全 文 ：doi:10. 16473 / j. cnki. xblykx1972. 2016. 01. 002
长松萝中非核糖体肽合成酶 NRPS基因克隆与鉴定 *
原晓龙1，2，陈剑1，2，张传光3，毕玮1，2，王娟1，2，王毅1，2
(1. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201;2. 云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，
国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南 昆明 650201;
3. 云南农业大学，资源与环境学院，云南 昆明 650201)
摘要:非核糖体肽具抗生素、抗病毒、抗癌及免疫抑制剂等重要的药用价值。以长松萝的地衣型真菌为研究材
料，通过同源克隆和 Gene walking的方法获取长松萝地衣型真菌全长非核糖体肽合成酶基因 (UsNRPS)，并对得
到的 UsNRPS进行生物信息学分析、分子系统进化分析及基因表达分析。结果表明:在地衣型真菌中，非核糖体
肽在长松萝中为首次发现，BLAST比对表明其为 NRPS基因的 A结构域，生物信息学分析显示 UsNRPS蛋白是一
种非分泌蛋白，位于细胞质基质中;分子进化分析显示 UsNRPS 与埃默森蓝状菌 (Rasamsonia emersonii)的
NRPS基因的 A结构域蛋白聚为一类;RT-PCR 分析表明:2 %肌醇、10 %甘露醇、2 %山梨醇、2 %葡萄糖、
10 %葡萄糖、0. 2 %谷氨酰胺、1 %甘氨酸、0. 2 %丙氨酸能够诱导 NRPS基因的轻微表达，2 %、10 %蔗糖和
果糖均能诱导 NRPS基因的强烈表达;0. 2 %、1 %的天冬氨酸均抑制 NRPS基因的诱导表达。
关键词:长松萝;NRPS;基因克隆;生物信息学分析;分子系统进化分析;诱导表达
中图分类号:R 284;R 285 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2016)01 － 0014 － 08
The Genetic Clone and Identification of Non-ribosomal Peptides
Synthetases (NRPS) from Usnea longissima
YUAN Xiao-long1，2，CHEN Jian1，2，ZHANG Chuan-guang3，BI Wei1，2，WANG Juan1，2，WANG Yi1，2
(1. Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. R. China;2. Key Laboratory for Conservation of Rare，Endangered ＆ Endemic Forest
Plants，State Forestry Administration，Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants，Kunming Yunnan 650201，
P. R. China;3. College of Resource and Environment，Yunnan Agricultural University，Kunming Yunnan 650201，P. R. China)
Abstract:Taking Usnea longissima lichen forming fungi as the materials，the segment and full length of NRPS
were cloned by homology-based cloning and gene walking approaches，and relevant analysis on its bioinformatics，
molecular phylogeny evolution and genetic inducible expression were also conducted． For the lichen fungi，the
non-ribosomal peptide was first reported inUsnea longissimi，and the BLAST comparison shows that it is at A (ade-
nylation)structure domain of the NRPS sgene． The bioinformatics analysis shows NRPS is a kind of secreted pro-
tein，which located in cytoplasmic matrix． The A domain proteins of NRPS gene of both UsNRPS and Rasamsonia
emersonii were clustered. The RT-PCR analysis reveals that 2 % inositol，10 % mannitol，2 % sorbitol，2 % glu-
