初步推测 CCW具有抗血管生成作用。
[关键词 ] 垂盆草;肝癌;抗增殖;细胞周期;抗血管生成
[中图分类号 ] R285.5;R735.7　　[文献标识码 ] A　　[文章编号 ] 1671-6264(2009)04-0302-05
　　垂盆草(SedumsarmentosumBunge)又称卧茎景
天 ,系景天科多年生草本植物 ,分布于全国大部分地
区 。垂盆草主要含有垂盆草苷类 、黄酮类 、三萜类 、甾
醇 、生物碱及糖类 。此药性凉 ,味甘 、淡 ,新鲜或干燥全
草入药 ,主要用于治疗湿热黄疽 、小便不利 、痈肿疮疡 ,
并且具有抑制炎性渗出 ,减少肝细胞损伤 ,降低血清丙
基酸氨基转移酶水平 ,治疗急 、慢性肝炎等功效 [ 1] 。
近年来 ,国内外大量研究表明 ,慢性病毒性肝炎与肝癌
(hepatocelularcarcinoma)的发生有着密切的联系[ 2-3] ,
一些传统中草药中的黄酮 、生物碱及多糖等成分在抗
肿瘤 、延长患者生命等方面有着独特的生物活性 ,不仅
能够抑制肿瘤细胞增殖 ,还能有效抑制血管内皮生长
因子(vascularendothelialgrowthfactor, VEGF)和原癌
基因 c-Myc的表达 [ 4-7] ,而 VEGF和 c-Myc在肝癌的形
成 、生长 、浸润 、转移过程中均发挥着重要的作用 [ 8] 。
因此 ,本研究着重观察垂盆草醇提物(CCW)对人肝癌
细胞 HepG2生长及肿瘤相关基因 VEGF和 c-Myc表
达的影响。
1　材料与方法
1.1　材料　
垂盆草购于江苏省药材公司。 MTT、蛋白酶(Sig-
ma公司), RPMI1640培养基(Invitrogen公司),小牛
血清(杭州四季青生物工程材料有限公司), Biozol
RNA提取剂 (BioFlux公司), M-MLV酶 、TaqDNA聚
合酶(Promega公司), VEGF、c-Myc和 β-actin引物由
InvitrogenBiotechnologyCo., Ltd.(上海)合成 ,兔抗人
VEGF、c-Myc抗体 、生物素化羊抗兔 IgG、SABC试剂
盒 、DAB检验试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公
司),其余试剂均为国产分析纯 。 CO2培养箱 MCO-
15AC(Sanyo公司),真空冷冻干燥机 (MatinChrist公
司),酶标仪(Bio-Tek公司), PTC-200PCR仪(Bio-Rad
公司), GelDocEQ图像分析仪(Bio-Rad公司), FACS
Calibur流式细胞仪 (Becton-Dickson公司)。
1.2　方法
1.2.1　垂盆草醇提物的制备　垂盆草干草 500 g,于
95%的乙醇 5 000 ml中浸泡 5d,纱布过滤 ,收集药液。
重复 2次 ,合并药液 ,离心取上清 ,所得上清液经减压
蒸发挥去溶剂 ,再用石油醚经索氏提取法去除脂类 ,挥
去石油醚 ,再用甲醇溶解 ,减压蒸干得醇提物。
1.2.2　细胞培养　人肝癌细胞 HepG2于含 10%小牛
血清 、青霉素 100 U·ml-1、链霉素 150 μg·ml-1的 RP-
MI1640培养液 ,在 37 ℃、5%CO2培养箱中培养。
1.2.3　细胞增殖能力的检测　将肿瘤细胞培养至对
数生长期 ,计数 ,调整细胞浓度为 1×105ml-1 ,接种于
96孔板 , 80μl·孔 -1 , 3 h贴壁后加入终质量浓度分别
为 25、50、100、200 μg·ml-1的 CCW,同时设 0.1 %
DMSO对照组 ,每组设 6个平行孔 ,将培养板置 5%
CO2 、37 ℃培养箱中培养 24、 48、 72 h后 MTT法
检测[ 9] 。
·302·
1.2.4　流式细胞术检测细胞周期　取对数生长期细
胞调成浓度为 2×105 ml-1 , 300 μl·孔 -1接种于 24孔
培养板中 ,细胞贴壁后加入质量浓度分别为 50、100、
200μg·ml-1的 CCW,对照组加含 0.1%DMSO的同体
积培养液 ,设 4个复孔 。分别收集对照组和醇提物各
剂量作用 48 h后的 HepG2细胞 1×106个 , 70 %乙醇
4 ℃固定过夜 , PBS清洗 ,加入含 2 %Triton-X100、50
μg·ml-1 RNaseA的 PI溶液 , 4℃避光染色 30min, 上
