全 文 ：异叶败酱有效部位ＰＨＥＢ抗肿瘤作用研究
仇凤梅，杨　波，李　娜，张如松＊
（浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州３１００５３）
摘　要：目的：从异叶败醤中分离纯化得到抗肿瘤有效部位ＰＨＥＢ，通过体外抗肿瘤实验，明确ＰＨＥＢ对
黑色素瘤细胞（Ｂ－１６）和脑胶质瘤细胞（Ｃ６）生长的抑制作用。方法：采用硅胶柱层析分离制备ＰＨＥＢ，
ＭＴＴ比色法考察ＰＨＥＢ对Ｂ－１６和Ｃ６肿瘤细胞的体外增殖抑制能力。结果：从异叶败醤醇提物中分
离精制得到ＰＨＥＢ（４．０‰）。ＭＴＴ法表明ＰＨＥＢ对Ｂ－１６和Ｃ６肿瘤细胞均有明显的抑制作用，ＩＣ５０分
别为（３３．５±３．７）μｇ／ｍＬ和（４１．２±３．５）μｇ／ｍＬ，且具有明显的量－效关系。结论：败酱有效部位ＰＨＥＢ
对Ｂ－１６和Ｃ６肿瘤细胞具有一定的抑制作用。
关键词：异叶败酱；抗肿瘤；ＭＴＴ法
中图分类号：Ｒ９７９．１　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１１）０７－０００５－０２
收稿日期：２０１１－０４－０６
作者简介：仇凤梅（１９８４－），女，硕士，浙江中医药大学助教，研究方向为中药品质评价及产品开发；张如松（１９４８－），男，浙
江中医药大学教授，博士生导师，研究方向为中药、天然药物药效物质与创新药物的研究开发。
　　异叶败酱 （Ｐａｔｒｉｎｉａ　ｓｐ．）为败酱科败酱属多年生草本
植物，药用其根［１］，有消肿排脓、祛瘀止痛的功效，临床上用
于治疗急性阑尾炎初起、瘰疬、无名肿痛、宫颈糜烂、跌打损
伤、骨折等症［２］。现代药理研究表明［３－４］，异叶败酱不同提取
物对体内外肿瘤癌细胞有强杀伤作用，但未见报到其对Ｂ１６
和Ｃ６肿瘤细胞的作用。我们从异叶败醤中分离纯化得到
抗肿瘤的有效部位 ＰＨＥＢ，通过体外抗肿瘤实验，明确
ＰＨＥＢ对Ｂ１６和Ｃ６肿瘤细胞的抑制作用。
１　实验材料
１．１　细胞株及培养条件
Ｃ６细胞由浙江省医学科学院药物研究所提供；Ｂ－１６细
胞由浙江中医药大学资源鉴定实验室提供。Ｂ－１６细胞接种
于ＲＰＭＩ－１６４０培养基中；Ｃ６细胞接种于ＤＭＥＭ培养基中；
两者均于３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中培养，细胞长
满瓶底近８０％后用ＰＢＳ清洗，以０．２５％胰酶消化３～５ｍｉｎ

，
对其进行验证，平行进行５样本分析，测定苦参中总黄酮的
含量（２．０１±０．１３）％。
３　讨论
本试验对苦参总黄酮回流提取工艺进行了系统的优
化，发现乙醇体积分数、提取时间和提取温度为影响其提取
率的主要因素，而提取次数和溶剂倍数无显著性影响。因
而建议工业生产和植物化学研究领域，对于苦参的提取可
以摒弃经验提取习惯（２ｈ×２次）。本文优化结果证明，以
２０倍量８０％乙醇为提取溶剂，８０℃控温环境下，提取１ｈ，仅
需１次黄酮已基本提取完全。
本试验选用正交实验法优化苦参总黄酮回流提取工艺
的实验条件，大大提高了总黄酮的提取效率，为苦参中黄酮
类化合物的深入研究和苦参药用成分的进一步开发利用提
供了科学依据。
参考文献：
［１］　国家药典委员会．中华人民共和国药典［Ｍ］．一部．北京：中
　　 国医药科技出版社，２０１０：１８８－１８９．
［２］　赵平，张颖君，山本浩文，等．苦参异戊烯基黄酮类化合物的