cose，10 % glucose，0. 2 % glutamine，1 % glacine，0. 2 % alanine could induce the expression of NRPS
slightly，2 %，10 % sucrose and fructose could lure the expression of NRPS heavily，while 0. 2 %，1 % aspar-
agines could suppress the expression of NRPS．
Key words:Usnea longissimi;NRPS;gene clone;bioinformatics analysis;molecular phylogeny evolution;in-
ducible expression
第 45 卷 第 1 期
2016 年 2 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 45 No. 1
Feb. 2016
* 收稿日期:2015 － 06 － 30
基金项目:国家自然科学青年科学基金项目 (31400488)，云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目 (2010CI016)。
第一作者简介:原晓龙 (1986 －)，男，研究实习员，硕士，主要从事林木分子生物学研究。E-mail:xiaolony@ 126. com
通讯作者简介:王毅 (1981 －)，男，博士，助理研究员，主要从事植物学和分子生物学研究。E-mail:22825818@ qq. com
非核糖体 (non-ribosomal peptides，NRPS)是
一种在细菌和真菌中通过非核糖体肽合成酶 (non-
ribosomal peptides synthetases，NRPS)途径合成的
一系列的小分子肽类化合物［1］。NRPS 的结构复
杂、后修饰途径多样化及具有广泛的生物活
性［1 ～ 2］。NRPS广泛应用于多肽类抗生素、免疫抑
制剂药物、生物表面活性剂、抗癌药物、细胞生长
抑制剂和抗病毒药物等［3］，如用于革兰氏阳性细
菌感染的 Cubicin (达托霉素)［4］，能有效抑制肿
瘤细胞生长及扩散的 Blenoxane (博来霉素)［5］。多
肽骨架肽链的合成由非核糖体肽合成酶 (NRPS)
催化。NRPS是一种由多模块组成的酶，不同的模
块按照起始、延伸和终止的空间顺序排列而成［6］，
每个模块均有腺苷酰化结构域 (A 结构域)，肽酰
载体蛋白结构域 (T结构域)和缩合结构域 (C 结
构域)3 个核心结构域［7］，特定的结构域具特定的
酶活性［8］，已发现的 NRPS 有线型 (A 型)、重复
型 (B型)和非线性 (C 型)3 种［9 ～ 10］。NRPS 在
催化合成新肽链过程中，A结构域特异性识别特定
氨基酸，以 ATP为能量将其活化为氨酰基-AMP 中
间物［11 ～ 12］，功能类似于氨酰 tRNA 合成酶、乙酰
CoA合成酶 (Acetyl CoA synthetases，ACS)、4-香
豆酸-CoA 连接酶 (4-counarate coenzyme A ligase，
4CL)等［13］。虽然 NRPS A 结构域与氨酰 tRNA 合
成酶催化相似的反应［14］，但它们在进化或结构上
并没有关系，而与 ACS、4CL同属于酰苷酸合成酶
超家族［7］。腺苷酰化结构域 (A 结构域)是 NRPS
的核心保守模件，在催化 NRPS 合成过程中起着重
要的启动和决定作用［15］，在 A 结构域中有 1 个约
100 个氨基酸残基的小 C 端和 1 个约 400 个氨基酸
残基的大 N端［14］。A结构域具有多种不同的片段，
不同的片段专一选择特定的氨基酸，进而决定了
NRPS的功能和生物活性的多样性［16］。
地衣是由真菌 (子囊菌或担子菌)与共生藻
〔蓝藻 (Cyanobacteria)〕共生形成的具高度遗传稳
定性、结构特殊的一类生物有机体［17 ～ 18］。地衣的
次生代谢产物一般由共生真菌产生，具抗氧化、抗
辐射、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等独特活性，还可作
为植物生长抑制剂等［19］，在药用天然产物开发领
域具广阔的应用前景。在自然界地衣生长极其缓
慢，目前尚难以通过人工培养获得具生物活性的地
衣次生代谢产物。在医药应用方面，天然药物具有
得天独厚的优势，但限于原料的供应和产量，药物
的价格往往较高，且对生态的破坏较为严重。利用
基因挖掘技术，发掘与其产物相关的基因，利用组
合生物合成的方法可有效改善这一现状，如李晶
等［20］将白桦脂酸的关键调控基因 HFA1、HMG1 和
ERG9 克隆出来，并将脂肪酸和萜类前体合成途径
整个代谢通路装入酵母细胞，使白桦脂酸的合成的
生物量显著提高。在细菌和真菌中，NRPS 基因广
泛存在，王晗等在黑茶的散囊菌属 (Eurotium)中
检测到 NRPS基因片段的存在［21］;NRPS 基因在海
洋微生物中也广泛存在［22 ～ 23］，极地微生物中也已
