全 文 ：收稿日期:2009-05-09;　修订日期:2009-09-16
基金项目:云南省科技计划项目(No.2008CD140);
西南林学院基金(No.200613M)
作者简介:杨发忠(1974-),男(汉族),云南楚雄人 ,现任西南林学院讲师 ,
硕士学位 ,主要从事化学生态学和天然产物化学方面的研究工作.
＊通讯作者简介:杨　斌(1971-), 男(汉族),四川仁寿人 , 现任西南林学
院教授 ,博士学位 ,主要从事森林保护和化学生态学方面的研究工作.
中草药叶下花总黄酮提取方法
杨发忠1 ,杨　斌 1＊ ,杨德强2 ,陈厚琴 1 ,代红娟1 ,张　丽 1 ,李东海 1
(1.西南林学院 ,云南 ,昆明　 650224;　2.云南师范大学计算机科学与信息技术学院 ,云南 昆明　650092)
摘要:目的 对叶下花总黄酮的种类与提取方法进行初步研究。方法 采用定性检测 、光谱分析 、单因素测定 、正交实验
等 , 研究黄酮种类 ,考察乙醇体积分数 、温度 、固液比 、时间对提取率的影响。 结果 叶下花含黄酮 、黄酮醇 、二氢黄酮 、二
氢黄酮醇等多种黄酮类化合物;所考察的影响因素中 , 对总黄酮提取率影响程度大小顺序为乙醇体积分数 >温度 >时间
>固液比。结论 最佳提取条件为 A1B2C3D3(乙醇体积分数 30%、温度 65℃, 提取时间 180min, 固液比 1∶80), 在此提取
条件下 , 提取量高达 5.233%。
关键词:叶下花;　总黄酮;　提取方法;　正交实验
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)02-0333-02
TheExtractionMethodsofTotalFlavonoidsinAinsliaeapertyoidesFranch
YANGFa-zhong1 , YANGBin1＊ , YANGDe-qiang2 ,CHENHou-qin1 , DAIHong-juan1 , ZHANGLi1 , LIDong-hai1
(1.SouthwestForestryUniversity, Kunming650224, China;2.YunnanNormalUniversity, Kunming650092,
China)
Abstract:ObjectiveTooptimizetheextractionconditionsforthetotalflavonoidsfromAinsliaeapertyoidesFranchandtostudy
thecategoriesofthetotalflavonoids.MethodsThemethodsofthechemicalqualitativedetection, thespectralanalysis, single
factordetermination, orthogonaltestwereadoptedtostudythecategoriesofthetotalflavonoids, andtheefectoffourfactors, i.
e.thevolumefractionofethanol, thetemperature, theratioofsolidtoliquid, theextractingtime, ontherateofthetotalfla-
vonoids, werealsoinvestigatedatthesametime.Results 1)Thetotalflavonoidsconsistedofflavones, flavonols, flavanones,
flavanonolsinA.pertyoides.2)Theorderoffactorstoafecttheflavonoidextractionwasvolumefractionofethanol>temperature
>extractingtime>ratioofsolidtoliquid.ConclusionTheoptimumextractionconditionsareA1B2C3D3.Thehighestextraction
rateofthetotalflavonoidsreached5.233% undertheoptimalconditions.
