全 文 ：菌 物 系 统 1 8( l) : 4 9一 9 9, 19 99
几为,e o sy s et m a
羊肚菌液态发酵的研究 *
赵 良启 李志强 侯桂香 郭向荣
(山西大学生命科学系 太原 0 3 0 0 0 6)
摘要 通过摇瓶正交试验研究了圆锥羊肚菌液体发酵的条件 , 选 出最佳培养基配方 、 接种量 、
培养温度 、 p H 、 通气量 , 培养时间等参数 。 在此基础上 , 应用 V IRT IS 公司生产的 2卜 自控发酵
罐进行了分批发酵 , 摸索到 了羊肚菌液态深层发酵的基本规律 , 然后分别以淀粉和玉米粉为
碳源进行了补料分批发酵 , 获得其干细胞产量为 25 .4 9 / L 和 27 . 49 / L , 生长速率为 .0 4 59 /
(L
·
h) 和 0 . 5 19 / (L · h) , 以碳源为基准的产量得率系数 (y 、 / , )为 0 . 72 (g / g )和 0 . 75 (g / g )等
数据 。 实验结果表明 , 羊肚菌的液态深层发酵已达到了真菌菌丝液态发酵的正常水平 。
关键词 圆锥羊肚菌 , 正交试验 , 液态发酵 。
中图分类号 : 0 9 39 . 97 文献标识码 : B 文章编号 : 10 0 7一 35 15 ( 19 9 9 ) 0 1一0 094一 99
羊肚菌是一种食用兼药用价值很高的大型真菌 。 在食用方面 , 其营养丰富 , 含有 28 . 3% 的蛋白质 。 不
仅含有 19 种常见氨基酸 , 而且含有顺一 3一氨基一卜脯氨酸 、 2一氨基异丁酸特别稀有的氨基酸 , 具有特殊愉
快的香味 , 因而使其味道鲜美成为食用菌中的珍品 。 在药用 方面 , 羊肚菌性平 , 味甘 , 能益肠胃 , 化痰理
气 , 是一味良好的传统中药 。 近年来发现羊肚菌含有丰富的真菌多糖 , B 族维生素和有机锗 , 能提高机体
免疫力 , 抑制肌瘤 180 , 并延缓衰老进程 。 因此羊肚菌深受国内外消费者喜爱 [` 一 3〕 。
几年来 , 固态栽培羊肚菌的技术在国 内外文献中有过一些报道 , 然而有关羊肚菌液体深层发酵方面
的研究却不多见 。 为了广泛深人地开发我国羊肚菌资源 , 我们采用山西省万宝山的野生圆锥羊肚菌 , 进
行了液体深层发酵研究 , 以期其产物或作为载培用液体菌种扩大栽培规模和产量 , 或作为食用和药用菌
体制剂服务于人类 。 本文对液体培养羊肚菌的培养基成分 、 培养条件 、 发酵方式及一些发酵动力学参数
作了初步研究 [` 一 6〕。
1 材料与方法
L l 供试菌株
圆锥羊肚菌 。羲,况 h el al co in ca eP sr . ) , 由本系韩建荣先生提供 。
L Z 培养基
1
.
2
.
1 母种培养基 : P D A 斜面固体培养基 。
1
.
.2 2 液体种子培养基 : P D A 培养基不加琼脂 , 分装量为 50 m l / 2 50 m l摇瓶 。
1
.
2
.
3 发酵培养基 : 见正交试验结果 。
1 .3 种子液的制备
从活化两次的斜面菌种取 5一 IOm m Z大小的菌苔 10 余块接人种子培养液 , 于 D凡05 往复式摇床 (行
程 s em , 频率 10 0 r / m i n ) 2 8℃培养 4 8 小时 。
l
·
4 正交试验 [7 ]
* 山西省教委基金资助项 目 。
19 9 7一 1 1一 10收到原稿 , 19 9 8刁 6一 1 1收到修改稿
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1999. 01. 016
l 期 赵良启等 :羊肚菌液态发酵的研究 9 5
拟选择碳源 、 氮源 、 生长因子的种类和浓度 、 接种量 、 酸碱度 、 通气量 、 培养温度 、 培养时间等因子进行
正交试验 。 鉴于 因子数量多且试验因子的先后顺序 , 正交试验分为两次进行 , 具体的因子水平安排见表 1
表 1 第一次正交试验的因子水平
T a b le 1 hT
e
fac t
o r
an d
s at nd
a
dr
o f ht e if sr t o hrt
o g o n al et s t欲碳源品种 氮源品种 生长因子品种 酸碱度 接种量 通气量 培养时间V a l l e U e S v a n e it e s v a ir e it e s P H in o c ul l l ll l a e f a it o fl c u l t u ero f e a br o n o f n i tor g e n o f g or w ht S I Z e SI Z e it m eS O l l r C e S O U」℃ e lb c t o r (15 ) (A S) (C刀(V Q (V均 (V G D (% ) ( d )(% ) (% ) (% )
I 葡萄糖 豆饼粉 酵母膏 4石 5 (D 2
9 luc o s e b e a l门 c a k e m e al y e as t e x l r a e t
3 0
.