发现 NRPS 基因的存在［24］。目前在地衣中尚没有
关于非核糖体多肽合成酶相关的报道。本研究拟从
基因出发，通过 Gene walking 克隆地衣的 NRPS 相
关基因，用半定量 PCR 检测不同碳氮源添加物对
NRPS基因表达的影响，为利用地衣基因资源和开
发潜在的地衣 NRP化合物奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试剂和材料
长松萝 (Usnea longissima)地衣型真菌由韩国
地衣资源中心提供，于 MYA培养基上 15℃条件下
培养，定期转接。MYA 培养基配方为麦芽糖提取
物 20 g，酵母提取物 2 g，琼脂 8 g，用水定容至
1 000 mL。pEASY-T3克隆试剂盒及 Trans1-T1 感受
态细胞 (北京全式金公司);TaKaRaLA Taq 酶、
Prime Script 1stStand cDNA Synthesis试剂盒 (大连宝
生物工程有限公司);TRIzol 试剂、Tiangen 2 × Taq
酶 (上海生工生物公司);所用的引物由华大基因
合成。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 基因片段的同源克隆
2014 年 12 月，收集长松萝地衣型真菌菌丝
团，用植物提取试剂盒提取其基因组 DNA。利用
在线简并引物设计软件 Gene Fisher (http: / /bi-
biserv. techfak. uni-bielefeld. de /genefisher2 /)，设计
简并引物 (表 1)，以其基因组 DNA为模板进行巢
式 PCR扩增。PCR体系和反应程序参考王毅等［25］
的体系，稍加改动。1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 2. 2 PCR产物的 T-A克隆
将 PCR 产物回收纯化后连接到克隆载体
pEASY-T3 上，转化到 Trans1-T1 感受态细胞中，
进行蓝白斑筛选。从转化的平板中挑选白斑，接种
到 0. 5 mL的液体培养基中，200 r /min，37℃培养
12 h后，进行菌落 PCR 检测，筛选含插入片段的
51第 1 期 原晓龙等:长松萝中非核糖体肽合成酶 NRPS基因克隆与鉴定
克隆，送到上海生工进行测序。根据测序结果，设
计特异引物 (表 1)，以地衣型真菌的 DNA 为模
板，采用 TAKARA的 Genome Walking Kit试剂盒克
隆获得 UsNRPS基因全长。
表 1 克隆反应中所用引物序列
Tab. 1 The primers sequences in the PCR of cloning
引物名称 序列(5＇-3＇)
Fnrpsnrps ATTGGTGCTGGAACAGGT
RnrpsL2 AACCCGGAAGCTGGCCAAAT
NRPS-FSP1 ATACTTCACTCGTCAGGCTCCA
NRPS-FSP2 TAGATTGCCAGGATTACCGAAG
NRPS-FSP3 TTCTCTATCTGGGACTTCGGTC
NRPS-RSP1 GCTTCTGTTGCTCCATTACCTC
NRPS-RSP2 TGGAAAGATAGTGAAGAACCTCCC
NRPS-RSP3 CTTCGGTAATCCTGGCAATCTA
TNRPKSF TGATACTTCACTCGTCAGGC
TNRPKSR ATGCTTCCGTAGAGCCATAC
1. 2. 3 UsNRPS基因的生物信息学分析
将测序结果用 DNAman去除载体后，通过 NC-
BI对其 DNA序列和氨基酸序列进行 BLAST比对分
析，选择同源性较高的序列并用 MEGA 6. 0 软件进
行聚类分析;理化性质的预测借助于 ProParam 在
线工具;信号肽预测利用 SignalP 4. 1 server;用
Target P 预测其亚细胞定位，用 NCBI 中的 Con-
versed Domain Database数据库搜索 NsNRPS 的结构
功能域;利用 Swiss-Model 在线工具分析蛋白质的
三维结构，并用 Procheck 在线工具构建拉氏构象
图，检测其合理性。生物信息学所用在线工具及其
网址见表 2。
1. 2. 4 UsNRPS基因的半定量表达分析
将收获的长松萝菌丝团分别接种在添加了不同
碳氮源的 MYA 基本培养基上。碳源分别为肌醇、
甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖和果糖，按照 2 %
和 10 % (V /W)2 个不同浓度分别加入基本培养基
MYA中。氮源分别为谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨
酸和丙氨酸，按照 0. 2 %和 1 % (V /W)2 个不同
浓度分别加入基本培养基 MYA中。置于 15℃人工
气候箱培养 2 个月后，获取菌丝团。
表 2 生物信息学在线工具及其网址
Tab. 2 Theonline software of bioinformatics and its websites
