全 文 ：第18卷第 8期
20 01年 8月
精 细 化 工
FINE CHEMICALS
Vol.18 , No.8
Aug.2 0 0 1
食品与饲料添加剂
金盏菊中叶黄素的分离纯化及高效
液相色谱的测定方法
杜桂彩 ,滕大为 ,李荣贵 ,郭群群
(青岛大学 天然色素研究所 山东省重点实验室,山东 青岛　266071)
摘要:金盏菊萃取物 15 g , 加入 30 mL正丁醇 , 密封搅拌均匀后(55 ℃),加入 30 mL w(NaOH)=
20%的水溶液 ,反应 7 h(70 ℃);皂化物中加入 300 mL水 ,搅拌均匀 ,过滤 ,然后依次用 30 mL乙
醇和 50 mL正己烷冲洗 ,得到叶黄素 , 纯度为 w(C40H56O2)=71.2%。确定了金盏菊中叶黄素的
液相色谱测定方法 ,流动相为 V(CH2Cl2)∶V(CH3OH)∶V(CH3CN)∶V(H2O)=32∶38∶29∶1 , 得到了
叶黄素和 15 种叶黄素酯的峰 ,叶黄素的保留时间为 3.681 min ,叶黄素酯的保留时间分布为 4.5
～ 12.0 min;在流动相中它们的最大吸收波长都为454 nm。叶黄素的线性范围为0.1～ 1.0μg ,相
关系数为 γ=0.9998。
关键词:叶黄素;皂化;高效液相色谱法;金盏菊;分离;纯化
中图分类号:TQ914.1;TS202.3　　文献标识码:A　　文章编号:1003-5214(2001)08-0467-03
　　叶黄素是胡萝卜素的含氧衍生物 ,它的分子结
构式为:
　　叶黄素在食品和饮料中用作着色剂来调节食品
和饮料的色泽;它还可作为饲料添加剂添加到禽类
饲料中 ,禽类食之后蛋黄色泽诱人;另外叶黄素还具
有防止老年人视黄斑退化和预防癌变的作用 。
金盏菊中叶黄素含量非常高 ,其他类胡萝卜色
素含量非常低 ,是提取叶黄素的理想材料。金盏菊
中游离叶黄素非常低 ,大都被月桂酸 、豆蔻酸 、棕榈
酸等修饰 ,以叶黄素酯的形式存在 ,不易被人体吸
收;而人类功能性食品添加剂对叶黄素的纯度要求
很高 ,所以开发与之相适应的功能性叶黄素产品以
造福人类具有重大意义。作者对叶黄素的分离纯化
工艺进行了研究 ,通过皂化等方式获得高纯度的叶
黄素。另外 ,目前虽然有许多类胡萝卜素的高效液
相色谱的测定方法[ 1～ 3] ,但对金盏菊中叶黄素的测
定都不太理想。因为金盏菊中的色素主要是由不同
的叶黄素酯组成 ,而文献[ 1]中的方法主要是利用正
相高压液相色谱法来分离类胡萝卜素的正相和反相
同分异构体 ,不适用于不同叶黄素酯之间的分离;文
献[ 2]中的方法主要是用于类胡萝卜素与叶绿素等
色素之间的分离 ,乙腈用量过大 ,不同的叶黄素酯之
间的分离效果不理想。因此 ,作者也对金盏菊中叶
黄素的高效液相色谱法测定进行了研究。
1　实验
1.1　试剂与仪器
金盏菊花的正己烷提取物为市售商品 ,叶黄素
标准品购自 Sigma 公司 ,液相色谱分析试剂为色谱
纯 ,其余试剂为分析纯 。高效液相色谱仪由日本岛
津公司生产 。
1.2　色谱分析条件
色谱柱是岛津 VP -ODSC18 柱(150 mm ×4.6
mm , 4 μm),检测波长 454 nm ,洗脱剂:V(CH2Cl2)
∶V(CH3OH)∶V(CH3CN)∶V(H2O)=32∶38∶29∶1 ,
流速为 0.5 mL/min ,温度为室温。
1.3　叶黄素酯的分离与纯化
将金盏菊的正己烷萃取物(15 g)和正丁醇(30
mL)加到反应器中 ,在 55 ℃(密封搅拌)条件下充分
混合均匀 ,然后加入 w(NaOH)=20%的水溶液 30
mL ,温度升至 70 ℃后 ,反应 7 h ,停止皂化 。皂化后
的叶黄素酯中加入 300 mL 的蒸馏水并搅拌均匀 ,过
滤叶黄素粗品 ,析出的叶黄素粗品分别用 30 mL 乙
醇和50 mL正己烷冲洗。
1.4　标准曲线的制备
收稿日期:2000-12-20
DOI :10.13550/j.jxhg.2001.08.012
精确称取 0.1 g 叶黄素标准品 ,用二氯甲烷溶解
