全 文 ：第 2斗卷 第 4 期
1 9 8 2 年 7 月
植 物 学 报
A C T A B O T A N I C A S IN I C A
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天麻食菌过程中蜜环菌活力的变化
及几种酶的组织化学定位 *
刘 成 运
(中国科学院 昆明植物研究所 )
摘 要
应用叮咤橙活体染色法 , 借助于荧光显微镜观察了侵染天麻球茎的蜜环菌活力 的 变化 。
发现初染菌丝发射出具活力的绿色荧光 , 衰老菌丝为黄色荧光 , 而残缺菌丝及丛状体则发射出
失活的橙红色荧光 。 用叮咤橙诱导荧光法及在 p H Z . 2 的条件下以固绿染色的方法 , 证实了大
型细胞内含有丰富的 R N A 和总蛋白质 。 酸性磷酸酶主要分布在含菌丝 的皮层细胞 、 大型细胞
除细胞壁外 , 细胞内只有较少的反应沉淀物。 醋酶在含菌丝的皮层细胞内显示了非常明显的
活性 ,而在大型细胞的丛状体及崩解核内也显示了明显的活性分布 。 A T P 酶 ,多酚氧化酶与过
氧化物酶在含菌丝 的皮层细胞及大型细胞内均显示了明显的活性 。
天麻 ( ` a s t r o沂。 e za t a B I . ) 与蜜环菌 ( A r o i l l a r i a m e l l e a F r . ) 的关系是天麻发育生
物学的一个重要部分 , 在天麻同化侵染的蜜环菌的过程中 , 对于双方复杂的相互关系 , 众
说不一 1[ -3 .ls] 。 作者前文报道了关于天麻同化蜜环菌机制的初步推测 〔I J , 本文应用荧光活
体染色及荧光诱导染色法 , 结合几种酶类的组织化学定位 , 进一步观察了侵染菌丝在侵染
过程中的变化以及与这些酶类分布的关系 ,为深人地研究菌麻关系提供参考 。
` 二二 仆 , 户 - :
材 料 和 方 法 ·
、 扩样品采自云南省昭通地区野生天麻及云南楚雄西山菌种广的人工瓶栽天麻的染菌部
位 。两者经观察在形态结构上无差异 。样品自土壤中取 出后 , 洗去泥砂 , 立即用半导体致冷
的冰冻切片机切片 ,片厚 10 微米 。 部分采用徒手切片 ,片厚约 10 一 2 , 微米。 ’ 此切片用于
活体染色及酶的组织化学定位 。 另取一部分样品固定于卡诺氏固定液中 ,制成石蜡切片 ,
片厚 10 微米 。 用于观察组织的核酸及蛋白质的相对分布 。 具体步骤如下 : 1 . 叮睫橙
(
a o id en or
a gn e ) 活体染色法阳 : 用 p H 7 . 2 的磷酸盐缓冲液配制的 丁: 10 , 0 0 0 叮咤橙染液
浸染冰冻或徒手切片 5 分钟 , 用同样的缓冲液冲洗数次 , 置载玻片上 , 用 :1 1的一缓冲液配
制的甘油封片 , 立即置荧光显微镜下 , 紫外光激发 · 豌察并照娜 对照为不经叮咤橙染色
的冰冻切片 , 以观察本身的 自发荧光 。 应用 日本 O L YM P U S V A N O X 万用研究显微镜 ,
2 0 0 w 高压汞灯 , 激发滤光片为 u 3 0卜 4 0。 , 栅滤光片为 L 斗2。 , K ed a k 彩色片 自动曝光照
相 。 2 . 叮吮橙诱导荧光法 [’1 : 观察细胞内 D N A 和 R N A 。 使用石蜡切片 , 切片脱蜡至水
后 , 用 p H 4 . 2 的醋酸盐缓冲液配制的 1 : 2 5 0 0 叮咙橙染色 15 分钟 , 用同一缓冲液分色 40
本文于 19 81 年 7 月收到 。
本文初稿承胡适宜先生审阅 ,彩色照片由王华同志冲放 , 谨致衷心感谢 。
植 物 学 报 2 4卷
分钟左右 ,甘油封片或经丙酮脱水后 , 二甲苯透明 , 用很稀的树脂封片 。 置荧光显微镜下
观察并照相 , 方法同上 。 对照为不经叮咤橙染色 , 以 p H .4 2 的醋酸缓冲液浸泡 巧 分钟的
石蜡切片 , 以观察其自发荧光 。 另用 5多 三氯醋酸 90 ℃ 水解 15 分钟以除去核酸后的石
蜡切片 , 经叮咤橙染色后作为对照 。 3 . 蛋白质应用 lA f er : 法田 : 石蜡制片经 5 多三氯醋
酸 90 ℃ 水解 15 分钟后 , 在 p H 2 . 2 条件下以固绿染色 , 显示总蛋 白质的相对分布 。 斗. 酸性