Keywords:AinsliaeapertyoidesFranch;　Totalflavonoids;　Extractingmethods;　Orthogonaltest
　　叶下花AinsliaeapertyoidesFranch.var.albo-tomentosaBeau-
verd也称白背兔耳风 、白背叶下花 、追风箭等 , 菊科(Compositae)
帚菊木族(MutisieaeCass)兔耳风属(AinsliaeaDC)草本植物 [ 1] ,
是《本草纲目》等多部药典收录的天然药用植物 [ 1] 。 叶下花作为
骨科良药分布广泛 、资源丰富 、临床应用和民间用药历史十分悠
久 , 并能用于治疗强直性脊柱炎 , 填补了中药治疗在此领域的空
白 [ 2] , 意义重大。本研究小组发现 [ 3] ,叶下花中黄酮类化合物具
有明显的抗氧化活性和羟基自由基清除能力 ,但不清楚叶下花作
为骨科良药的活性成分是否与此有关。已有很多文献指出 ,高等
植物中类黄酮有多种药理作用 ,是一类十分重要的天然有机化合
物 , 其中很多接骨效果很好的药用植物 , 其活性成分就是黄酮类
化合物 [ 4～ 8] ,所以本工作首先对叶下花总黄酮提取方法进行研
究 , 以期为叶下花黄酮药理活性及叶下花中药现代化的研究奠定
基础。
1　材料与仪器
1.1　中药材 叶下花干燥全草于 2006-10采自云南省楚雄市树
苴镇 , 洗净 、风干 、粉碎 、过 40目筛 ,备用。
1.2　仪器与试剂 Unic7200型分光光度计 [尤尼柯(上海)仪器
有限公司 ] ;Bs210s电子天平(北京赛多利斯天平有限公司);
HWS12型电热恒温浴锅(上海一恒科技有限公司);RE-2000型
旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);RO-DI-50-RE纯水系统
(厦门锐思捷公司)。
芦丁(rutin)标准品 , 成都欧康植化科技有限公司产品。
FeCl
3
、NaNO
2
、Al(NO
3
)
3
、NaOH、盐酸 、Mg粉 、无水乙醇等均为分
析纯 , 实验用水为去离子水。
2　方法
2.1　黄酮类化合物的定性检测 [ 9]
2.1.1　盐酸 -镁粉反应 取提取液 1 ml加入少许镁粉 , 振摇后
加浓盐酸 4 ～ 5滴 ,加热 3 min。
2.1.2　三氯化铝试验 取提取液滴于滤纸上 ,喷 1% AlCl
3
乙醇
溶液。
2.1.3　与碱反应试验 取提取液 1 ml,加入 10% Na2CO3 5滴。
2.1.4　三氯化铁试验 取提取液 , 滴加 1%的三氯化铁溶液 。
2.1.5　铅盐沉淀试验 取提取液 2 ml,滴加乙酸铅试剂。
2.1.6　Molish反应 取提取液加入 α-萘酚乙醇溶液 , 缓慢加入
硫酸。
2.2　检测波长的选择和标准工作曲线的绘制 采用 NaNO2 -
Al(NO3)3 -NaOH法测定总黄酮 [ 10 ～ 12] ,并稍作改动。
精密称取芦丁标准品 50mg,置于 50ml容量瓶中 ,加 60%乙
醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 , 即得 1 000μg/ml芦丁标准溶液。
同时用 30%的乙醇 -水(V/V)对叶下花干燥粉末进行提取 ,
并用石油醚反复多次萃取至石油醚层无色 ,获得下层的叶下花总
黄酮提取物 ,定容至合适的体积。
将芦丁标准溶液和叶下花总黄酮提取物各取 5.00 ml,先分
别加入 5% NaNO2溶液 1 ml, 摇匀 ,放置 6 min后 , 分别加入浓度
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5% Al(NO3)3溶液 1 ml, 摇匀 , 再放置 6 min后 , 再分别加入
10%NaOH溶液 10ml, 用去离子水稀释至 25.00 ml, 摇匀 , 放置
10 ～ 15 min后 ,采用试剂参比 , 在分光光度计上在 600 ～ 350 nm
范围内进行扫描 , 以获得二者的扫描图谱和最大吸收波长。
分别准确吸取芦丁标准溶液 0.00, 0.10, 0.40, 0.70, 1.00,