机检测 2 ×104 个细胞 , 用 WinMDI分析软件分析
结果。
1.2.5　RT-PCR检测肝癌细胞的 VEGF和 c-Myc的
mRNA水平　用 Biozol试剂分别提取各组 HepG2细
胞的总 RNA,得到白色沉淀 ,加入 1‰DEPC水 30 μl
至 RNA完全溶解并测定 RNA的浓度和纯度 。取各组
总 RNA各 2μg分别进行逆转录合成 cDNA。 PCR反
应体系总体积为 25 μl,其中含 cDNA1 μl, 10×bufer
2.5 μl、MgCl2 (25 mmol·L-1)2 μl、dNTP(10 mmol·
L-1)0.4μl、引物 0.8 μl、TaqDNA聚合酶(1 U·L-1)
1 μl。VEGF、c-Myc和内参 β-actin基因引物序列分别
参照有关文献 [ 10-12] 。 94 ℃预变性 5 min;然后 94 ℃
30 s变性 、58 ℃ 40s退火 、72 ℃ 30 s延伸 ,共 30个循
环;最后 72℃延伸 7 min。 1.5%琼脂糖凝胶电泳 ,凝
胶成像分析仪分析结果。
1.2.6　免疫细胞化学法检测 VEGF、c-Myc蛋白表达
　将 HepG2细胞贴壁于预先置于 6孔板的盖玻片上 ,
加入不同质量浓度(25、50、100、200 μg·ml-1)CCW,
用含 0.1 %DMSO的培养液作为对照 , 37 ℃、5%CO2
培养 48 h后取出玻片 , PBS清洗标本 2次 , 80%丙酮
醇 4 ℃固定 15 min,染色步骤按 SABC试剂盒说明书
操作 , PBS代替一抗作阴性对照。染色结果以细胞浆
或核出现棕黄色高出背景的细胞为阳性细胞 ,每组随
机选取 10个高倍视野 ,计算每组的阳性细胞率(阳性
细胞数占视野内总细胞数的百分比)。
1.3　统计学处理　
采用 SPSS10.0软件进行统计学分析 ,实验数据以
x- ±s表示 , F检验方差齐性后 t检验进行组间比较 ,
P<0.05为差异具有统计学意义。
2　结　　果
2.1　CCW对 HepG2细胞增殖的影响
CCW对 HepG2的增殖抑制效果随着药物作用时
间的延长而逐渐增强 ,在作用 24 h和 48 h后 ,最高浓
度组抑制作用具有统计学意义(P<0.05),随着药物
作用时间的增加 ,在 72 h各浓度组均有明显的抑制增
殖作用(P<0.001)。见表 1。
表 1　CCW对肝癌细胞 HepG2增殖的影响
Tab1　InhibitoryefectsofCCWontheproliferation
ofHepG2cels
CCW剂量 /
(μg·ml-1)
吸光值
24h 48h 72 h
0 0.339 7±0.030 8 0.516 7±0.035 6 0.839 4±0.026 1
25 0.313 8±0.025 7 0.510 8±0.031 5 0.745 5±0.020 82)
50 0.310 4±0.008 7 0.508 0±0.017 0 0.682 3±0.025 62)
100 0.301 0±0.003 8 0.497 6±0.031 2 0.676 4±0.060 92)
200 0.297 8±0.020 51) 0.445 8±0.04521) 0.673 8±0.036 82)
　　与对照组比较 , 1)P<0.05, 2)P<0.001
2.2　CCW对肝癌细胞增殖周期的影响
CCW作用于 HepG2细胞 48 h后 , PI单染后经流
式细胞仪进行细胞周期分析(图 1)。结果显示 , 100、
200μg·ml-1CCW能够有效阻滞肿瘤细胞于 G0 /G1期
[分别为(67.39±1.97)%、(70.45±1.23)%] ,降低
进入 G2 /M期细胞的数量 [分别为(15.46±2.7)%、
(14.20±1.41)%] ,与对照组 [ G0 /G1期为 (60.37±
2.7)%、G2 /M期(20.45±2.32)%]相比 ,差异具有统
计学意义(100 μg·ml-1 , P<0.05;200 μg·ml-1 , P<
0.01。n=4)。
2.3　CCW对 HepG2细胞 VEGF、c-MycmRNA表
达的影响
采用 RT-PCR法检测 VEGF、c-Myc的 mRNA表
达 ,经扩增的产物 VEGF、c-Myc和 β-actin的相对分子