在线工具 网址
NCBI http:/ /www. ncbi. nlm. nih. gov /
BLAST http:/ /blast. ncbi. nlm. nih. gov /
ProParam http:/ /web. expasy. org /protparam /
SignalP 4. 1
server http:/ /www. cbs. dtu. dk /services /SignalP /
Target P http:/ /www. cbs. dtu. dk /services /TargetP-1. 1 /output. php
Swiss-Model http:/ / swissmodel. expasy. org
Procheck http:/ /nihserver. mbi. ucla. edu /saves /
Target P http:/ /www. cbs. dtu. dk /services /TargetP /
按照 RNeasy Plant Mini Kit (Qiangen)的说明
书提取不同培养基上的长松萝地衣型真菌总 RNA，
用 1. 2 %的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA质量，将 RNA
保存于 － 80℃冰箱。cDNA 合成参照 Prime Script
1stStand cDNA Synthesis 的说明书操作，并将 cDNA
保存在 － 20℃冰箱。以特异引物 (表 1)检测非核
糖体多肽合成酶 UsNRPS基因的表达情况。
2 结果与分析
2. 1 基因片段的同源克隆
用简并引物 Fnrps和 RnrpsL2，以地衣型真菌的
基因组 DNA为模板，获得保守区域片段，回收纯化
后连接到克隆载体 pEASY-T3 上，选择阳性克隆进
行测序。对测序结果进行分析后，发现其中有一个
约 720 bp的克隆片段含有 NRPS 结构基因片段。根
据这一片段设计特异引物 (NRPS-FSP1、NRPS-
FSP2、 NRPS-FSP3、 NRPS-RSP1、 NRPS-RSP2、
NRPS-RSP3，序列见表 1)。将其经 NCBI 中的
BLASTX比对，结果显示该片段的编码产物与 Eutyp-
alata的 NRPS (GeneBank NO. xp 779494723. 1)的
相应片段具 60 %的相似性。
图 1 UsNRPS基因的开放阅读框
Fig. 1 The open reading frame of UsNRPS gene
61 西 部 林 业 科 学 2016 年
图 2 UsNRPS结构域活性位点分析
注:Oi为 Oidiodendron maius Zn NRPS (KIM98444);Pe 为 Pestalotiopsis fici NRPS (XP007833606);Gl 为 Glarea lozoyensis
NRPS (XP008079965);Sp为 Sporoth rixschenckii NRPS (ERT01323);所有保守氨基酸残基用* 标记，两个氨基酸的变化用
. 表示。
Fig. 2 Alignment of Usnea longissima predicted non-ribosomal peptidessynthetases (NRPS)
active sites with five closely fungal NRPS
2. 2 UsNRPS基因全长的获得
用 Genome Walking Kit试剂盒，设计特异引物，
以地衣型真菌 DNA 为模板，获得了 UsNRPS 基因。
利用 NCBI-ORF Finder 上进行开放阅读框的的查找
和翻译，得到了 3个开放阅读框，全长3 057 bp，比
对 DNA和 cDNA序列发现 UsNRPS基因含有 2 个内
含子 (从起始密码子开始依次为 1 522-1 568、
1 830-1 895)和 5 ＇端、3 ＇端的非编码区 (图 1)。3
个外显子拼接总长 1 686 bp，编码氨基酸残基 561
个。通过 BLAST 比对发现，该基因有 1 个功能结
构域，即腺苷酰化结构域 (AFD Class Ⅰ超酶家
族)其保守活性位点为 HSSGSTG-PKP-FH-YGSTE
(图 2)，其主要功能为识别、活化特定的氨基酸，
并将其结合、传递到下一个结构域上，形成氨酰-
AMP复合物。对 UsNRPS基因的 5＇和 3＇端的非编码
区进行 BLAST 比对，未发现与其同源的蛋白质序
列。
2. 3 UsNRPS的生物信息学分析
2. 3. 1 UsNRPS的理化性质分析
用在线软件 ProtParam预测 UsNRPS蛋白氨基酸
残基序列的理化性质，相对分子质量为 62 656. 7，
结构式 C2820H4399N755 O821 S20，等电点 6. 00，半衰期
20 h，脂肪系数 85. 26，不稳定系数 40. 56。不稳
定系数在 40 以上为不稳定蛋白［26］，可能是过渡蛋
白，性质不稳定。SignalP分析结果显示，UsNRPSs
不存在信号肽，是一种非分泌蛋白，直接在细胞质
合成。采用 Target P软件预测其亚细胞定位，结果