2.00, 4.00, 6.00, 8.00 ml, 同法显色 , 在选定的最大吸收波长处
绘制芦丁标准工作曲线。用 Origin6.1软件进行数据处理(下
同)。
2.3　单因素实验考查
2.3.1　乙醇体积分数对叶下花总黄酮得率的影响 准确称取
1.000g叶下花干燥粉末 , 按固液比 1∶ 50(g/ml)加入 20%,
25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%的乙醇 -水(V/V)溶剂 , 在温
度为 70℃下浸提 1.5 h, 滤过 , 定容至 100 ml, 取 5 ml按本实验
“ 2.2”进行测定 , 计算不同乙醇体积分数时叶下花总黄酮百分含
量 , 用于考查对得率的影响。
2.3.2　最佳提取温度的选择 采用 30%的乙醇溶液 , 在温度为
50, 60, 70, 80, 90℃时 ,其他条件与 “ 2.3.1”项下的相同 , 测定不同
温度下的黄酮含量 , 以确定最佳提取温度。
2.3.3　最佳固液比的选择 按固液比分别为 1∶30, 1∶40, 1∶
50, 1∶60, 1∶70加入 30%的乙醇溶液 ,其他条件与 “ 2.3.1”的相
同 , 测定不同固液比条件下的黄酮含量 , 以确定最佳固液比。
2.3.4　最佳提取时间考察 按乙醇体积分数为 30%、固液比为 1
∶60、提取温度为 70℃的条件进行提取 , 但提取时间分别为 60,
120, 150, 180 min,测定不同时间下的总黄酮得率 , 以考查提取时
间的影响。
2.4　正交实验优化提取条件 因溶剂体积分数 、提取温度 、固液
比 、提取时间对叶下花总黄酮得率均有影响 , 故在单因素实验基
础上 , 利用正交实验进一步对各影响因素之间的交互关系进行研
究 , 以确定最佳提取条件。正交表头设计 L9(34)见表 1。
表 1　实验因素水平 L9(34)
水平 A乙醇体积分数(%)
B
提取温度T/℃
C
提取时间 t/min
D
固液比 /g∶ml
1 30 50 60 1∶40
2 50 65 120 1∶60
3 70 80 180 1∶80
3　结果
3.1　黄酮类化合物定性检测结果 利用黄酮类化合物在不同试
验中产生的特殊颜色反应 , 可以对黄酮类化合物进行定性分析 ,
结果见表 2。
从表 2可以看出 , 叶下花植物中含有黄酮 、黄酮醇 、二氢黄
酮 、二氢黄酮醇 、7, 4′-二羟基黄酮醇等多种类型的类黄酮化
合物 , 种类十分丰富。已有资料表明 [ 6] , 不同种类 、不同结构的
黄酮 , 其药理活性 、抗氧化活性等多种生物活性有着明显不同 ,叶
下花黄酮可能同时具有接骨 、抗炎 、抗菌多方面的药理活性 ,与临
床应用研究结论一致 [ 4] , 具有明显的研究价值。
表 2　黄酮类化合物的定性检测
检测项目 检测结果 结论
盐酸 -镁粉反应 溶液出现浅红色 可能存在黄酮 、黄酮醇 、
二氢黄酮 、二氢黄酮醇等黄酮类化合物
三氯化铝试验 出现黄色 可能存在 7, 4′-二羟基黄酮醇类化合物
与碱反应试验 溶液变黄 可能含有二氢黄酮 、黄酮醇等
三氯化铁试验 溶液出现蓝绿色 可能含有酚羟基类物质
铅盐沉淀试验 溶液出现红色 可能含有黄酮醇等黄酮类化合物Molish反应 溶液出现紫红色 可能存在黄酮苷类化合物
3.2　吸收光谱和标准工作曲线绘制 对芦丁和叶下花总黄酮提
取物进行扫描所得的吸收光谱如图 1。
由图 1可知 , 叶下花总黄酮和芦丁的光吸收曲线较为相似。
二者均在 510 nm处有最大吸收 , 波形也十分相似。此最大吸收
峰是由黄酮化合物中 B环桂皮酰基(cinnamoyl)系统引起的带 I
吸收(300 ～ 400 nm)红移的结果 [在强碱性条件下用 Al(NO3)3
显色 ] 。同时芦丁在 385 nm处也有一个明显的吸收峰 , 而在相同
位置叶下花总黄酮仅表现为一个肩峰 , 并在 385 nm以下有强吸
收。带Ⅰ 吸收较弱 , 带Ⅱ吸收较强 , 可知主要含有黄酮和黄酮醇
类。从波谱扫描图谱中不但可以确认叶下花提取物中含有黄酮
类化合物 ,且种类较多 , 与 “ 3.1”项中预实验结果相似。
图 1　芦丁和叶下花总黄酮的吸收光谱