质量分别为 212、200和 389bp(图 2A),与内参 β-actin
相比 ,各组相对光密度比值见图 2B, 100、200 μg·ml-1
CCW处理组 VEGFmRNA表达较对照组均明显降低 ,
均具有统计学意义 (100 μg·ml-1 , P<0.01;200 μg·
ml-1 , P<0.001)。 100、200 μg·ml-1 CCW处理组 c-
MycmRNA表达较对照组明显降低 ,均具有统计学意
义(100 μg·ml-1 , P<0.05;200μg·ml-1 , P<0.001)。
2.4　CCW对 VEGF和 c-Myc蛋白表达的影响
细胞浆或核有棕黄色或棕褐色颗粒着色为阳性特
征 。未加药对照组细胞中表达较强 , VEGF和 c-Myc
阳性细胞率分别为 (35.78 ±3.90)%和 (43.21 ±
8.37)%。在质量浓度 100、200 μg·ml-1的 CCW作用
48 h后 , VEGF阳性细胞率分别为(24.15±1.93)%和
(14.48±2.83)%, c-Myc阳性细胞率分别为(28.67±
5.65)%和(27.99±3.34)%,与对照组相比 ,均具有
统计学意义(P<0.001)。见图 3。
·303·黄丹丹 ,等.垂盆草醇提物对人肝癌细胞 HepG2的抑制作用及其机制初探
3　讨　　论
近年来 ,从祖国传统医药宝库中发掘新的抗癌药
物已经成为肿瘤治疗的研究热点之一 ,并且这些新的
抗癌药物在临床中的应用也取得了可喜的进展 。垂盆
草作为一种重要的药用植物资源 ,在民间被用于治疗
咽喉肿痛 、水火烫伤 、蛇虫咬伤等已有多年的历史 ,此
外 ,据文献报道垂盆草还具有免疫抑制作用[ 13] 、雌激
素样作用 [ 14] 、血管紧张素转化酶抑制作用 [ 15] 等 , 然
而 ,它最重要的一个功效就是能够降低血清丙氨酸氨
基转移酶水平 ,抑制炎性渗出 ,减少肝细胞的损伤 ,所
以在临床上被广泛用于治疗各型慢性病毒性肝炎[ 16] 。
众所周知 ,慢性病毒性肝炎是肝癌发生的重要危险因
素 [ 17] ,鉴于慢性病毒性肝炎与肝癌的密切关系以及垂
盆草在治疗慢性病毒性肝炎中的疗效 ,本实验采用垂
盆草醇提物对肝癌细胞 HepG2进行干预 ,结果显示
·304· 东南大学学报(医学版)　2009年 8月 , 28(4)
CCW可明显阻止细胞进入 G2 /M期 ,使其停留在静止 期 ,抑制 HepG2的生长 。
A～ E.CCW作用质量浓度分别为 0、25、50、100、200μg·ml-1时 VEGF的表达;
F～ J.CCW作用质量浓度分别为 0、25、50、100、200 μg·ml-1时 c-Myc的表达
图 3　免疫细胞化学检测 HepG2细胞 VEGF和 c-Myc蛋白的表达　×200
Fig3　ImmunocytochemicaldetectionofVEGFandc-MycinHepG2 cels(×200)
　　c-Myc作为一种广泛存在的转录调节因子参与了
许多基因表达的调控 ,与细胞的增殖 、生长 、分化 、凋
亡 、新陈代谢以及肿瘤的形成有密切的关系 [ 18] 。该基
因位于染色体 8q24上 ,一方面通过染色体易位与免疫
球蛋白轻链序列融合而被激活 ,另一方面通过 DNA扩
增导致功能失常 ,其编码的蛋白质能与核内的 DNA特
异结合行使转录调节功能 。 c-Myc在细胞静止期不表
达 ,而在有丝分裂原作用下迅速表达 ,促使细胞增殖 、
浸润 ,最终使细胞增殖异常而癌变 。过度表达的 c-
Myc原癌基因在肿瘤细胞周期调控中扮演着重要的角
色 [ 19] 。它能导致 CDK抑制因子(KIP1)从原本无活性
的 cyclinE-CDK2-KIP1复合体中解离出来 ,使此复合
物被磷酸化而获得活性 ,促进细胞从 G0 /G1期向 S期
进行[ 20] 。本实验研究了 HepG2细胞 c-MycmRNA转
录水平及蛋白翻译水平的改变 ,结果显示经 CCW处
理 48h后的 HepG2细胞 c-Myc的表达明显下降 ,说明
CCW能抑制 c-Myc的表达 ,而细胞周期调控蛋白被认
为是 c-Myc重要的下游效应器 ,所以我们推测 CCW对
HepG2细胞增殖活性的影响可能与下调 c-Myc表达密
切相关 。
此外 ,血管生成在肝癌的生长 、浸润以及转移过程
中发挥着重要的作用 ,新生的血管不仅能提供给肿瘤