磷酸酶用 C o m o r i 改良的 e l ic k 和 F i s e h e r 法囚 。 醋酶用 e o m o r i ( T w e e n ) 法 f s , 。 A T p 酶
采用 w a e h s r e i n a n d M e is e l 法 〔, , , 。 过氧化物酶 , 多酚氧化酶采用 c l i e k 法 〔` ,。 对照制片均
用沸蒸馏水煮 15 分钟 , 然后同时染色操作 。
实 验 结 果
1
. 叮陡橙活体染色结果表明 , 附着于天麻表皮上的菌索内的生活菌丝发射出绿色荧
光 (图版 I , 1) 。 不经叮咤橙染色的对照制片 , 菌丝及生活细胞只发射出淡青色的自发荧
光 (图版 I , 2 ) 。 新人侵外围皮层组织细胞内的菌丝则发射出浅绿色荧光 (图版 I , 3 ) , 白色
箭头指处为人侵菌丝通过细胞壁上的纹孔从一个皮层细胞侵染到另一个皮层细胞。 位于
皮层组织中部的一些细胞内的菌丝结已开始产生了质的变化 , 发射出淡黄至深黄色荧光 ,
而最内部 , 与大型细胞紧毗邻的一些细胞内 , 菌丝已失去完整的结构 , 发射出橙黄色荧光
(图版 I , 4 、 5 ) 。 大型细胞内 , 通过细胞壁纹孔进人的丛状体及其顶端脱落的物质发射出
橙红色荧光 (图版 I , 5 、 6 ) 。 以上从深绿经黄色过渡到橙红色的动态变化 , 反映了人侵的
菌丝在天麻皮层细胞及大型细胞内逐步失去活力的质变过程 。 从图版 I , 5 、 6 以及 图 版
n
,
4一 8 中 , 可以观察到进人大型细胞的丛状体总是具有趋核性 , 来自菌方的细丝状物质 ,
顶端向核并发生卷曲纽结 , 最后成团地脱落 ,分散在核的四周 。
2
. 叮淀橙诱导荧光法测定细胞内含物及侵染菌丝的核酸的相对分布 。 观察 结 果 表
明 , 表皮外菌索内正常的菌丝发射出黄绿色荧光 (图版 I , 7 ) 。 新入侵的菌丝 , 即在皮层组
织外 围细胞内的菌丝为黄绿色 , 而内部皮层细胞中残缺菌丝则发射出橙黄色荧光 (图版
I
,
8 )
。从该图片右上方我们可以看到一个未被侵染的皮层细胞的核及核仁 , 分别发射出深
绿及橙色的荧光 , 这是比较典型的 D N A 与 R N A 的特异荧光 14, 习 。 对比之下 , 新入侵菌丝
的黄绿色荧光含有 D N A 的成分 , 这与孚尔根阳性反应及嗜甲基绿性相一致 , 残缺菌丝的
深黄色荧光 、 大型细胞内核的崩解物质及其它一些成团的次生代谢物质 ,发射出典型的橙
红色 R N A 的特异荧光 , 这和孚尔根阴性反应及嗜派洛宁的染色特性又相符合 l[J 。 因此 ,
叮咤橙诱导荧光结果进一步验证了前文所作的一些组化染色反应 , 不仅说明侵染菌丝的
不同质变过程 , 同时也证实了大型细胞内含有丰富的 R N A 。
3
. 通过 lA fe rt 法 , 测定细胞内总蛋白质的相对分布和含量 。 结果大型细胞内含物被
染成较深的蓝绿色 , 而周围的薄壁细胞 , 含菌皮层细胞及菌丝的染色均较浅 (图版 I , 10 ) 。
表明了大型细胞内也存在着显著的蛋白质合成过程 。
4
. 酶类的组织化学定位 : ( l) 酸性磷酸酶在天麻的表皮层 、 细胞壁 、 维管束等部位有
明显的活性分布 , 在含菌丝的皮层细胞内也显示了很明显的活性 (图版 n , 1一 3 ) 。 其特点
是皮层最外围新被蜜环菌侵染的细胞内活性最高 , 中部皮层细胞次之 ,而最内层含残缺菌
丝的皮层细胞酶的活性最低 , 空的细胞腔则不具酶的活性 。 这些不同强度的活性分布与
刘成运 : 天麻食菌过程中蜜环菌活力的变化及几种酶的组织化学定位
侵染菌丝外形的完整性及其生活力的染色反应是相吻合的 , 当菌丝变性失去完整的结构
时 ,酶的活性也随之消失 (图版 H , 3 ) 。 内部大型细胞除细胞壁外 , 在丛状体上可看到较少
的酶的反应沉淀物 。 ( 2 ) 酉旨酶的组织化学定位表明 : 含菌丝的皮层细胞具有很明显的酶
活性 , 大型细胞及丛状体 , 脱落物质及核的崩解物质均产生明显的酶活性沉淀 (图版 n , 5 、
6 )
。
( 3 ) A T P 酶在天麻的含菌皮层细胞内 , 特别是在大型细胞内显示了非常明显的活性
分布 (图版 n , 4 ) 。 在细胞壁上 , 沿原生质膜的位置 、 丛状体及核上其活性均很高 。 这些分
布特点和大型细胞内有很多线粒体的存在 , 以及细胞内强烈的呼吸和生物合成活动中能
