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实
验
研
究
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当药苦苷体内向香豆素类化合物转化过程的研究
★ 李胜 (鹰潭市人民医院药剂科 江西 鹰潭 335000)
摘要:目的:探究当药苦苷体内向香豆素类化合物转化的过程。方法:通过设计化学衍生化 － LC /MS 的方法对可能代谢物进
行检测，当药苦苷的体外主要的代谢产物为红百金花内酯，于是采用衍生化的方法提高其检测灵敏度。再经过动物实验和肝
微粒孵育进行验证。结果:样品处理后经 LC /MS经色谱测定后，专属性、精密度和准确度、稳定性等均满足生物样品分析，大
鼠血浆中 ECＲ定量分析，平均最高血药浓度、最长吸收时间、最大药时曲线面积分别为 425． 8 ± 127． 6ng /mL，128． 6min，38．
8μg /mL·min。结论:大鼠灌胃当药苦苷后血浆经衍生化，成功在血浆中检测到了红百金花内酯，当药苦苷首先在体内被水解
变成苷元，大部分苷元经重排变成红百金花内酯，一个二氢香豆素，首次阐明了当药苦苷的大鼠体内代谢产物，发现其可以由
单萜类化合物转化为生物碱类和香豆素类化合物，并以代谢物的形式发挥药效。丰富了环烯醚萜类化合物的体内代谢研究
方法。
关键词:当药苦苷;香豆素;化学衍生化
中图分类号:Ｒ284． 1 文献标识码:A
Study on the Transformation Process of Swertiamain in Medicine to Coumarins
LI Sheng
People＇s Hospital of Yingtan，Pharmacy Department，Yingtan 335000，China．
Abstract:Objective:To explore the process of medicine of swertiamarin in vivo transformation to coumarins． Methods:Through the de-
sign of chemical derivative method － LC /MS of metabolites were detected，Swertia bitter glycosides in vitro primary metabolites as
erythrocentaurin，so the use of derivative of the methods to improve the detection sensitivity． The animal experiment and the liver mi-
crosomal incubation were carried out to verify the． Ｒesults:The specificity，precision，accuracy and stability of the samples were ana-
lyzed by LC /MS，and the average blood concentration，the maximum absorption time and the maximum drug curve were 425． 8 ± 127．
6ng /mL，128． 6min，38． 8μg /mL·min respectively． Conclusion:Ｒat irrigation stomach Swertia bitter glycosides by plasma via deriving
biochemical，success in the plasma detected erythrocentaurin，Swertia bitter glycoside first in vivo was hydrolyzed into aglycones． Most
of the aglycone by rearrangement into erythrocentaurin，a Dihydrocoumarin first clarify Swertia bitter glycosides of rats in vivo metabo-
lites，found that it can into the monoterpene compounds of alkaloids，coumarins，and its metabolites in the form of play a pharmacody-
namics． Study on the metabolism of the compounds in the body of the cyclic ethers．
Key words:Swertia Gentiopicroside;Coumarin;Chemical Derivatization
当药苦苷是獐芽菜属植物中分布最广、含量最
高的裂环烯醚萜氧糖苷类成分之一。相关研究［1 － 2］
表明当药苦苷具有清肝利胆、解痉镇痛、降低血脂和
消炎抑菌等药理作用，由于其具有较强的生物活性
且拥有丰富的资源，具备深入研究开发的潜力，主要
转化产物是红百金花内酯，为探索该代谢物的存在，
本文采用衍生化 － LC /MS 的方法进行观察，并通过
动物实验和肝微粒孵育进行验证。
1 材料
1． 1 试药 当药苦苷(纯度 ＞ 98%)、红百金花内
酯(纯度 ＞ 98%)。DNPH(2，4 －二硝基苯肼) ，内标