生长所需的营养成分 ,而且提供了肿瘤细胞扩散的途
径 [ 21] ,其中 VEGF是一高度特异的血管内皮细胞有丝
分裂素 ,它通过旁分泌方式作用于血管内皮细胞 ,促进
内皮细胞增殖和迁移 ,诱导新生血管的生成。已有研
究发现 ,实体瘤的发生 、发展分为无血管期和血管期 ,
无血管期的肿瘤直径不超过 2 mm[ 22] ,瘤体的营养由
血液中氧气和营养物质通过弥散作用供给 ,此期的肿
瘤无诱导血管生成的能力 ,不会发生转移。进入血管
期后 ,肿瘤细胞分泌大量 VEGF等血管生长因子 ,诱导
新生血管生成 ,导致瘤细胞迅速增殖 ,发生浸润和转
移 。本实验通过检测经不同浓度 CCW处理后 HepG2
细胞中 VEGF基因及蛋白表达量的变化 ,发现随着药
物浓度的增加 , HepG2细胞 VEGF的阳性表达率有显
著的下降 。说明 CCW能有效抑制 HepG2细胞分泌
VEGF,为垂盆草在体外的抗血管生成作用提供一定的
实验依据。
总之 ,垂盆草醇提物能抑制 HepG2细胞增殖 ,并
阻滞细胞于 G0 /G1期 ,这可能与它能降低 c-Myc的蛋
白表达有关系。另外 , 垂盆草醇提物能有效抑制
HepG2细胞分泌 VEGF,具有一定的抗血管生成作用。
本实验结果为垂盆草应用范围的拓展提供了一定的实
验依据 。
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[收稿日期 ] 2008-11-24
GrowthinhibitoryactivityofethanolextractsfromSedumsarmentosum
Bungeonhumanhepatomacelsanditsmechanism
HUANGDan-dan, ZHANGWei-yun
(MedicalSchool, NanjingUniversity, JiangsuKeyLaboratoryofMolecularMedicine, Nanjing210093, China)
Abstract:Objective　ToinvestigatetheefectofethanolextractsfromSedumsarmentosumBunge(CCW)on
HepG2 cels growthandthechangesoftheirtumor-associatedmoleculartargets.　Methods　Firstlyproliferationabil-
ityandcelcyclechangesofHepG2 celsweredetectedbyMTTmethodandflowcytometry.ThemRNAlevelsofVEGF
andc-MycweredeterminedbyRT-PCR.TheproteinexpressionsofVEGFandc-Mycwerevaluedbyimmunocytochemis-
try.Results　CCWgreatlyinhibitedHepG2 celgrowthafterCCWtreatmentfor24, 48 and72h.Analysisofcelcycles
demonstratedCCWcausedHepG2celsarrestedinG0 /G1 phase.ThemRNAandproteinlevelsofVEGFandc-Mycwere
significantlydecreasedafterCCWtreatmentfor48 h.Conclusion　ThepresentstudysuggeststhatCCWhavepotential
inhibitionefectsonHepG2, whichisinclosecorelationwiththedeclinesofc-Myctranscriptsandproteintranslationin
HepG2cels.ItalsopresumedthatCCWmightposessanti-angiogenicactivitybyinhibitingsecretionofVEGF.
Keywords:SedumsarmentosumBunge;hepatocelularcarcinoma;anti-proliferation;celcycle;anti-angiogenesis
·306· 东南大学学报(医学版)　2009年 8月 , 28(4)