量的移换有密切关系 。 ( 4 ) 多酚氧化酶与过氧化物酶在天麻的含菌皮层细胞及大型细胞
内均表现出了很明显的活性分布 (图版 n , 7 、 8 ) 。
讨 论
1
· 叮睫橙染液在 p H 慎微碱性条件下 , 可以使生活的细胞保持其活力 。 从天麻含菌
丝的皮层细胞所发射出的荧光就可以判断菌丝的生活力变化 。 实验结果表明了菌丝侵染
愈久 ,生活力愈低 。 丛状体发射出明显的橙红色荧光 ,这反映了进人大型细胞的来自菌方
的物质是失活的。 这些物质具趋核性 , 似乎正是由于这些物质的刺激才促使天麻的最外
围中柱细胞产生一系列结构形态改变 1LJ , 这些变化可能与天麻为了适应对异源营养同化
的生理需要有关 。
2
. 侵染过程可以影响核酸和蛋白质的代谢 ,在许多病组织里 ,代谢活动的增加与核酸
和蛋白质的合成的显著增加相伴随 ;1[] 。 叮淀橙诱导荧光及总蛋 白质染色的结果 , 进一步
证实了在大型细胞内进行着旺盛的核酸和蛋 白质合成过程 , 这与作者前文观察到的具有
强烈地嗜派洛宁染色结果是一致的 1[J 。 也与 w he el r 的上述评论在某些方面是一致的 。
.3 酸性磷酸酶与醋酶在植物组织中分布最为广泛 , 它们可以使大分子物质解体为小
分子而有利于运输〔6] 是专一性较低的水解酶类 。 酸性磷酸酶在植物的液泡内〔15J 、维管束 、
特别是韧皮部分布最多 [` .7 10, 1, 14] 。 天麻除在维管束及细胞壁上分布最多外 , 在含菌丝的皮
层细胞内也有着明显的活性 , 而且随侵染的时间增加而降低 , 当菌丝失去完整的外形结
构 , 活体染色证实在失活以后 ,酶的活性也随之消失 。醋酶的活性变化更为明显 , 这和菌丝
含有较丰富的类脂物质有关 。 iP t , G al iP n 和 w ils on 讨论了植物溶酶体在病害反应中所
起的作用 , 提出了溶酶体膜的破裂和酶的释放可能在过敏反应中起坏死作用 〔l2] 。 这与在
天麻皮层组织细胞内所观察到的一些现象有某些相似之处 。
.4 st ha m an 和 D e m or est 总结了在病害反应中酶的变化 , 尤其是过氧化物酶 。 认为它
们的增加与病植物的抗病性有关 l2[] 。 天麻皮层细胞及大型细胞内非常旺盛的过氧化物酶
的活性 , 不仅反映了在这些细胞中存在着强烈的呼吸过程 ,似乎也反映了这些细胞内也存
在着抗侵染的特性 , 即存在着对侵染的蜜环菌具有抗病性或者称为免疫性 。
参 考 文 献
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y e l l o w o n e b y 比 e d e e r e p i t h y p h a e ; b u t t h e o r a n g e ot r e d 且助 r e s e e n e e w iht ht e l o s t
v i恤 li t y w e r e e m i t t e d b y t ll e f r a g n 〕 e n t ar y h yP h既 a n d e lu m P f o r m b o d i e s .
T h e l a r g e e e lls e o n t a in in g r i e h R N A a n d P r o t ie n h a d b e e n e o n f i r m e d b y t h e m e t h o d
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4期 刘成运 :天麻食菌过程中蜜环菌活力的变化及几种酶的组织化学定位 3 1 1
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o rb mo d ia e s n d t h e e ol l a p s e du n el e i of t h e
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d i s tr i b u it o n o f P o ly p h即 01 o x l d as e . 8 . T h e a e it 衫yt id o t r i b u it o n o f p份 o x i d a se .