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(2005 - 10 -20收稿)
脱皮马勃化学成分研究及抗肿瘤活性的初筛
崔　磊 1 ,宋淑亮2 ,孙隆儒 1*
(1.山东大学药学院 ,山东济南 250012;2.山大威海国际生物技术研发中心 ,山东威海 264209)
　　摘要　从灰包科脱皮马勃属真菌脱皮马勃 Lasiosphaera fenzlii Re ich.的干燥子实体的脂溶性部分首次分得了 6
种化合物 , 经过理化常数和波谱分析 , 分别鉴定为 ergo sta-7, 22-diene-3 β-one(Ⅰ ), e rgosta-5, 7, 22-triene-3 β-o l
(Ⅱ ), 5α-lanosta-8(9), 23-diene-3β, 25-dio l-22-aceta te este r(Ⅲ ), ergo sta-4, 6, 8(14), 22-te traen-3-one(Ⅳ), (2S, 3S,
4R, 2’ R)-2-(2’ -hydroxy tetracosanoy lam ino) oc tadecane-1, 3, 4-trio l(Ⅴ), β-谷甾醇(Ⅵ )。并用肝癌细胞 Be l-7402和
神经胶质瘤细胞 C6对化合物Ⅰ 、Ⅳ和Ⅴ的抗肿瘤活性进行了初步的筛选 ,发现化合物Ⅰ在测定浓度范围内呈现出
良好剂量依赖性抑制作用。
关键词　脱皮马勃;抗肿瘤;分离;MTT法
中图分类号:R284.1 /R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)07-0703-03
作者简介:崔磊 ,男 ,山东省蓬莱市人 ,在读硕士。 Tel:0531-88382012, Em ail:Cu ilei@m ail. sdu. edu. cn。
　　*通讯作者:孙隆儒
　　脱皮马勃 Lasiosphaera fenzlii Re ich.属于灰包
科脱皮马勃属真菌 ,是中国药典 2005年版规定的三
种正品马勃之一 ,为常用中药 ,其味辛 、平 ,具有清肺
利咽 、止血之功效 , 用于风热郁肺咽痛 、咳嗽 、音
哑 〔1〕。迄今为止对该属真菌的化学成分的研究较
少 ,有文献报道从该属真菌 Lasiosphaera n ipponica
(G asteromyce ts)的子实体中分得 3β , 14α, 17α, 20,
24 , 25-hydroxye rgosta-6-one-7, 22-diene, ergo sterol
perox ide, ergostero l, cerev iste ro l 和 4-me th oxy-
benzene-1-ONN-azoxy form am ide〔2〕。为了进一步深入
研究该属真菌 ,我们从脱皮马勃中分得了 6个化合
物 ,并对其抗肿瘤活性进行了初步的筛选 。
1 　材料和仪器
脱皮马勃 Lasiosphaera fenzlii Reich.采购自黑
龙江省呼兰县 ,由山东大学药学院生药研究所李允
尧教授鉴定为脱皮马勃 Lasiosphaera fenzlii Reich。
溶点采用 X-6显微熔点测定仪 (北京泰克仪器厂 ,
温度未校正 )测定 。紫外用 Agilent 8453E型紫外可
见分光光度计。红外光谱用 N ico let Nexus 47 OF
TIR红外光谱仪测定。质谱用 API4000型质谱仪测
定 。核磁共振用 B rukerAvance600型核磁共振波谱
仪测定 ,柱层析和薄层层析硅胶系青岛海洋化工厂
产品。酶标仪为 Sunrise M age llance V 2.50,二氧化
碳培养箱为 SANYO MCO-15AC。
肿瘤细胞:人肝癌细胞 Be l-7402、人神经胶质瘤
细胞 C6。培养基:10%胎牛血清 DMEM培养基 +庆
大霉素(10U /L)
2　提取和分离
脱皮马勃干燥子实体 5 kg粉碎 ,装入大型索氏
提取器 ,用石油醚 (60 ～ 90℃)加热回流提取三次 ,
每次提取 10 h ,合并提取液 ,减压回收石油醚得浸
膏。将所得到的提取物浸膏进行硅胶柱层析 (200
～ 300目 ),用石油醚-丙酮 (1∶0 ～ 6∶4)进行梯度洗
脱 ,每 500m l收集 1份 ,根据 TLC合并相同的流分 ,
分成 6个组分 。组分 2重结晶得到化合物Ⅰ 1.2 g,
母液上硅胶柱用石油醚-乙酸乙酯(9∶1)洗脱得化合
物Ⅱ 15mg和化合物Ⅲ 10 mg;组分 3重结晶得化合
物Ⅳ 0.6 g;组分 4重结晶得化合物Ⅴ 0.8 g;组分 5
重结晶得化合物Ⅵ 0.4 g。
3　结构鉴定
化合 物 Ⅰ :C28 H44 O , 无 色 针 状 结 晶 ,
