全 文 ：　　收稿日期：２０１６－０３－２５
基金项目：国家烟草专卖局烟草基因组重大专项［１１０２０１３０１０１０（ＪＹ－１０）］；牡丹江师范学院国家级重点创新预研（ＧＹ２０１２０３）；牡
丹江师范学院省级重点创新预研项目（ＳＹ２０１３１８）
作者简介：史美葳（１９９０－），女，黑龙江人．在读研究生，主要从事遗传学研究；杨淼（１９９１－），女，黑龙江人．在读研究生，主要从事遗传
学研究；金秋（１９９０－），女，黑龙江人．在读研究生，主要从事遗传学研究；魏继承（１９６８－），男，黑龙江人．教授，博士，主要从
事遗传学研究．
通讯作者：魏继承
文章编号：１００３－６１８０（２０１６）０３－００５４－０３
罗勒毛状根培养体系的优化
史美葳，杨　淼，金　秋，魏继承＊
（牡丹江师范学院 生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 １５７０１１）
摘　要：为寻找最佳罗勒毛状根培养体系优化方案，用四种发根农杆菌Ａ４，Ｒ１６０１，Ｃ５８Ｃ１，１５８３４诱导药用
植物罗勒外植体产生毛状根．实验从外植体、菌株、侵染时间、共培养四个因素优化罗勒毛状根培
养体系．结果表明，用发根农杆菌Ｒ１６０１诱导罗勒叶片，预培养时间４８ｈ、共培养时间４８ｈ、侵染时
间６ｍｉｎ时，出根效果最好；用１／２ＭＳ液体培养基继代培养３０ｄ最佳．
关键词：罗勒；发根农杆菌；毛状根
［中图分类号］Ｑ９４９．６６　　　［文献标志码］Ａ　　　　
Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｏｐｔｉｏｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｏｃｉｍｕｍ　Ｂａｓｉｌｉｃｕｍ　Ｌ．Ｈａｉｒ　Ｒｏｏｔｓ
ＳＨＩ　Ｍｅｉ－ｗｅｉ，ＹＡＮＧ　Ｍｉａｏ，ＪＩＮ　Ｑｉｕ，ＷＥＩ　Ｊｉ－ｃｈｅｎｇ
（Ｍｕ　ｄａｎｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，１５７０１１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｗｏｒｋ，ｓｅｖｅｒａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｃｉ－
ｍｕｍ　ｂａｓｉｌｉｃｕｍ　Ｌ．ｈａｉｒ　ｒｏｏｔｓ　ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｈａｉｒ　ｒｏｏｔｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｃｏｕｌｄ　ｇｅｔ　ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｕｎｄｅｒ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ
ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ　ｆｏｒ　６ｍｉｎ　ｕｓｉｎｇ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ　Ｒ１６０１ａｆｔｅｒ　４８ｈｌｅａｆ　ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，ａｎｄ
１／２ＭＳ　ｌｉｑｕｉｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｈａｉｒ　ｒｏｏｔｓ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｏｃｉｍｕｍ　ｂａｓｉｌｉｃｕｍ　Ｌ．；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ；ｈａｉｒ　ｒｏｏｔ
　　罗勒（Ｏｃｉｍｕｍ　ｂａｓｉｌｉｃｕｍＬ．）又名九层塔、金
不换等，唇形科罗勒属，１年生草本植物．株高４０
～６０ｃｍ，具有类似茴香的特殊气味，全株小巧，叶
色翠绿，花色鲜艳，原产于亚洲热带区，对寒冷敏
感，在热并干燥的条件下生长最好．罗勒辛温，成