本实验选定 510nm作为测定波长 ,获得标准曲线回归方程为
A=0.009 841C+0.046 92, A为吸光度 , C为浓度(μg/ml),线性
相关系数 r= 0.999 77, 线性范围 4.00 ～ 200.00 μg/ml。线性关
系良好 ,线性范围很宽 ,可作为叶下花总黄酮得率的测定方法。
3.3　单因素测定结果
3.3.1　乙醇体积分数对叶下花总黄酮得率的影响 结果如图 2。
随乙醇体积分数增加 ,叶下花总黄酮得率逐渐增加 ,当乙醇体积
分数增加至 30%时 , 得率达最高 , 但继续增加乙醇体积分数 , 得
率反而下降 , 所以确定提取黄酮所需乙醇的最佳体积分数为
30%。
图 2　乙醇体积分数　　　　图 3　温度对提取量
对提取量的影响　　　　　　的影响
3.3.2　温度对总黄酮得率的影响 结果如图 3。在 65℃左右得
率达到最大值 , 温度过高则黄酮含量反而有所降低 ,可能与高温
下部分黄酮发生分解有关 , 所以确定 65℃为叶下花黄酮的最佳
提取温度。
3.3.3　固液比对总黄酮得率的影响 结果如图 4。当固液比为
1∶60时 ,总黄酮得率最高 , 再增加溶剂用量 , 变化不大。
图 4　固液比对提取　　　　　图 5　时间对提取量
量的影响　　　　　　　　　　的影响
3.3.4　时间对总黄酮得率的影响 结果如图 5。 可以看出 ,
120min左右可将叶下花中的大部分黄酮提取出来 。
3.4　正交实验结果与分析 如表 3所示。从表中 K1 , K2 , K3 , R分
析得到 ,乙醇体积分数 、温度 、固液比 、提取时间 4因素对黄酮提
取量影响的主次顺序及最佳提取条件为:A1B2C3D3 ,即乙醇体积
分数 30%, 温度 65℃,提取时间 180min, 固液比 1∶80。
3.5　正交实验结果验证 由于从正交实验中得出的最佳提取条
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 2期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.2
件在所做的实验中并未出现 , 需要进行验证。按最佳提取条件并
采用与 “ 2.3.1”项相似的方法进行提取 , 重复 4次 , 结果叶下花
总黄酮提取量为 5.233%(RSD为 1.4%), 在本实验中提取量达
到最大。同时可见 , 叶下花总黄酮含量很高 , 具有明显研究价值。
表 3　正交实验结果
试验号 A B C D 总黄酮含量(%)
1 A1 B1 C1 D1 4.175
2 A1 B2 C2 D2 4.649
3 A1 B3 C3 D3 5.071
4 A2 B1 C2 D3 4.248
5 A2 B2 C3 D1 4.912
6 A2 B3 C1 D2 4.501
7 A3 B1 C3 D2 3.981
8 A3 B2 C1 D3 4.105
9 A3 B3 C2 D1 3.976K1 4.632 4.135 4.260 4.354K2 4.554 4.555 4.291 4.377K3 4.021 4.516 4.655 4.475R 0.611 0.421 0.394 0.120
4　结论
利用现代中医药理论研究中草药叶下花的报道还十分少见 ,
与十分普遍的用药状况相比形成极大的反差。 本文通过定性检
测 、光谱分析 、单因素测定 、正交实验等研究 , 确认了黄酮最佳提
取条件为乙醇体积分数 30%, 温度 65℃,提取时间 180 min,固液
比 1∶80,在此提取条件下 , 提取量高达 5.233%。叶下花中黄酮
种类较多 、含量极为丰富 ,具有明显的研究价值和开发利用前景。
研究结果为中草药叶下花黄酮类化合物的进一步开发利用奠定
了坚实基础 , 并为叶下花中药现代化提供理论依据。
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收稿日期:2009-05-17;　修订日期:2009-08-31
基金项目:江西省中医药科研基金项目(No.20071312)
作者简介:彭绵林(1958-),男(汉族),江西赣州人 ,现任赣南医学院附属
第一医院主管中药师 ,主要从事中药研究工作.