表明其蛋白位于细胞质基质中。
2. 3. 2 分子系统进化分析
用 MEGA对 UsNRPS 和其他 11 条同源蛋白序
列进行 Cluster 比对，利用邻位连接法绘制系统进
化树。结果 (图 3)显示，长松萝的 NRPS 蛋白与
Rasamsonia emersonii AFD (KKA21664)、Talaro-
myces marneffei AFD (XP 002143737)、Talaromy-
cess tipitatus AFD (XP 002477949)的蛋白聚为一
类，与酰基 CoA 连接酶 (ACS)和 4-香豆酸-CoA
连接酶 (4CL)的亲缘关系较远。4CL、ACS 和腺
苷酰化结构域 (AFD)同属于酰苷酸合成酶超家
族，它们通过不同的保守的腺苷酸结合基序界定，
它们的功能与氨基酰-tRNA合成酶的功能相似，即
识别、活化特定的氨基酸。
71第 1 期 原晓龙等:长松萝中非核糖体肽合成酶 NRPS基因克隆与鉴定
图 3 UsNRPS与其他 20 条同源序列的分子系统进化分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of UsNRPS and another 20 homologous sequences
2. 3. 3 UsNRPS蛋白质三维结构预测
利用在线软件 Swiss-Model 获取蛋白质的同源建
模结果，预测该蛋白质 Phi (φ)和 Psi (ψ)角的分
布方式，利用 RasMol预测 UsNRPS 蛋白质的三维结
构，并用在线软件 PROCHECK 对建模结果进行分
析。结果显示，在二级结构 αβαβα结构的基础上形
成了较为致密的球状结构 (图 4A)。PROCHECK分
析同源建模的结果，氨基酸残基的 φ、ψ 角均位于
区域核心，证明其空间结构较为稳定，符合其对应
天然蛋白质的构象。
A B
图 4 UsNRPS蛋白的三维结构模型 (A)和拉氏构象图 (B)
Fig. 4 The putative 3D structure (A)and Ramachandram of UsNRPS protein (B)
2. 4 不同碳氮源对 UsNRPS基因的诱导表达情况
的检测
以微管蛋白 (tublin)为参照，TNRPKSF、
TNRPKSR作为特异引物检测 UsNRPS 基因的诱导
表达情况。RT-PCR 结果 (图 5)显示，NRPS 基
因在 MYA基本培养基和添加了天冬氨酸的培养基
上不表达，在添加了 2 %肌醇、10 %甘露醇、2 %
山梨醇、2 %葡萄糖、10 %葡萄糖、0. 2 %谷氨酰
胺、1 %甘氨酸、0. 2 %丙氨酸上有微弱表达。在
添加了浓度为 10 %肌醇、2 %甘露醇、10 %山梨
81 西 部 林 业 科 学 2016 年
醇、1 %谷氨酰胺、0. 2 %甘氨酸的 MYA 培养基
上表达强烈。在含 2 %、10 %蔗糖和果糖的 MYA
培养基上均能诱导 NRPS基因的强烈表达，但在含
浓度为 2 %、10 %葡萄糖的 MYA培养基都只有微
弱的表达。
图 5 UsNRPS在添加不同碳氮源的 MYA培养基上的诱导表达情况
注:CK为 MYA基本培养基;A为添加不同碳源;Ino为肌醇;Man为甘露醇;Sor为山梨醇;Sur为蔗糖;Glu为葡萄糖;
Fru为果糖;2，10 分别代表 2 %，10 %;B为添加不同氮源;Gmi为谷氨酰胺;Asp为天冬氨酸;Gly为甘氨酸;Ala为丙
氨酸;0. 2，1 代表 0. 2 %，1 %。
Fig. 5 Gene inducible expression of UsNRPS with different carbon source and amino acid
3 讨论
长松萝是一种松萝科 (Usneaceae)松萝属
(Usnea)的地衣型植物，主要生于北半球原始森
林的冷杉 (Abies fabri)、云杉 (Picea asperata)及
松科 (Pinaceae)植物上，因长松萝具清热解毒、
止咳化痰、消炎等功效而被广泛当做民族药材使
用［27］。长松萝中含有许多抗癌、消炎及抗菌的化
合物，如长松萝的地衣丝状体中含巴尔巴地衣酸、
松萝酸、地弗地衣酸、地衣聚糖、长松萝多糖、扁
枝衣酸乙酯等［28 ～ 29］，还含有具药用价值的多肽类
次生代谢产物。长松萝中有地衣型真菌和非地衣型
内生真菌，因此本研究采取藻菌分离技术获取长松
萝的地衣型真菌，并以长松萝地衣型真菌为研究对
象研究长松萝中 NRPS的诱导合成。
本研究利用同源克隆获得 NRPS 基因片段，根
据此片段设计特异引物，以地衣型真菌 DNA 为模
板，采用 Gene walking 的方法克隆得到 UsNRPS 基
因的 A结构域全长。结合 BLAST比对和结构域分析
显示，NRPS的 A结构域能独立地行使其功能，是一
个具独立活性的酶。利用同源序列构建系统进化树，
UsNRPS蛋白和 Rasamsonia emersoniiAFD(KKA21664)、
Talaromyces marneffeiAFD(XP 002143737)、Talaro-
myces stipitatusAFD(XP 002477949)蛋白聚为一类，