后 ,定容至2 mL ,使其质量浓度为 0.05 g/mL ,然后用二
氯甲烷依次稀释成系列质量浓度:0.04、0.025、0.02、
0.01 、0.005 g/mL ,最小质量浓度为1×10-5 g/mL。
2　实验结果
2.1　叶黄素高效液相色谱的分析结果
叶黄素标准品的色谱图见图 1 ,叶黄素样品的
色谱图见图2。
图1　叶黄素标准品的色谱图
图 2　叶黄素样品的色谱图
　　从图 1可看出 ,叶黄素标准品的保留时间为 3.681
min ,样品中叶黄素的保留时间为 3.679 min ,与标准品
的保留时间基本一致 ,但其含量非常低;叶黄素大都以
各种酯的形式存在 ,它们的保留时间为4.0 ～ 13.0 min ,
其中有两个分布区 ,第一个为4.5 ～ 6.0 min ,第二个为
8.0 ～ 12.0min ,它们的保留时间差异主要是由叶黄素所
连脂肪酸的种类及数量的不同引起的。从图3可看出
第二个分布区的叶黄素酯比较容易皂化 ,比第一个分
布区的叶黄素酯皂化彻底。但是这十几种叶黄素酯的
最大吸收峰还是比较类似的 ,都在454 nm 左右。在实
验之初 ,作者参照文献[ 3 ,4]进行分析 ,发现叶黄素与叶
黄素酯没有分开 ,只有一个峰 ,并且保留时间短 ,峰面
积与上样量不成正比。通过文献[ 2]分离发现不同的
叶黄素酯之间不易分开 ,保留时间过短而且有拖尾现
象存在。后来实验发现增加二氯甲烷 ,改变甲醇与乙
腈之间的比例 ,能够改变叶黄素与叶黄素酯的保留时
间;通过不断调整洗脱剂中溶剂的比例 ,发现当洗脱剂
为 V(CH2Cl2)∶V(CH3OH)∶V(CH3CN)∶V(H2O)=32∶38∶
29∶1时 ,可以获得比较理想的分离效果和很高的回收
率(如图1 、2),用该洗脱剂对金盏菊花的正己烷提取物
进行分析 ,结果表明 ,叶黄素与叶黄素酯的分离效果明
显(图 2),用叶黄素标准品进行分析表明 ,该方法叶黄
素的回收率可达 99%。
2.2　分离纯化的结果
图 2是样品处理前叶黄素的色谱图 ,从图 2中
可看出在未皂化前游离叶黄素的含量非常低 ,而叶
黄素酯的含量非常高 ,杂峰较多。但随着皂化时间
的增加 ,叶黄素含量逐渐增高而叶黄素酯含量逐渐
降低 ,最后几乎全部的叶黄素酯转化为游离的叶黄
素 ,如图 3 、4。皂化后的叶黄素粗品中 w(C40H56O2)
=71.2%,得率为 30%,比 Khachik[ 6]的方法提高了
10%左右 ,且产物后处理容易。
图 3　皂化 5 h后叶黄素的色谱图
图 4　皂化10 h后叶黄素的色谱图
2.3　标准曲线的获得
以峰面积-质量浓度作图(图 5),叶黄素质量
为 0.1 ～ 1.0 μg 时 ,呈良好的线性关系 ,回归方程 Y
=595558.16+423890020 X , γ=0.9998 , 叶黄素的
最小检测量是0.001μg 。
图 5　叶黄素标准曲线
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3　讨论
金盏菊中除叶黄素外 ,其他色素含量非常低 ,是
提取叶黄素的理想材料 。叶黄素对光 、温度特别敏
感 ,极易被氧化 ,因此叶黄素的分离提纯需要在避
光 、密封 、低温的条件下进行。用乙醇洗涤是为了去
除沉淀中的甾醇类物质 ,最后正己烷洗涤去除了大
部分的隐黄质 、胡萝卜素 ,同时洗掉残余乙醇 。
Nyambaka[ 5]等报道增加洗脱剂中水的含量可以
通过增加保留时间而使叶绿素和类胡萝卜素达到很
好的分离效果 ,但有拖尾现象 ,而作者发现增加水的
比例并没有改变叶黄素与叶黄素酯之间的分离效
果。Nyambaka[ 5]等还报道增加二氯甲烷的比例可以
减小拖尾 ,也缩短保留时间 ,但作者发现增加二氯甲
烷的比例延长了叶黄素与叶黄素酯的保留时间 ,并
非缩短了保留时间 。当作者按照文献[ 4]的方法进
行实验时 ,样品只有一个峰 ,峰面积非常小 ,保留时
间是 3.321 min;当用二氯甲烷冲洗柱子时 , 用 454