绵萆薢治疗带状疱疹神经痛的有效成分研究
彭绵林1 ,魏桂林 1 ,郭优勤 1 ,胡寿荣2
(1.赣南医学院附属第一医院 ,江西 赣州　341000;　2.江西省食品药品检验所 ,江西 南昌　330046)
摘要:目的 研究绵萆薢治疗带状疱疹神经痛的有效成分。方法 采用乙醇提取 , 递增极性溶剂逐步分离各组分 , 经临床
验证有效组分后 , 对其进行结构和类别的初步鉴定。结果 提取物被分离为极性不等的 6个组分 , 临床实验确认其中只
有一个组分的疗效最显著 ,经鉴定其含薯蓣皂苷元和甾醇。结论 综合成分起作用 , 主要是甾体皂苷类的水解产物 ,含甾
醇类物质。
关键词:绵萆薢;　带状疱疹神经痛;　有效成分
中图分类号:R259　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)02-0335-01
　　绵萆薢 RhizomaDioscoreaeSeptemlobae为薯蓣科植物 , 主产
于江西 、浙江 、福建等地。据江西赣南的民间流传 ,将绵萆薢用白
酒浸泡后 , 外用治疗带状疱疹及后遗神经痛。在前期的临床预试
验中 , 该法治疗带状疱疹神经痛的有效率达 85%, 且无毒副作
用。我们对绵萆薢具镇痛作用的有效成分进行了初步的探究 ,结
果报道如下。
1　材料
TGL-16高速台式离心机 , 上海医疗器械六厂;TG328A电光
分析天平 , 上海天平仪器厂;绵萆薢 , 端午节前从集市上收购鲜
货 , 加工成干燥 、细薄的饮片 , 备用。 胆固醇(500 g/瓶 , 批号
070227,山东泰山生化原料公司);薯蓣皂苷元(100 mg/支 , 批号
200705,江西省食品药品检验所提供);石油醚 ,乙醚 ,氯仿 , 丙酮 ,
乙醇等均为分析纯试剂。
2 　方法与结果
2.1　提取分离 取绵萆薢饮片 1 000 g, 置具密封盖的玻璃罐中 ,
加 50%乙醇 1000ml,密闭浸泡 7d,期间不时搅拌。然后 , 用四层
纱布初滤 ,挤压滤渣 , 滤液密闭静置后 , 移开上层清液 , 将下层沉
淀离心 。合并两清液 ,再用滤纸过滤 , 得滤液 600 ml。将滤液减
压浓缩至浸膏 , 50℃干燥 ,得提取物 35.8 g。
取上述提取物 ,加石油醚 60 ml, 在水浴上加热回流 1 h, 过
滤 , 滤液减压浓缩至浸膏 , 50℃干燥 ,所得提取物编号为 1。同样
操作 , 将前面的滤渣依次使用乙醚 、氯仿 、丙酮 、乙醇提取 ,所得提
取物分别编号为 2, 3, 4, 5。最后剩下的滤渣编号为 6[ 1, 2] 。
2.2 　药液配制 取上述 6个组分 , 分别加入 50%乙醇 , 配制成
相应编号的浓度为 2%的药液 , 密闭 ,冷藏备用。
2.3 　临床验证 2008年从本院临床选取年龄 50岁以上的带状
疱疹神经痛患者 60例 , 其中男 42例 , 女 18例 , 年龄最大 78岁 ,
最小 50岁 ,平均年龄 62岁。将患者随机分成 6组(每组 10例 , 7
男 3女),洗净患处 , 分别外搽 “ 2.2”项中配制的药液 ,一日多次 ,
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