EIMS , 1HNMR和 13CNMR数据与 ergosta-7, 22-diene-
3 β-one一致 〔3〕。
化合物 Ⅱ:C28H44O ,无色针状结晶 , 1HNMR数
据和 13CNMR数据与 ergosta-5, 7, 22-triene-3 β-o〔4〕一
致。
化合物 Ⅲ:C32 H52 O4 , 白色无定 形粉 末 ,
EIMS , 1HNMR和13 CNMR数据与 5α-lanosta-8(9),
23-diene-3β, 25-diol-22-aceta te este r〔5〕一致。
化合物Ⅳ:无色片状结晶 (甲醇),碘化铋钾反
703 中药材第 29卷第 7期 2006年 7月
应成阳性。 FAB-MS给出的分子量相关离子 393(M
+1), 表明相对分子质量为 392。 E I-MS 显示
392.3057(M +)(计算值为 392.3079)得出分子式为
C28H40O ,不饱和度为 9。从 1HNMR中可以看出有 6
甲基的氢信号 ,其分别是 δ0.97(3H , s), δ1.0(3H ,
s), δ0.83(3H , d, J =6.76Hz), δ0.86(3H , d, J =
6.78Hz), δ0.92(3H , d, J=8.17)和 δ1.06(3H , d, J
=6.69)。从 13 CNMR中可以很容易看出与 1HNMR
中甲基氢信号相对应的 6个甲基信号 。从 13 CNMR
中还可以看出 δ199.60的 C =O和四个 C =C其化
学位移值分别为 δ122.99, 124.40 , 124, 46, 132.51,
134.06, 135.02, 156.16, 164.44。结论 HMQC , HM-
BC和 1H-1HCOSY谱 ,得出化合物的结构为 e rgosta-
4, 6, 8(14), 22-te traen-3-one。通过与文献〔6〕的谱图
数据比较 ,确定化合物Ⅳ为 ergosta-4, 6, 8(14), 22-
tetraen-3-one。
化合物Ⅴ:C42H85O 5 ,白色无定形粉末 , mp138℃
～ 140℃, 1HNMR和13 CNMR数据与 (2S, 3S , 4R, 2’
R)-2-(2 ’ -hydroxy tetraco sanoy lam ino) octadecane-1,
3, 4-triol一致 〔7〕。
化合物 Ⅵ :无色针状针晶 , mp134℃ ～ 136℃,与
标准 β-谷甾醇混合后 ,熔点不下降 , TLC得 Rf值 、红
外光谱与已知化合物 β-谷甾醇一致 ,因此断定化合
物 Ⅵ为 β-谷甾醇 。
4 　体外抗肿瘤细胞实验 〔8〕
4.1 　方法　取对数生长期的 Be l-7402肝癌细胞和
C6神经瘤细胞 ,用 DMEM完全培养基调整细胞浓度
为 6×104个 /m l,加到 96孔培养板中 ,每孔 100 μl,
置 37℃、5%湿化的 CO 2培养箱中培养 。 12 h后 ,实
验组分别吸出 2、4、6、8 μl培养基 ,并分别加入相应
体积的 5mg /m l的化合物 Ⅰ 、化合物Ⅳ和化合物Ⅴ
(DMEM培养基溶解 , DMSO助溶 ,并用 0.22 μm的
微孔滤膜过滤除菌 ),使其质量终浓度分别为 50、
100、150、200 μg /m l,正常对照吸出 5 μl培养基 ,并
加入 5 μl新培养基 (含有相同浓度的 DMSO),阳性
对照加入 1mg /m l 5-FU 10 μl(5-FU终浓度 100μg /
m l),每个剂量设 4个平行孔 ,置 37℃、5%湿化的
CO2培养箱中继续培养 36 h。
培养结束前 4 h,每孔加入 5 mg /m lMTT试液
10 μl,培养 4 h后 ,以快速翻板法弃上清 , 每孔加
DMSO100μl,用微量振荡器振荡 10 m in,用酶标仪
测定各孔吸光度 ,检测波长 570 nm ,参比波长 620
nm。计算细胞生长增值抑制率:
细胞增值抑制率 (%)=(1 -实验组吸光度 /正常对照组吸光
度)×100%
4.2　结果和分析　从实验数据可以看出化合物 Ⅰ
对 Bel-7402和 C6有较明显的抑制作用 ,抑制作用
随浓度的增大而增大;化合物Ⅳ对 Be l-7402有较弱
的抑制作用 ,抑制作用随浓度的增大而增大 ,但对
C6没有作用;化合物Ⅴ对 C6有较弱的抑制作用 ,对
Bel-7402则没有作用 。 (见图 1,图 2)
图 1　不同化合物对 Be l-7402增殖抑制作用量效曲线
图 2　不同化合物对 C6增殖抑制作用量效曲线
　　注:阳性对照组(100μg /m l),其对肝癌细胞和神经胶质瘤细胞
的增殖抑制率分别为 44.6%和 56. 55%