与结构域分析相一致，其主要功能为识别、活化特
定的氨基酸，即与特定的氨基酸结合形成氨酰-
AMP复合物。NRPS的 A结构域的特异性是由其中
部的约 200 个氨基酸残基组成核心基序决定的，结
合 Torsten 等的研究［30］，本研究中长松萝 NRPS A
结构域的保守活性位点 HSSGSTG-PKP-FH-YGSTE
可能是特性识别某些非极性氨基酸。生物信息学分
析结果显示，UsNRPS 不存在信号肽，定位于细胞
质基质中，是一种性状不稳定的中间产物合成酶，
可能参与形成 NRPS;其蛋白质三维结构同 Eutypa
lata 的 NRPS 三维结构基本一致，均是在 αβαβα
二级结构的基础上形成了致密的蛋白质三维立体结
构［31］。
渗透压和不同碳氮源添加物影响地衣型真菌的
次生代谢产物和诱导产物的合成［32］。利用 RT-PCR
检测添加了不同碳氮源的 MYA培养基上的 UsNRPS
基因的表达情况，实验结果显示，在 MYA 基本培
养基上 UsNRPS 基因不会表达，但在添加了不同碳
氮源的培养基上，会不同程度地部分诱导表达，蔗
糖和果糖会强烈地诱导 UsNRPS 基因的表达。不同
的碳氮源能够影响地衣型真菌产物次生代谢产物的
产生，王毅等［25］在研究长松萝聚酮合酶的过程中，
发现 10 %的山梨醇和蔗糖 (2 %和10 %)能够强
91第 1 期 原晓龙等:长松萝中非核糖体肽合成酶 NRPS基因克隆与鉴定
烈地诱导 UlPKS 基因的表达。许灵波等［33］也发现
不同的碳氮源对银杏 (Ginkgo biloba)内生真菌能
够明显地促进次生代谢产物的合成。NRPS 的 A 结
构域识别特定的底物并将其活化成氨酰基腺苷
酸［34］。不同的 A 结构域识别不同的氨基酸，结合
本研究中 A 结构域的诱导表达情况，天冬氨酸的
极性最高，不能诱导 A 结构域的表达，可能不是
其底物;而相对应的谷氨酰胺和丙氨酸的极性较
低，能够随着浓度的增加而提高诱导的效率;而甘
氨酸是一种不带电荷的极性氨基酸，极性程度较
低，能够在较低浓度的情况下诱导 A 结构域的表
达，随着浓度的增加其诱导表达效率会相应地降
低;本研究所克隆的 UsNRPS的 A结构域可识别谷
氨酰胺 (Gmi)和丙氨酸 (Ala)，对较低浓度的甘
氨酸 (Gly)具有较高的敏感度。在地衣型真菌
中，非核糖体肽在长松萝中为首次发现，结合其诱
导表达情况，可能是在长松萝生长过程中，合成并
能够促进其地衣体生长的次生代谢物，仅在地衣体
生长旺盛时诱导表达。本实验从长松萝地衣型真菌
中首次克隆到了 NRPS基因的 A结构域的全长，并
检测其在不同碳氮源的培养基中的表达情况，为利
用工程菌发酵获得非核糖体肽类物质奠定基础，提
供必要材料。
参考文献:
［1］郑宗明，顾晓波，余海青，等． 非核糖体肽合成酶主
要结构域的研究进展［J］．中国抗生素杂志，2005，30(2):120
－ 124．
［2］Robert Finking，Mohamed A． M． Biosynthesis of non-
ribosomal peptides［J］． Microbiology，2004(58):453 － 488．
［3］Yakimov M，Giuliano M L，Timmis K N，et al． Recom-
binant acylhepta peptide lichenysin:high level of production by
Bacillus subtilis cells［J］． Journal of Molecular Microbiology Bio-
technology，2000，2(2):217．
［4］Rolston K V，Segreti J，Lamp K C，et al． Cubicin out-
comes registry and experience(CORE)methodology［J］． Ameri-
can Journal of the Mediccal Sciences，2007，120(10):44 － 56．
［5］王燕，王真，何琪杨． 博莱霉素族抗生素作用机制的
研究进展［J］．国外医药(抗生素分册)，2009，30(1):5 － 18．
［6］姚琳，郭东林． PKS-NRPS 数据库的研究进展［J］．
中国农学通报，2009，25(16):280 － 283．
［7］Huma Yonus，Piotr N，Stephan Z，et al． Crystal structure
of DltA:implications for the reaction mechanism of non-riboso-
mal peptide synthetase adenylation domains［J］． The Journal of
Biological Chemistry，2008，283(27):32484 － 32491．
［8］Gregory L C，Jacques R，Craig A T． Predictive，struc-
ture-based model of amino acid recognition by nonribosomal pep-