nm波长检测时发现一个特大峰 ,说明还有许多叶黄
素和叶黄素酯吸附在柱子上 ,该种方法不适于金盏
菊中叶黄素的测试 。按照文献[ 2]的方法进行实验
时 ,不同的叶黄素酯之间分离效果不好 ,有许多叶黄
素酯的峰发生了重叠 ,这可能是由于乙腈比例太高
所致 ,当增高二氯甲烷和甲醇的比例时 ,叶黄素酯的
保留时间增加 ,叶黄素与叶黄素酯逐渐分开 ,当各组
分的比例达到 V(CH2Cl2)∶V(CH3OH)∶V(CH3CN)∶
V(H2O)=32∶38∶29∶1 时 ,分离效果很好 ,叶黄素与
叶黄素酯及不同的叶黄素酯之间完全分开 。
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f rom saponified marigold oleoresin and uses thereof [ P] .US:53 827
142, 1995-01-17.
作者简介:杜桂彩(1971-),女 , 山东省青岛市人 , 1996 年毕
业于华东师范大学生物系 , 获硕士学位 , 现为青岛大学天然
色素研究所助理研究员 , 从事天然产物的分离提取及功能研
究 , 已发表多篇文章。
Isolation and Purification of Lutein in Marigold and Its Determination by HPLC
DU Gui-cai ,TENG Da-wei ,LI Rong-gui ,GUO Qun-qun
(The Key Laboratory of Shandong Province , The Natural Pigment Institute , Qingdao University , Qingdao 266071 , China)
Abstract:Marigold extraction was homogenized with butanol under sealed condition at 55 ℃, and then was subjected to
saponification with NaOH〔 w(NaOH)=20%,30 mL〕 for 7 h at 70 ℃.The saponified product was mixed with 300 mL
distilled water and filtered and the retained orange precipitate of lutein was washed with 30 mL ethanol and 50 mL n-
hexane successively.The purity of resulting lutein was w(C40H56O2)=71.2%by HPLC analysis.An improved HPLC
method was developed for the analysis of lutein in marigold , the mobile phase was V(CH2Cl2)∶V(CH3OH)∶V(CH3CN)
∶V(H2O)=32∶38∶29∶1 and the detecting wavelength was 454 nm.The linear range was 0.1 ～ 1.0μg ,γ=0.9998。
Key words:lutein;saponify;HPLC;marigold;isolation;purification
新材料发展现状及 21世纪发展趋势研讨会
中国工程院化工 、冶金与材料工程学部第三届学术会定于 2001.9.16 ～ 20在西安召开 ,会议将对新材料
发展现状及21世纪发展趋势 ,材料科学的一些新的热点学科和研究前沿以及对策进行广泛的学术交流与讨
论 ,同时为促进中西部材料科技发展做出贡献 。 [葛摘自《中国化工信息网网讯》 ,2001 ,(27):19]
·469·第 8 期 杜桂彩 , 等:金盏菊中叶黄素的分离纯化及高效液相色谱的测定方法