化学活性及其生物合成研究进展 ［Ｊ］．天然产物研究与开发，
２００４，２６（２）：１７２－１７８．
［３］　赵慧娟，孙文基．苦参中黄酮类化合物的化学成分及药理研
究进展［Ｊ］．中药材，２００５，２８（３）：２４７－２５１．
［４］　刘鹏飞，程爱卿，邓天昇，等．苦参中总黄酮含量的测定及分
布研究［Ｊ］．中成药，２００７，２９（４）：５９６－５９８．
［５］　刘斌，石任兵，周素蓉．苦参汤有效部位总黄酮含量测定方法
研究［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２００４，１０（６）：２４－２６．
［６］　张瑞菊，张国英，孙海波，等．微波辅助提取苦参总黄酮［Ｊ］．
食品研究与开发，２００７，２８（９）：４３－４６．
［７］　卢丽萍，张蕾，廖琼峰，等．苦参中总黄酮含量测定方法的研
究［Ｊ］．今日药学，２０１１，２１（３）：１４６－１４８．
（责任编辑：宋勇刚）
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转移至离心管，１　０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ，弃上清液，适量培养基
混悬吹打成单细胞悬液进行传代。加药均在细胞对数生长
期内进行。
１．２　药物
ＰＨＥＢ，由本实验制备，用ＤＭＳＯ配制为１０ｇ／Ｌ的贮存
液，实验前用 ＲＰＭＩ－１６４０培养基稀释至所需浓度；ＲＰＭＩ－
１６４０培养基：５５４３６２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。新生小牛血清：
０８０３０４，杭州四季青生物工程材料研究；０．２５％胰蛋白酶：
１２９９Ａ７７，上 海 生 工 公 司，进 口 分 装；ＤＭＥＭ 培 养 基：
３９７７５３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司；ＭＴＴ （四 甲 基 偶 氮 唑 盐）：
３１５４Ｂ７９，杭州昊天生物技术有限公司，进口分装。
１．３　仪器
Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｏｒｍａ　９９１超低温冰箱，美国Ｔｈｅｒｍｏ电子公
司；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｏｒｍａ　３１１１细胞（ＣＯ２）培养箱，美国Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈ
公司；Ａｉｒ　Ｔｅｃｈ超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
ＯＬＹＭＰＵＳ　ＣＫＸ４１ＳＦ倒置生物显微镜，日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公
司；ＢＩＯ－ＲＡＤ　６８０酶标仪，日本ＢＩＯ－ＲＡＤ公司。
２　方法
２．１　ＰＨＥＢ的制备
取异叶败酱干燥根茎１９．５ｋｇ，粉碎成粗粉，加８０％乙
醇浸泡４８ｈ后，装入渗漉缸，收集渗漉液，渗漉液回收乙醇
至无醇味，得到浸膏。浸膏加适量乙酸乙酯萃取３次，收集
萃取液并回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物（ＰＨＥ）１　０４０ｇ。取