tide synthetase adenylation domains［J］． Chemistry ＆ Biology，
2000，7(3):211 － 224．
［9］Mootz H D，Schwarzer D，Marahiel M A． Ways of as-
sembling complex natural products on modular non-ribosomal
peptide synthetases［J］． Biochemistry，2002，3(6):490 － 504．
［10］Reuter K，Mofid M R，Marahiel M A，et al． Crystal
structure of the surfactin synthetase activating enzyme Sfp:an
prototype of 4＇-phosphopantetheinyl transferases superfamily［J］．
EMBO Journal，1999，18(23):6823．
［11］Henning D． M，Mohamed A． M． Biosynthetic systems
for non-ribosomalpeptide antibiotic assembly［J］． Current Opin-
ion in Chemical Biology，1997，1:543 － 551．
［12］Gregory L C，Jacques R． Coelichelin，a new peptide
siderophore encoded by the Streptomyces coelicolor genome struc-
ture prediction from the sequence of its non-ribosomal peptide
synthetase［J］． FEMS Microbiology Letters，2000，187(2):111
－ 114．
［13］Chang，K H，Xiang，H，Dunaway-Mariano D． Acyl-ade-
nylate motif of the acyl-adenylate / thioester-forming enzyme su-
perfamily:A site-directed mutagenesis study with the Pseudo-
monas sp． strain CBS3 4-Chlorobenzoate:Coenzyme A ligase
［J］． Biochemistry，1997，36:15650 － 15659．
［14］Weber，T，Marahiel，M． A． Exploring the Domain
Structure Minireview of Modular Nonribosomal Peptide Syntheta-
ses［J］． Structure，2001，9:3 － 9．
［15］陈威，朱鹏，何山，等． 海洋细菌 Pseudoalteromonas
sp． NJ631 中 NRPS基因簇及核心模件的发掘［J］．微生物学
报，2012，52(12):1531 － 1539．
［16］Misiek M，Braesel J，Hoffmeister D． Characterisation of
the Arm adenylation domain implies a more diverse secondary
metabolism in the genus Armillaria［J］． Fungal Biology，2011，
115(8):775 － 781．
［17］陈建斌． 地衣二元性及其概念的双重理解与思考
［J］．生物多样性，1994(4):228 － 230．
［18］魏江春． 中国药用地衣［M］． 北京:科学出版社，
1982．
［19］牛东铃，王立松，张颖君，等．地衣次生代谢产物及
其生物活性研究进展［J］． 天然产物研究与开发，2007，19:
1079 － 1086．
［20］Li J，Zhang Y S． Increase of betulinic acid production
in Saccharomyces crevisiae by balancing fatty acids and betulinic
acid forming pathways［J］． Applied genetics and molecular bio-
technology，2014，98:3081 － 3089．
［下转第 24 页］
02 西 部 林 业 科 学 2016 年
85. 6 %，植株生长健壮，叶片宽大，增重明显;而
在其他 2种基质中移栽成活率在 51. 2 % ～ 73. 2 %，
植株增重不明显，叶片偏小，特别是泥土和珍珠岩
配比的基质，由于通透性较差，根容易腐烂。
3 讨论
滇越金线兰喜在阴凉、湿润地方生长，茎干粗
壮，叶片宽大，单株生物量平均 2. 5 g 以上。适宜
的人工栽培条件下密植有利于提高其单位面积产
量，但野生植株体在野外阴湿地区生长，携带大量
细菌、真菌等微生物，以致在组培初代培养时，污
染率偏高。本试验采用次氯酸钠和 HgCl22 次灭菌