8 0
一
2
2 玉米粉 蛋白陈 蛋蛹粉 5 . 5 l 0 ( ID 4
111之l l Z e pe p ot ne S i lk w o n l l
m e a l 0
.
5 e h yr
s a li s m e al
3 0
.
2
3 淀粉 N l l礴N ( )」 数皮 6 . 5 l 5 ( I ID 6
S at 戊 h 0 3 w he at b r a ll
3 0
一
2
( l) 为了避免培养基中的颗粒物质影响生物量测定 , 将淀粉 、 玉米粉用 a- 淀粉酶液化 , 将豆饼粉用 住 5% N 自(〕H
12 0℃水解 3 0 im n , 分别取滤液 。 (2 ) 通气量的三个水平 [ ( I ) , ( 11) , ( 111)」分别采用 1 50m l 、 2 50m l 、 SO0m l 的摇瓶均装
50 ml 培养液 。 (3 ) 其他成分的含量为 0 . 1% 凡HP q , 住 05 % K H ZOP 4 , 0 . 1% M gs q ·
( l ) S t
a l℃ h a n d m ia z e m e al w e re li q ue if e d b y s at 戊】l es e o n v e irt gn e nz y m e an d b e an e a k e me al w as 场 dor ly z e d
饰 u s i咫 0 . 5%掬 o H a t 12 0℃ of r 3 o m i n . 仆e if l tar te d li q ul d w as u s e d i n m e d ium ot va o id e阮 e t o f p确 e记 ate s
on b i
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.
( 2 ) U
s ign t l
l r e e fl as k s w iht
e
ap ac iit
e s o f 15 0m l
,
2 5 0m l an d 5 0 0m l
, e ac h fe d w iht 50 m l m e d ium
w e re us e d as ht re e s atn dadr
s o f ae iart
o n s i z e [()I
,
(11) an d ( 111) ]
.
( 3) hT
e e o n te n ts o f o hte
r n u tn e n ts w e re 0
.
1%凡
H p 0 4
,
0
,
0 5% K H ZOP
; , o
,
l % gM s O
4
·
表2 第二次正交试验的因子水平
T a b le 2 hT
e R ` ot r a n d s at n d a dr o f ht e s e e o dn o hrt
o g o n al et s t次 碳源浓度 氮源浓度 生长 因子浓度 培养温度C o n C . o f c a r b O ll e o n e . o f in tor g e n e o cn . o f g or w ht Cul l u r eS O U f C e S O U f C e n比 ot r et m ep r a t u er(C C ) (C峋 ( C G I〕 (刀(% ) (% ) (% ) (℃ )l 1 . 5 0 . 4 0 2 5
2 3
,
0 0名 0 . 1 2 7
3 4
.
5 l 2 0
.
2 2 9
通气量 、 接种量 、 p H 、 培养时间及碳源 、 氮源 、 生长因子的品种根据第一次试验的结果而定 , 其他注释见表 ( 1) 、 (3) 。
们l e ae r a t io n s iz e , in oc ul 确 s i z e , P H,
g r ow ht afC t
o sr w e er d e e ide d b y ht
e er s u lst
C u lut 代 it m e a n` 1
o f if sr t et s t
.
O ht e r
ht e v a ir e it e s o f c a br o n s o t l代 e s m tor g e n s o u cr e s a n〔 1
a ll l o at 妇 0 1 5 s e e n o et ( l ) an d (3 ) o f at b le l
9 6菌 物 系 统 8 1卷
和表 2 。 两次均参照正交表 从 7( 3” )设计表头 , 第一次还安排了碳源品种与氮源品种 、 碳源品种与生长因
子品种 、 氮源 品种与生长因子品种的交互作用考察 , 第二次还安排了碳源浓度与氮源浓度 、 碳源浓度与生
长因子浓度 、 氮源浓度与生长因子浓度的交互作用考察 。
L S 摇瓶发酵
根据正交试验的结果进行摇瓶发酵试验 。
1
.