MFB(4 －甲酰苯甲酸甲酯)购于 sigma 公司。色谱
级乙腈购于德国 Merck 公司。色谱甲醇购自美国
Fisher公司。去离子水购自广州屈臣氏。Wistar 大
鼠(250 ± 10)g(黑龙江中医药大学动物实验中心)。
1． 2 仪器 Agilent 1200 超高效液相色谱(美国
Agilent公司) ;色谱柱采用 Hypersil GOLD C18 色谱
柱(50mm ×2． 1mm 粒径 1． 9μm) (Thermo Fisher Sci-
entific，Waltham ，MA) ;柱温 30℃;进样量为 5ΜL;
流动相 A 为 1%甲酸和水，流动相 B 为 1%甲酸和
·07·
江 西中医药大学学报2015年12月第27卷第6期
JOUＲNAL OF JIANGXI UNIVEＲSITY OF TCM 2015 Vol. 27 No. 6
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验
研
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乙腈，流速 0． 4mL /min 。洗脱程序如下:0min 20%
B，2． 5 min，40% B;4 min，99% B;5 min 20% B，
最后平衡 1min，总时间为 6min ．质谱检测条件:Agi-
lent 6520 质谱(美国安捷伦公司)，毛细管电压
4000V，裂解电压 100V，喷雾压力 45 psi，干燥气体
(N2)流速 9L /min，干燥气体温度 330℃，检测范围
100 － 1000Da．检测离子:伯醇衍生物 m/z 355． 0684
［M + H］ +，内标物衍生物 m/z 343． 0684［M +
H］+。
2 方法和结果
2． 1 样品处理 在进行大鼠血浆中红百金花内酯
衍生化 － LC /MS 方法的建立与大鼠灌胃给药后，
(1)红百金花内酯体外衍生化过程，分别向 500μL
2． 273mmol /L ECＲ 乙腈溶液，和 500μL 1． 22 mmol /
L MFBC 乙腈溶液。混合后的溶液 37℃放置 1h。
3mL乙酸乙酯:正己烷(1:5)加入到混合溶液中，涡
旋，室温静置分层。上层溶液 25℃ N2 吹干，残渣
500μL甲醇复溶，LC － ESI － MS 分析。(2)给药后
的大鼠血浆样品衍生化 200mg /kg 当药苦苷水溶液
灌胃给大鼠，0． 17，0． 33，0． 5，1，2，4，6，8，10，12，24，
36 和 48h采血。200μL血浆中加入 600μL乙腈，涡
旋 30s，4℃ 12000rpm 离心 10min，留上层溶液。取
500μL上清液加入到 EP 管中，进行衍生化。方法
同红百金花内酯体外衍生化。(3)标准溶液的配置
精密称取一定量的 ECＲ，MFBC(IS)用乙腈溶解，并
各自稀释成 1mg /mL和 10mg /mL的工作液。4℃环
境保存。(4)标准曲线的制备内标液 1μg /mL 由稀
释原始工作液得来。取空白大鼠血浆 90μL 于
1. 5mL塑料离心管中，依次加入不同浓度的 ECＲ标
准溶液 10μL，内标标准液 10μL，配置成药物浓度范
围在 0． 5 － 500ng /mL(1，25，250ng /mL)的标准溶
液。记为高浓度、中浓度、低浓度 QC。
2． 2 法学考察
2． 2． 1 精密度试验 取空白物质基质，按照标准曲
线项下的方法，分别在同一批内和不同批间制备含
红百金花内酯浓度为(1，25，250ng /mL)的质控样
品，并分析测定。
日内精密度:在一个工作日内完成，要求随行制
备一条标准曲线和每一浓度制备 5 个样品，每个样
品测定 1 次，用随行标准曲线分别计算 3 个浓度的
变异系数。
2． 2． 2 日间精密度 在 3 个共日内完成，每个工作
日完成一个分析批的样品测定，要求每一分析批内
制备一条标准曲线，每个浓度一个样品，每个样品测
定一次。用随行标准曲线分别计算 3 个浓度的变异
系数。
2． 2． 3 回收率试验 取空白物质基质，分别制备含
红百金花内酯浓度为 1，25，250ng /mL 的质控样品，
按照标准曲线项下的方法处理并分析测定，与用流
动相所制备的相同浓度样品衍生化处理比较所得。
2． 2． 4 衍生化过程 大鼠灌胃当药苦苷后血浆经衍
生化，成功在血浆中检测到了红百金花内酯，见图
1，对大鼠灌胃后的体内红百金花内酯进行检测，色
谱图见图 2．
图 1 当药苦苷体内代谢成红百金花内酯及其衍生化过程
图 2 血浆中红白金花内酯色谱检测
给大鼠灌胃红百金花内酯后，由于受剂量影响，
无法检测到其他代谢物。于是把红百金花内酯与大
鼠肝微粒体共温孵，从温孵物中分离出其代谢物，利
用核磁等方法确定了代谢物的结构。发现其结构中
醛基被还原成羟基，变成 3，4 － dihydro － 5 －
(hydroxymethyl)isochroman － 1 － one。然而 3，4 －
dihydro － 5 －(hydroxymethyl)isoch红百金花内酯极
性较小，作为异物无法排除体外，推断其在体内可能
进一步被 roman － 1 － one 也无法用液质联用检测
到，因为其结构中也缺少可离子化的官能团，于是采
用皮可酸进行衍生化以提高其质谱检测灵敏度。皮
可酸衍生化后，成功在血浆中检测到 3，4 － dihydro
－ 5 －(hydroxymethyl)isochroman － 1(下转第85页)
·17·
张若良等:UPLC － MS /MS检测