处理外植体，能有效地降低污染率，提高诱导率，
无菌体系一旦建立，即可转入增殖培养基中继代培
养，可快速建立无菌繁育体系。
本试验发现，滇越金线兰对细胞分裂素比较敏
感，添加的 0. 5 mg /L BA，即可诱导丛生不定芽，
细胞分裂素添加过多，会刺激金线兰基部茎萌蘖大
量芽，通过调节激素，诱导腋芽萌发侧芽，切割侧
芽，诱导萌发下一级侧芽，从而快速有效地建立起
快繁体系，但激素添加过多，丛芽太细，种植后单
株产量太低，植株抗逆性差，易得病，应适当控制
激素的添加比例，保持适当合理的增殖率。
滇越金线兰很容易生根，添加吲哚丁酸或萘乙
酸即可生根，但两者适当比例配比，生根率会得到
极大提高;移栽时选疏松、透气、富含有机质的腐
质土，能有效地提高其成活率及单位面积生长量。
参考文献:
［1］中国科学院中国植物志编委． 中国植物志(第 17
卷)［M］．北京:科学出版社，2006:224 － 225．
［2］张铁，万京，沐建华．文山地区金线莲种质资源初步
调查［J］．文山师范高等专科学校学报，2005，18(1):26 －
28．
［3］赵林，朱恩，蔡金艳．滇越金线兰中 2 个丁酸衍生物
对 HepG2 细胞胰岛素抵抗改善作用的实验研究［J］．中药新
药与临床药理，2014，25(7):393 － 396．
［4］蔡金艳，王义娜，朱恩，等． 滇越金线兰对高脂饮食
联合 STZ诱导的大鼠血糖、血脂和肾功能的影响［J］． 中药
新药与临床药理，2012，28(2):116 － 119．
［5］王义娜，蔡金艳，赵林，等． 滇越金线兰化学成分研
究［J］．中药材，2012，35(6):911 － 913．
［6］蔡文燕，肖华山，范秀珍．金线莲研究进展［J］．亚热
带植物科学，2003，32(3):68 － 72．
［7］刘庆昌，吴国良．植物细胞组织培养［M］． 北京:中
国农业大学出版社，2002:
檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭
240．
［上接第 20 页］
［21］王晗，王永，纪燕玲，等． 分离自黑茶的散囊菌属真
菌中的 NRPS基因的检测和分布［J］．微生物学通报，2013，
40(3):464 － 475．
［22］朱鹏，郑立，林晶，等． 抗菌和细胞毒活性海洋细菌
的筛选及其次生代谢基因证据［J］． 微生物学报，2007，47
(2):228 － 234．
［23］陆胜利，祁超． 海洋放线菌 S． areniocola CNS-205
腺苷化结构域基因的克隆、表达和纯化［J］．华中师范大学学
报(自然科学版)，2014，48(6):876 － 884．
［24］彭玉娇，李敬龙，林学政． 极地抗植物病原真菌活
性菌株 PKS和 NRPS基因的克隆与分析［J］．海洋科学进展，
2014，32(3):396 － 404．
［25］王毅，周旭，许宰铣，等． 长松萝中一个聚酮合酶基
因簇的克隆和鉴定［J］．微生物学报，2014，54(7):770 － 777．
［26］薛庆中． DNA 和蛋白质序列数据分析工具［M］．
北京:科学出版社，2010:75 － 106．
［27］靳菊情，石娟，葛萍，等． 长松萝多糖对小鼠免疫功
能的影响［J］．中国药学杂志，2003，38(6):431 － 432．
［28］拉喜那木吉拉，包海鹰，图力古尔． 松萝属地衣类
化学成分及药理活性研究进展［J］．中国中药杂志，2013，38
(4):539 － 545．
［29］叶嘉，张浩，张宁． 不同海拔高度黄梅衣属地衣松
萝酸含量的测定［J］． 湖北农业科学，2014，53(6):1415 －
1417．
［30］Torsten S，Henning D M，Marahiel M A． The specifici-
ty-conferring code of adenylation domains in nonribosomal pep-
tide synthetases［J］． Chemistry ＆ Biology，1999，6:493 － 505．
［31］Barbara B． U，Philippe E． R，Dario C． Draft genome
sequence of the grapevine dieback fungus Eutypalata UCR-EL1
［J］． GenomeAnnounce，2013，1(3):e00228 － 13．
［32］Valarmathi R，Hariharan GN，VenkataramanG，et al．
Characterization of a non-reducing polyketide synthasegene from
lichen Dirinaria applanata［J］． Phytochemistry，2009，70(6):
721 － 729．
［33］许灵波，申屠旭萍，陈宵峰，等． 银杏内生真菌 No．
1028 的培养条件及其代谢产物对作物真菌病害的抑制作用
［J］．菌物研究，2006，4(2):25 － 29．
［34］朱鹏．珍珠膜海绵共附生微生物 PKS与 NRPS的筛
选与模块结构研究［D］．杭州:浙江大学，2008．
42 西 部 林 业 科 学 2016 年