参 考 文 献
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(2005 - 10 -23收稿)
补脾益肠胶囊抗结肠炎作用研究
廖惠芳 ,廖雪珍 ,周玖瑶 ,熊天琴 ,黄桂英
(广州中医药大学药理教研室 ,广东广州 510405)
　　摘要　目的:研究补脾益肠胶囊对各种结肠炎的作用。 方法:选用 2, 4二硝基氯苯 、乙酸致大鼠结肠炎模型 ,
观察补脾益肠胶囊对模型大鼠结肠髓过氧化酶(M PO)活性 , 血清乳酸脱氢酶(LDH)、淀粉酶 (AM S)含量及结肠组
织形态改变的影响。选用大黄致脾虚型小鼠 ,观察补脾益肠胶囊的补中益气 , 健脾和胃 ,涩肠止泻作用。结果:补
脾益肠胶囊能显著减轻 2, 4二硝基氯苯型结肠炎大鼠的结肠大体形态损伤 、组织学损伤及体重减轻程度 , 降低结
肠 MPO活性及血清 LDH含量 , 增加血清 AMS含量 ,减轻结肠湿重 , P<0.05 ～ 0. 01;能显著减轻乙酸致结肠炎大鼠
的结肠大体形态损伤 、组织学损伤及体重减轻程度 , P<0. 05 ～ 0.01。能延长大黄致脾虚模型小鼠的排便时间 、减
少 2 h内排黑便点数及排黑便率 ,减少脾虚模型小鼠体重减轻的程度 , P<0. 05 ～ 0.01。结论:补脾益肠胶囊能改善
结肠炎大鼠及脾虚型小鼠的症状 ,对结肠炎有一定的治疗作用。
关键词　补脾益肠胶囊;结肠炎模型
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)07-0705-04
作者简介:廖惠芳 ,女 ,副教授 ,从事药理学教育 、中药药理与新药开发研究工作。 Tel:020-81081346, E-m ail:xing-fam ily@ 163. com。
　　补脾益肠胶囊是由补脾益肠丸改革而成 ,由黄
芪 、党参 、白芍 、白术 、延胡索 、当归 、砂仁 、木香 、防
风 、赤石脂等组成 ,原用于治疗脾虚泄泻症 ,现根据
其补中益气 ,健脾和胃的功能 ,扩大其应用范围 ,用
于治疗慢性结肠炎及溃疡性结肠炎 。为此 ,本实验
采用 2, 4二硝基氯苯 、乙酸造成大鼠结肠炎模型 ,大
黄脾虚型小鼠探讨补脾益肠胶囊的抗结肠炎作用 ,
为其临床应用提供实验依据 ,现将结果报道如下:
1 　实验材料
1.1 　药物与试剂
1.1.1　药物:补脾益肠胶囊浸膏 ,深圳三九医药业
股份有限公司提供 ,批号:20020725,规格:4.0 g生
药 /g浸膏 ,日用量 18 g生药 /天。实验时设高 、中 、
低三个剂量组 ,按体表面积折算为临床日用量的 4、
2、1个等效剂量。补脾益肠丸 ,深圳三九医药业股
份有限公司提供 ,批号:020904, 规格:3.0 g生药 /
片 ,日用量 18 g生药 /天。实验时设中剂量组 ,按体
表面积折算为临床日用量的 2个等效剂量 。柳氮磺
胺嘧啶 , 上海三维制药有限公司提供 , 批号:
20020423,规格:0.25 g /片 。
1.1.2　试剂:髓过氧化酶 (MPO)试剂盒 ,南京建
成生物工程研究所提供 ,批号:20030529;乳酸脱氢
酶 (LDH)试剂盒 ,南京建成生物工程研究所提供 ,
批号:20030530;AMS(淀粉酶)试剂盒 ,南京建成生
物工程研究所提供 ,批号:20030528。
1.2　动物　N IH小鼠 、SD大鼠 (SFP级 ),南方医
科大学动物实验中心提供 ,合格证号:2002A040。
1.3　仪器　722光栅分光光度计 (上海第三分析
仪器厂);ANGPING JA1023电子天平 (上海天平仪
器厂 )。
2　实验方法与结果
2.1　对 2, 4二硝基氯苯型结肠炎的影响　选用
180 ～ 200 g SD大鼠 72只 ,雌雄各半 ,其中 62只 ,按
2, 4二硝基氯苯型 〔1〕结肠炎法 ,复制溃疡型结肠炎
模型 ,大鼠背部用 10%Na2S脱毛后 ,每天用 2%2 , 4
二硝基氯苯丙酮液 0.2m l滴于背部脱毛区 ,每天一
次 ,连续 14天致敏 ,然后用聚乙烯导管向大鼠肛内
8 cm结肠内灌注 0.1%2, 4二硝基氯苯丙酮液 0.25
m l /次 /天 ,连续 4天复制结肠炎模型 ,并处死 2只动
物解剖观察结肠情况 ,确定模型成功 ,即将模型大鼠
随机分为 6组 ,按 20 m l /kg容积灌胃给药 ,每天一
次 ,连续 14天 ,正常组及模型对照组灌服等量的蒸
馏水 ,末次药后禁食不禁水 12 h,称重 ,眼眶静脉取
血 ,按生物试剂盒要求用 721分光度光度计测定血
清 LDH、AMS的含量 ,然后脱颈椎死大鼠 ,剖开腹
腔 ,取出大鼠肛门至回盲部结肠 ,剖开 ,清洗 ,观察大
705 中药材第 29卷第 7期 2006年 7月