分除含挥发油类、总黄酮及其苷类外，还含有三萜
类和生物碱类等成分［１］，具有降血糖和调血脂作
用，在医药、食品和香料工业行业具有很大的开发
利用价值．发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ－
ｇｅｎｅｓ）是一种土壤细菌，具有广泛侵染性，能够诱
导植物形成毛状根［２］．毛状根与正常的植物体根
系不同，具有多分枝、无向地性、生物合成能力强
且生长迅速等特点．毛状根的分化水平高，有利于
植物次生代谢产物的积累．因此，毛状根是生产植
物次生代谢产物的最佳选择．近年来，利用毛状根
转化技术获得药用植物次生代谢产物的研究较为
广泛，主要为了解决药用植物价格高、植物再生能
力低、有效成分含量低、需求量大等问题．国内外
对多种药用植物进行了毛状根诱导，建立了体系
成熟的毛状根培养系统，如北柴胡、毛酸浆和垂序
商陆等．［３－５］对罗勒的研究尚不完善，本研究的目
的是寻找最佳罗勒毛状根培养体系，优化方案．
·４５·
２０１６年第３期 牡丹江师范学院学报（自然科学版） Ｎｏ．３，２０１６
（总第９６期） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　 Ｔｏｔａｌ　Ｎｏ　９６
DOI:10.13815/j.cnki.jmtc(ns).2016.03.018
１　材料与方法
１．１　实验材料
罗勒种子由实验室保存，发根农杆菌１５８３４，
Ｃ５８Ｃ１，Ｒ１６０１，Ａ４由实验室保存，培养基为 ＭＳ
培养基．
１．２　实验方法
无菌苗的获得　取罗勒种子置于灭菌后的离
心管中，加入０．２％升汞杀菌５ｍｉｎ，用无菌水冲
洗３－４次．加入７５％酒精消毒３０ｓ，用无菌水冲洗
３～５次后，吸干种子表面水渍，将种子立即铺至
１／２ＭＳ固体培养基上培养，７－１０ｄ后长出幼苗．
诱发毛状根　罗勒幼苗长至３～５ｃｍ高时，
将罗勒的外植体放置于１／２ＭＳ固体培养基上预
培养．将１５８３４，Ｃ５８Ｃ１，Ｒ１６０１，Ａ４菌株接种在
ＹＥＢ固体培养基上，２８℃倒置培养１－２ｄ，继续接
种到ＹＥＢ液体培养基上，摇菌过夜．将摇好的菌
液置于大离心管中收集菌体，用加入乙酰丁香酮
的１／２ＭＳ液体培养基重新悬浮菌体．罗勒外植
体叶片剪成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ，茎剪成３ｃｍ长，置
于重悬的菌体内侵染．滤纸吸干后铺至１／２ＭＳ
固体培养基上２３℃暗培养，接着将罗勒外植体转
入含头孢（５００ｍｇ／ｍＬ）的１／２ＭＳ固体培养基继
代培养，实验每个平行三次，定期观察记录．
罗勒毛状根的增殖培养　当外植体根长至３
～５ｃｍ时，在超净工作台内用剪刀将根沿基部剪
下，用镊子夹起转移到诱导根生长的１／２ＭＳ液体
培养基中，加入头孢（５００ｍｇ／ｍＬ）抑菌．放入恒
温摇床２３℃培养，每５－７ｄ继代培养更换培养
基，直至毛状根生长至抱团．
毛状根ｒｏｌＢ的ＰＣＲ检测　通过Ｒｉ质粒上Ｔ
－ＤＮＡ的特有基因ｒｏｌＢ设计引物如下：
ｒｏｌＢ－１：５′－ＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＴ－３′
ｒｏｌＢ－２：５′－ＧＡＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＣＴＣ－３′
用ＣＴＡＢ法提取罗勒ＤＮＡ，用设计好的引
物进行ＰＣＲ检测．ＰＣＲ反应体系（２０μＬ）：１０×
ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ，ｄＮＴＰ　１．６μＬ，引物各１μＬ，模板
１μＬ，ｒＴａｑ　０．３μＬ，ｄｄ　Ｈ２Ｏ　１３．１μＬ．ＰＣＲ反应
条件为：９５℃５ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃
１ｍｉｎ，７２℃５ｍｉｎ．ＰＣＲ反应结束后在１％的琼
脂糖凝胶上电泳检测．
２　结果与分析
２．１　不同发根农杆菌对罗勒毛状根诱导的影响
在同一培养条件下，用 Ａ４，Ｒ１６０１，Ｃ５８Ｃ１，
１５８３４发根农杆菌侵染罗勒叶片．实验表明，４种
菌株均能诱导出毛状根，不同发根农杆菌对罗勒
毛状根的诱导率不同．Ｒ１６０１菌株对罗勒毛状根