中药中非法添加的抗病毒化学成分
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学
术
广
角
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握、研判。同时，在手机微信时代，高校需整合校内
外资源，防止学生依赖手机微信而影响了正常的学
习和生活，引导教育大学生有效利用时间，积极参加
有益于身心健康的校园活动，丰富文化知识，陶冶个
人情操，养成良好使用手机微信的习惯。
参考文献
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湖南大学，2012．
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政治教育工作［J］．文教资料，2011(4) :224 － 225．
［3］芮鸿岩．新媒体技术与大学生思想政治教育［J］．高校理论战线，
2009(6) :51 － 53．
［4］杨静．“新媒体时代”大学生人生价值观之我见［J］．内蒙古电大
学刊，2008(6) :71 － 72．
(收稿日期:2014 － 10 － 14)编辑:
櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴
薛铁瑛
(上接第 71 页)
－ one 。
2． 2． 5 专属性 样品处理后经 LC /MS 经测定在上
述色谱系统中，血浆中的内源物质及其他杂质不干
扰样品的测定。各检测物色谱行为较佳，红百金花
内酯和 4 －甲氧基苯甲酸甲酯衍生物的保留时间分
别为 4． 6min和 5． 1min。
2． 2． 6 精密度和准确度 本方法中高、中、低三个
浓度日内和日间精密度分别 ＜ 8． 13，＜ 6． 19，准确度
在 0． 86% －5． 13%之内。回收率 62． 2% － 70． 8%。
满足生物样品分析的要求，见表 1 。
2． 2． 7 稳定性 考察不同实验条件下，测定室温放
置一段时间后的大鼠血浆中红百金花内酯的浓度，
以及 － 20℃放置 3 天后伯醇衍生产物的稳定性，结
果如表 2。在进样瓶中放置 16h，－ 20℃放置 3 天，
溶液浓度无明显变化，说明稳定性良好。
表 1 红百金花内酯衍生物在大鼠血浆中的日内精密度和
日间精密度
样品浓度
/ng·mL －1
日内
(n = 5)
CV
/%
ＲE
/%
日间
(n = 15)
CV
/%
ＲE
/%
1 1． 06 ± 0． 07 4． 51 4． 58 1． 09 ± 0． 10 5． 96 4． 66
25 25． 59 ± 0． 77 3． 36 2． 61 26． 21 ± 0． 73 4． 52 2． 55
250 261． 28 ± 71． 23 7． 53 4． 20 261． 52 ± 56． 24 5． 30 3． 54
表 2 红百金花内酯和其衍生物的稳定性
样品浓度
/ng·mL －1
红百金花内酯浓度
(ng·mL －1)
CV
/%
ＲE
/%
红百金花内酯的浓度
(ng·mL －1)
CV
/%
ＲE
/%
衍生物的浓度
(ng·mL －1)
CV
/%
ＲE
/%
1 1． 08 ± 0． 05 4． 21 5． 45 1． 12 ± 0． 06 6． 57 3． 45 1． 18 ± 0． 12 5． 08 3． 61
25 25． 57 ± 0． 85 3． 52 2． 45 26． 14 ± 0． 85 4． 11 － 3． 02 26． 77 ± 0． 55 4． 06 4． 15
250 262． 54 ± 75． 21 7． 45 5． 23 267． 55 ± 61． 24 5． 26 4． 13 269． 44 ± 82． 15 6． 73 5． 24
2． 2． 8 大血浆中 ECＲ定量分析 二硝基苯肼衍生
化成功用于红百金花内酯血药浓度的测定。大鼠灌
胃给药当药苦苷水溶液 200mg /kg 后，根据药时曲
线平均最高血药浓度，最长吸收时间，最大药时曲线
面积分别为 425． 8 ± 127． 6ng /mL，128． 6min ，38．
8μg /mL·min。
3 讨论
当药苦苷大鼠灌胃后，血浆用羰基试剂处理，得
到了与羰基试剂结合的红白金花内酯衍生物。推断
可能是红白金花内酯与血中白蛋白发生共价结
合［3］，羰基试剂把其置换，产生的衍生化产物具有
很高的质谱检测灵敏度，于是被检测到。以上对新
代谢物的合成，从化学角度对其结构进行了准确无
误的确认，也为其活性测试做好了物质准备，当药苦
苷首先在体内被水解变成苷元，大部分苷元经重排
变成红百金花内酯，一个二氢香豆素，红百金花内酯
在肝脏中被进一步代谢成终产物 3，4 － dihydro － 5
－(hydroxymethyl)isochroman － 1 － one 的硫酸结合
物，并被排出体外。即环烯醚萜化合物当药苦苷在
体内最终被代谢成含氮化合物及香豆素。本研究对
当药苦苷的体内代谢过程进行了研究，阐明了当药
苦苷的大鼠体内代谢产物，发现其可以由单萜类化
合物转化为生物碱类和香豆素类化合物，并以代谢
物的形式发挥药效。
参考文献
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(收稿日期:2015 － 05 － 14)编辑:曾文雪
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廖东华等:浅谈微信在高校团学工作中的运用