6 发酵罐深层发酵
使用美国 V IR I , 15 公司生产的 2卜型 自控发酵罐 (两层六平直叶搅拌器 , 双挡板 )进行分批发酵和补
料分批发酵 。 具体发酵条件参考正交试验结果而定 , 在发酵过程中检测菌体形态 、 生物量 、 糖浓度 、 氨基
氮浓度 , 发酵始末测总氮 t8] 。
1 .7 检测
1
.
7
.
1 菌体形态观察 : 涂片 , 美兰染色 , 镜检 。
1
.
.7 2 生物量测定 : 取发酵液 10 一 50 m l , 30 00 x g 离心 15 m in 倾去上清液 , 水洗再离心 , 湿菌体置于恒温
干燥箱内 60 一 70 ℃烘干至恒重 , 称量 , 计算生物量 (细胞干重 , g / )L 。
1
.
.7 3 总糖测定 : 取发酵液 10 ml , 3 00 x g 离心 巧而 n , 取上清液 sml , 加人 10 inl 6m ol / L H C I后沸水浴
30 m in
, 冷却至室温 , 用 10 % N自O H 液中和 ,稀释 , 用 3 , 5一二硝基水杨酸法测定 。
1
.
.7 4 氨基氮的测定 : 离心发酵液及制备上清液的方法同上 , 氨基氮的测定采用苟三酮法 。
2 结果与讨论
2
.
1 培养条件的正交试验
第一次正交试验设置了两组重复试验 , 所获数据经方差分析结果见表 3 。 碳源品种 V( )C 、 生长因子
品种 (V G F ) 、 接种量 (15) 、 培养时间 (C T )的影响高度显著 , 氮源与生长因子的交互作用 (V C x V G F )的影
响显著 , 氮源品种 ( V N )只有一定影响 , 其他因子的影响均不显著 , 通过水平结果比较和交互作用表我们
表3 第一次正交试验方差分析
Tab l
e 3 hT
e v a ir acn
e
an al y
s is o f hte if rs t
o
hrt
o g o n al te s t
.
来源 离差平方和
um
o f s qu
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自由度 均方
M S
F比
F r a t io
d e v ia t l o n
V C
V N
6 7 1 2 6 0刀 3 3 56 3 0 . 4
4 2 8 6 6
.
5 2 14 3 3
.
3
V C X V N 52 8 3 2 7 1 32 0 8
.
2
V G F 1 72 5 2 6
.
9 8 6 2 6 3
.
5
4 6
.
2 0
2
.
9 5
1
.
8 2
1 1
.
8 7
V C 只 V G F 3 3 1 3 2刀 8 2 8 3 .0
V N X V G F 1 1 1 1 7 3
.
8 2 7 79 3 5
1
.
14
3
.
8 3
, .,úq产4
:
2 7 7 7 5
.
6 1 3 8 8 7
.
8
2 0 6 8 3
,
7 10 3 4 1
.
9
17 2 1 7 3
.
0 8 6 0 8 6乃 1 1 9 0
2 0 4 3 3 3
.
0 10 2 16 6石 1 4刀7
19 6 0 9 8 9
ASPHISCT
。
F0
1
(2
,
2 7 ) 二 2
·
5 1
,
0F
刀 5
( 2
,
2 7 ) = 3
·
3 5
,
oF
o l
( 2
,
2 7 ) = 5 4 9
,
0F
」
( 4
,
2 7 ) = 2
·
1 6 5
,
0F
刀 5 (4
,
2 7 ) = 2 7 3
0F
刀 1
(4
,
2 7 ) = 4
·
1 1
, * F ar it
o >
0F
注 , * * F 助 。 < oF o s , * * * , F ar it o > 0F 刀 : ·
确定以淀粉作碳源 , 豆饼粉作氮源 , 酵母膏作生长因子 , 培养时间为 4 天 。 至于接种量 , 虽然 15 % 接种量
的结果较好于 10% 的接种量 , 但考虑到设备与操作方面的问题 , 我们采取后者 。 p H 、 通气量影响不显著 ,
赵良启等 :羊肚菌液态发酵的研究
第二次正交试验方差分析
Tb al
e 4
离差平方和
ul n
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表4
Tll e v a nc an
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自由度
d f
均方
M S
F比
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C C
C N
C C X C N
C G F
C C X C G F
C N X C G F
2 15 5 4 5 2. 9
2 5 92 7 2
.