的诱导率较其他菌株高．因此，后续试验均采用
Ｒ１６０１菌株诱导．这４种菌对罗勒毛状根的诱导
率从高到低依次是 Ｒ１６０１＞Ａ４＞Ｃ５８Ｃ１＞
１５８３４．
图１　罗勒叶片侵染
ａ：发根农杆菌Ａ４侵染；　ｃ：发根农杆菌Ｒ１６０１侵染；
ｂ：发根农杆菌１５８３４侵染；ｄ：发根农杆菌Ｃ５８Ｃ１侵染．
２．２　不同外植体对毛状根诱导的影响
用不同发根农杆菌Ａ４，Ｒ１６０１，Ｃ５８Ｃ１，１５８３４
侵染罗勒外植体均能诱导出毛状根，但植物不同
诱导情况不同，同一植物的不同部位，诱导情况也
不同．如图１所示，茎段多数没有诱导出毛状根，
却极易长出新的外植体．罗勒叶片诱导出根效果
最佳，达６０％（表１），基本全部都诱导出毛状根，
且根细长圆柱形，乳白色，半透明状，有白色绒毛，
长势良好．转化成功的罗勒叶片生根数量不一致，
多的达２０条根以上，少的仅为１－２条．
图２　罗勒外植体毛状根的诱导
·５５·
２０１６年 史美葳，等：罗勒毛状根培养体系的优化 第３期
表１　不同部位罗勒外植体诱导率
外植体 外植体数／个 感染数／个 诱导率／％
茎段 ２０　 ５　 ２５
叶片 ２０　 １２　 ６０
２．３　侵染时间对罗勒毛状根诱导的影响
在罗勒毛状根培养中，同一生理条件下农杆
菌侵染时间的长短直接关系到毛状根的诱导率．
侵染时间过短，农杆菌自身Ｔｉ质粒的Ｔ－ＤＮＡ不
能转移并整合到植物的ＤＮＡ上，植物的转化效
率降低．反之，侵染时间过长，侵染后的植物外植
体易褐化、枯死，转化效率同样也降低．本试验选
用发根农杆菌Ｒ１６０１，重悬菌液后侵染罗勒叶片，
侵染时间梯度为４ｍｉｎ，６ｍｉｎ，８ｍｉｎ，每个梯度平
行做三个平皿．实验结果显示，６ｍｉｎ对毛状根的
诱导效果最佳，诱导率达到９３．３％．因此，罗勒外
植体最佳侵染时间为６ｍｉｎ．
图３　罗勒毛状根液体培养
ａ．罗勒毛状根放入液体培养基初始状态；ｂ．１０ｄ后１／４液
体培养基；ｃ．１０ｄ后 ＭＳ液体培养基培养；ｅ．１０ｄ后１／２
ＭＳ液体培养基；ｆ：３０ｄ１／２液体培养基；ｇ：３０ｄ后 ＭＳ培
养基．
２．４　不同液体培养基对罗勒毛状根诱导的影响
将由罗勒外植体诱导出的毛状根分别接种于
ＭＳ，１／２ＭＳ，１／４ＭＳ液体培养基中．结果显示，
罗勒毛状根在１／２ＭＳ液体培养基中生长最好，
诱导情况依次为１／２ＭＳ培养基＞ＭＳ培养基＞
１／４ＭＳ培养基．毛状根增殖最佳时间为３０ｄ．培
养５ｄ时，毛状根的增殖数没有明显变化，１０－１５ｄ
时，１／２ＭＳ液体培养基中毛状根增殖量明显增
多，且长出很多白色、粗壮、生命力顽强、多分支的
新根．ＭＳ培养基中毛状根增殖量较小，但根的状
态相同．２０－２５ｄ，１／２ＭＳ液体培养基中的毛状根
开始大量增殖，其余培养基中毛状根增长不明显．
３０ｄ后液体培养基几乎全部被毛状根吸收，毛状
根的增值达到最大．
２．５　毛状根的ＰＣＲ检测
图４　毛状根的ＰＣＲ扩增
Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，１．空白对照；２－５．罗勒毛状根ＤＮＡ的
　　　 ＰＣＲ结果
罗勒毛状根提取ＤＮＡ后进行ＰＣＲ检测．经
ＰＣＲ扩增后结果见图４，转化后的罗勒毛状根的
ＤＮＡ均检测出４３２ｂｐ左右的特异性条带，证实
明 Ｒｉ质粒上的 Ｔ－ＤＮＡ 已整合到 罗 勒 基 因
组上．
参考文献
［１］ＧＡＮＡＳＯＵＮＤＡＲＩ　Ａ，ＵＭＡＤＥＶＩＰ，ＲＡＯ　Ｍ　Ｎ　Ａ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ
ｂｙ　Ｏｃｉｍｕｍ　ｓａｎｃｔｕｍ［Ｊ］．Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，３７３：２７１－２７６．
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［５］姚庆收，单长民，武玉永，等．发根农杆菌介导的垂序商陆遗传转化体系的建立及毛状根株系生物量分析［Ｊ］．时珍国医国药，２０１４，
（８）：１９９１－１９９４．
编辑：琳莉
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２０１６年 牡丹江师范学院学报（自然科学版） 第３期