２５０ｇ乙酸乙酯提取物，进行硅胶柱层析分离，用不同浓度比
例二氯甲烷－乙酸乙酯梯度洗脱，分离得到４个流分ＰＨＥ
（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。其中二氯甲烷－乙酸乙酯（１０∶１）５０Ｌ洗脱后，
得到１８．８ｇ黄色油状物质（ＰＨＥＢ）。
２．２　ＰＨＥＢ体外抗肿瘤实验
取对数生长期的Ｂ－１６和Ｃ６细胞，０．２５％胰蛋白酶消
化，转移至离心管离心，弃上清液，加入新的适量ＲＰＭＩ１６４０
或ＤＭＥＭ培养基吹成单细胞悬液；根据不同细胞生长速
度，以适宜的细胞数接种于９６孔板上，置于ＣＯ２ 培养箱中
培养２４ｈ。然后分别加入５组浓度呈等比递减的ＰＨＥＢ（最
大给药浓度６０μｇ／ｍＬ）。设正常对照组（加肿瘤细胞，不加
ＰＨＥＢ）和空白孔（不加肿瘤细胞和ＰＨＥＢ），使每孔总体积
为２００μＬ，各设３个复孔。继续在ＣＯ２ 培养箱中培养７２ｈ
后，倒置显微镜下观察不同浓度的ＰＨＥＢ对肿瘤细胞的影
响；加入 ＭＴＴ继续培养至少４ｈ后，弃去孔内培养上清液，
加入ＤＭＳＯ溶解，震荡混匀后，在酶标仪上５７０ｎｍ波长处
测定ＯＤ值，作为存活细胞个数的相对值。实验重复３次。
用８２７９８－ＩＣ５０计算软件计算ＩＣ５０，并计算９５％可信限区间。
按下列公式计算抑瘤率：
ＩＲ＝ ＯＤ
正常对照孔－ＯＤ给药孔
ＯＤ 正常对照孔－ＯＤ空白对照孔×１００％
３　数据统计
实验结果用 珚ｘ±ｓ表示，数据用ＳＰＳＳ１２．０统计软件分
析。
４　结果
从异叶败醤醇提物中分离精制得到ＰＨＥＢ（４．０‰）。
结果表明，ＰＨＥＢ对Ｂ－１６和Ｃ６肿瘤细胞均有一定的抑制
作用（详见表１），且抑制率都随着给药浓度的增大而增强，
具有明显的量－效关系（详见图１）。
表１　ＰＨＥＢ作用７２ｈ对肿瘤细胞的抑制作用
（珚ｘ±ｓ，ｎ＝３）
瘤株 ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ） ９５％可信限区间（μｇ／ｍＬ）
Ｂ－１６　 ３３．５±３．７０　 ２４．５３，４３．８７
Ｃ６　 ４１．２±３．５０　 ３２．７１，５０．２９
５　讨论
恶性肿瘤（以下简称肿瘤）是严重威胁人类健康的一类
常见疾病，其死亡率仅次于心脑血管疾病。因此，寻找有效
新药仍然是急需解决的问题。中药作为抗肿瘤药，具有有
效成分种类多、抗瘤谱广、副作用小等特点。为寻找中药异
叶败酱抗肿瘤作用有效成分，本实验采用 ＭＴＴ法考察发现
ＰＨＥＢ对Ｂ－１６和Ｃ６肿瘤细胞均具有一定的细胞毒作用，
且具有一定量－效关系。通过研究，将进一步丰富异叶败
酱抗肿瘤谱，且为研究异叶败酱抗肿瘤有效成分打下基础。
图１　不同浓度ＰＨＥＢ作用７２ｈ后对Ｂ－１６和Ｃ６
肿瘤细胞生长的抑制作用（珔ｘ±ｓ，ｎ＝９）
参考文献：
［１］　江苏新医学院．中药大辞典［Ｍ］．上海：上海人民出版社，
１９７７：２４４５－２４４６．
［２］　南京中医药大学．中药大辞典（下册）［Ｍ］．上海：上海科学技
术出版社，２００６：３４０５．
［３］　耿果霞，陆文总，李青旺，等．异叶败酱多糖的体内抗肿瘤活
性研究［Ｊ］．西北农林科技大学学报：自然科学版，２０１０，３８
（１１）：１４－１８．
［４］　程卫东，李立．墓头回的研究进展［Ｊ］．甘肃中医，２００６，１９
（１０）：３９－４１． （责任编辑：宋勇刚）
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