7
5 93 5 9
,
l
1 74 0 9 6 4
80 2 69
.
0
1 32 0 6 5
.
1
1 84 4 4 74 3
1 9 7 3 5 8
.
9
6 2 7 7 2 9
.
6
1 2 9 6 3 6 4
1 4 8 3 9
,
8
8 7 0 4 8 2
2 0 0 6 7
.
3
3 3 0 16
.
3
9 2 2 2 3 7
,
2
10 5 0 0
2 1
.
60
2 4 8
1 4
.
5 6
3
.
3 6
5 5 2
1 5 4
.
7 0
0F
」( 2 , 33 ) = 2 4 7 , oF
o s ( 2
,
3 3 ) = 3 2 8 5
,
oF
o l ( 2
,
3 3 ) = 5 3 2
,
0F
」
(4
,
3 3) = 2
·
1 2
,
oF
o s (4
,
3 3 ) = 2
·
6 6
,
瓦0l( 4 , 3 ) = 3乡4 , * F iart 。 > 乓 1 , * * F ar iot < 瓦。 5 * * * , F iart o > 乓。 l ·
取 p 6H
.
5
, 以 50 m l培养液 /2 50 m l摇瓶进行以后的实验 , 第二次正交试验的数据经方差分析结果见表 4o
显然培养温度 ( )T 、 碳源淀粉浓度 ( C C ) 、 氮源豆饼粉浓度 (C N ) 、 生长因子酵母膏浓度 (C G F )的影响均呈
高度显著 ,其显著性排序为 T > C C > C N > C G F 。 交互作用 CN x C G F 、 C C x C G F 、 C C x C N 的影响分别
为高度显著 、 显著 、 有一定影响 。 根据水平比较和交互表的结果 , 我们选择淀粉浓度为 4 . 5% , 豆饼粉浓度
为 1 . 2% , 酵母膏浓度为 0 . 1% , 培养温度为 27 ℃ 。
通过两次正交试验 , 我们得到了 以下结果 : ( l) 初步确定了液态条件下培养羊肚菌试验菌株的培养基
配方 ; (2) 培养液的酸碱度在 4 . 5一 6 . 5 之间对试验菌株的生长影响不大 ; ( 3) 试验菌株的液态发酵对供氧
的需求量小 ; (4) 试验菌株对培养温度无特殊要求 , 27 ℃培养效果最好 ; (5) 摇瓶发酵时间 4 天为宜 , 超期
细胞 自溶 , 生物量反而下降 。
.2 2 摇瓶发酵
依照正交试验选定的培养液配方和培养条件 , 以 4 . 5% 的淀粉和 .6 6% 的玉米粉 (淀粉分量也为 4 . 5% )
作碳源进行三次重复摇瓶发酵 , 平均结果见表 5 。 这些参数不仅表示了在摇瓶发酵条件下的发酵水平 , 而
表5 摇瓶发酵参数
T abl
e S T】l e P
amr
e et sr o f het fl
a s k fe mr
e n帅 o n
培养基 初糖浓度
e o nc
.
o f
残糖浓度 耗糖率
e o
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.
o f s u vr i v al e o n s uxn
e d s ug ar
生物量
ib 0 Il l a S S
生长速率
g or w ht
m e id l l ll l be g iin n g s u g ar
( g / )L
S
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(g / )L ( g / )L [g / (L
·
h) ] (g / g )
淀粉培养基
S t a r Ch
n l e id u ln
玉米粉培养基
m ia z e m
e al
n l e id l l们n
4 5
.
6 19
.
8 0
.
2 0 6 0
.
7 1
4 4
.
8 15
.
6 2 1
.
5 0
.
2 2 4 0
.
7 4
O
、 .,一只é,一阁(0’一625
y
、 , s为干细胞对基质的得率系数 , ( g / g o)
y
、 z , 15 het y i
e ld c co if c i e in o f d刁 c e l l ot het sub saetr
(g / g )
·
卷夕吕 菌 物 系 统 18
且表明了在大生产中完全可以用玉米粉取代淀粉 , 这样便可大幅度地降低生产成本 。
毛
ǎé谕à的胃ujo日咖孚叫
100
80
60
40
2 0
0
(%à己喊怜ǎ山锄日à。uo之。,国ǎ曰,haà吕。翔助ns侧长案
20 40 6 0 80
时间 T一m e (h )
图 1 M c口 in c“ eP sr .的分批发酵 。
令 p H ; O 溶氧饱和度 (oD , % ) ; △ 生物量 (干细胞量 , g / )L ;
R g
.
I T】l e b act h fe rm e n ta t io n o f 从
X N H
确一 (m g / L ) ; 口 糖浓度 ( g / L ) 。
e o n i e a P e rs
.
今 p H : 0 T I〕 e s a t t lr a it o n 详 cr e n agt e o f d i s s o lv e d o x y g e n (助 , % ) ; △ B io m a s s ( d即 e e ll w t , g / )L :
X N H 闷一N( m g / L ); 口 s雌 ar c o cn e n tar it o n (g / L ) ·
.2 3 液态深层发酵
2
.
3
.
1 分批发酵 : 以 4 . 5% 淀粉为碳源 , 1 . 2% 豆饼粉为氮源 , 0 . 1% 酵母酶解粉作生长因子 , 其余培养液成
分如前所述 。 装料体积为 1 . 5 L , 接种量 10% , 控制温度 27 ℃ , 通气量 0 . 5[ L / (L · m i n) ] , 搅拌转速 50 r /
表 6 液态发酵参数
T a b le 6 hte Parm
e te r s o f hte l i q
u id fe rm
e n at it o n
参 数 分批发酵 补料分批发酵
P a r a ll l e te r s b a忱 h fe n l l e n at it o n fe d 一b a tC h fe n ll e n t a t】o n
淀粉培养基 淀粉培养基 玉米粉培养基
s t a r e h rn e d i l ll l l S at cr h m e d i l l l l l m ia z e m
e al m e id u l l l
培养时 l’de e u ltu re it m e 7 2 5 6 5 4
( h ) 18 2 2 5 .4 2 7
.
4
生物量 b io m a s s 0 . 3 2 0碑5 0 . 5 1
( g / L ) 4 4
.
3 14兮 1 5 . 2
生长速率 g or w ht arte 16
.
5 2 3
.
5 2 4
[ g /( L
·
h )」 2 7 , 8 3 2 . 5
初糖浓度 e o cn . o f b e g in in n g s雌 a r 0 . 6 5 3 5 4 3 6 . 7
( g / L) 0
.
7 2 0
.
7 5
补糖量 fe d 一s u g a r s iz e
(g / L )
残糖浓度 e o cn . o f s u yr , v a l s u g ar
( g / L )
耗糖量 e o n s u m e d s u g a r
( g / L )
y
x /s
赵良启等 : 羊肚菌液态发酵的研究
m in
, 自动监测溶氧和 p H , 每 8 小时取样镜检菌丝形态 , 测定生物量 、 糖浓度 、 a 一氨基氮 。 经 72 小时的发
酵 , 结果见图 1 和表 6 。 分批发酵的结果表明 , ( l) 生长阶段 , 在实验条件 下 0一 20 小时为延滞期 , 20 一 40
小时为对数期 , 以后进人稳定期和衰亡期 。 细胞在衰亡期开始 自溶 , 放罐时间应确定在稳定期 。 (2) 耗氧
量 , 尽管我们采用的通气量不大 , 但是即使在对数生长期溶氧浓度仍未低于 25 % , 说明通气量还可进一步
降低 。 (3) 发酵过程中发酵液的 p H 最低降至 3 . 0 , 在今后的发酵中最好适当上调 p oH
.2 3
.
2 补料分批发酵 : 以 1 . 5% 淀粉 (或相当淀粉含量的 玉米粉 )为碳源 , 1 . 2% 豆饼粉为氮源 , 其他成分同
分批发酵 。 初始装料体积 1 . 2 L , 接种量 10 % , 培养温度 27 ℃ , 通气量 .0 2一 0 . 30[ L / (L · im n) ] , 搅拌转速
20 0一 4 00 r / m in , 控制溶氧在 40 % 一 1 0% , 以 6 m ol / L N a O H 调节 p 6H
.
5左右 。 在发酵过程中根据糖浓度
补加 50 % 淀粉 (玉米粉 )酶解液 , 保持糖浓度在 1 . 0% 一 1 . 5% 之间 , 放罐前 8一 12 小时停止补糖 。 发酵结果
见表 o6
从补料分批发酵的结果来看 , 羊肚菌试验菌株液态深层发酵的产物得率已达到真菌菌液态发酵的正
常水平 , 具备了投人工业生产的可能性 。
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A S T LJD Y O N L I QUI D F E R M E N T A T I O N O F 泪吟R C H E L L月 C 口八仔〔月
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