全 文 ：·论　　著·
球药隔重楼凝集素的抗肿瘤活性及机制研究＊
袁志平１，张　巍２，牟华平１，王立帅１，王　秋１
（１．四川省宜宾市第二人民医院肿瘤科，四川宜宾６４４０００；２．四川大学
生物治疗国家重点实验室，四川成都６１００４１）
　　摘　要：目的　探讨球药隔重楼中分离得到的球药隔重楼凝集素（ＰＦＬ）的肿瘤细胞毒性及其可能的机制。方法　用交换层
析法纯化ＰＦＬ同源二聚体；通过噻唑蓝（ＭＴＴ）法、形态学观察、乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）法、糖蛋白阻断分析等方法分析ＰＦＬ对肿瘤细
胞增殖的抑制情况及其机制。结果　ＰＦＬ对宫颈癌 ＨｅＬａ、肝癌 ＨｅｐＧ２以及鼻咽癌ＣＮＥ－２细胞增殖都有抑制作用。ＰＦＬ的糖结
合位点被甲状腺球蛋白阻断后对肿瘤细胞生长的抑制活性明显降低，表明ＰＦＬ是通过识别ＣＮＥ－２细胞表面的糖链作用于细胞，
并诱导细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶（ｃａｓｐａｓｅ）家族抑制剂的研究表明ＰＦＬ是通过经典的ｃａｓｐａｓｅ途径诱导ＣＮＥ－２细胞凋亡。结
论　ＰＦＬ可通过ｃａｓｐａｓｅ途径诱导肿瘤细胞凋亡。
关键词：球药隔重楼；凝集素；细胞凋亡；ｃａｓｐａｓｅ途径
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－８３４８．２０１４．１３．００５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－８３４８（２０１４）１３－１５４９－０３
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＰＦＬ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ＊
Ｙｕａｎ　Ｚｈｉｐｉｎｇ１，Ｚｈａｎｇ　Ｗｅｉ２，Ｍｕ　Ｈｕａｐｉｎｇ１，Ｗａｎｇ　Ｌｉｓｈｕａｉ１，Ｗａｎｇ　Ｑｉｕ１
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｐｅｏｐｌｅ′ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｙｉｂｉｎ，Ｙｉｂｉｎ，Ｓｉｃｈｕａｎ６４４０００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐａｒｉｓ　ｆａｒｇｅｓｉ　ｆｒａｎｃｈ　ｌｅｃｔｉｎ（ＰＦＬ）ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ＰＦＬ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ，ｃｅｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ＬＤＨ　ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｂａｓｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙｓ
ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｏｂｊｅｃｔｓ　ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ　ａｂｏｖｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＰＦＬ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ
ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ＨｅＬａ，ＨｅｐＧ２ａｎｄ　ＣＮＥ－２ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ＣＮＥ－２ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉ－
ｔｙ　ｗａｓ　ａｂｒｕｐｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ，ｓｕｇｇｅｓｅｄ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ　ｉｎ　ｂｉｂｉｔｏｒｙ　ｓｈｎｏｅｄ　ｔｈａｔ　ＰＥＬ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＣＮＥ－２ｃｅｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｄａｓｓｉｃ　ｃａｓｐａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＰＦＬ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｔｈｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ
ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐａｒｉｓ　ｆａｒｇｅｓｉ　ｆｒａｎｃｈ；ｌｅｃｔｉｎ；ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｃａｓｐａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ
　　凝集素在自然界中分布极为广泛，在生物体内发挥着重要
作用，他们与细胞间黏附、细菌感染宿主、受体介导的胞饮、胚
胎发育和机体代谢的调节控制、宿主清除入侵细菌、分子传递、
植物防御病原体等生理过程密切相关［１－２］。近来，多种凝集素
还被证明具有血小板凝集、抗病毒、促进淋巴细胞分裂、抗菌和
保护造血干细胞的功能［３］，同时还具有抗肿瘤、诱导肿瘤细胞
凋亡和自噬的作用［４］。在抗肿瘤方面，植物凝集素体现在抑制
肿瘤细胞的增殖，抑制方式主要包括促肿瘤细胞凋亡和细胞毒
性［５－６］。这些作用为凝集素在医学上的研究和应用指明方向，
开辟更广阔的领域。
重楼是多年生草本，具有清热解毒、消肿等功效。此外，还
有祛痰抑菌、抗癌止血的作用。重楼属植物是宫血宁、云南白
药和季德胜蛇药片等多种药物的主要原料。因为其突出的药
用价值，近年来成为研究重点和热点。目前研究较多的是重楼
的小分子物质：甾体皂苷，该物质具有止痛、止血、抗肿瘤、免疫
调节和阻孕等多种生理活性［７］。目前国内外对重楼活性成分
的研究主要集中于皂苷分子，而对活性蛋白的报道却很少。因
此，本研究分离得到球药隔重楼凝集素（ｐａｒｉｓ　ｆａｒｇｅｓｉ　ｆｒａｎｃｈ　ｉｅｃ－
ｔｉｎ，ＰＦＬ）的基础上，对其抗肿瘤活性进行详细分析，为其以后更
深入的研究和应用打下基础。本文所研究的球药隔重楼取自四
川彭州，主要生长于常绿阔叶林、竹林、杂木林或者灌丛中。
１　材料与方法
１．１　材料　球药隔重楼块状根茎采于四川彭州；鲜兔血采于
市场；宫颈癌细胞株 ＨｅＬａ，肝癌细胞株 ＨｅｐＧ２和鼻癌细胞株
ＣＮＥ－２均购自美国ＡＴＣＣ公司；离心机购自美国Ｂｅｃｈｍａｎ公
司；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ质谱购自 Ｗａｔｅｒｓ公司；电泳仪 Ｐｏｗｅｒ－
Ｐａｃ３００购自Ｂｉｐ－ＲＡＤ公司。主要试剂：ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ＣＭ－
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１００均购自Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；十二烷基
硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）低分子量蛋白购自
Ｔａｋａｒａ公 司；蛋 白 抑 制 剂 ｚ－ＩＥＴＤ－ｆｍｋ、ｚ－ＤＥＶＤ－ｆｍｋ和 ｚ－
ＶＡＤ－ｆｍｋ购自Ｓｅｌｅｃｋ公司。
１．２　方法
１．２．１　ＰＦＬ的分离纯化　球药隔重楼根茎打成粉末，用生理
盐水浸泡２４ｈ，过滤后离心（１０　０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ），收集上清
液。上清液用ｐＨ　８．５，４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ充分透析并用此
ｐＨ条件ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ层析，用０～０．５ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＣｌ溶
液进行梯度洗脱。兔血细胞检测并收集活性部分，再用ｐＨ
４．８，２０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸钠缓冲液进行充分透析，以此ｐＨ 条件
９４５１重庆医学２０１４年５月第４３卷第１３期
＊ 基金项目：２０１２年四川省宜宾市科技自主创新专项基金资助项目（２０１２ＺＳＦ００４）。　作者简介：袁志平（１９７３－），副主任医师，博士，主要
从事肿瘤临床研究。
ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析，用０～０．５ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＣｌ溶液
进行梯度洗脱，洗脱过程同样以兔血细胞检测活性，收集活性
部分。活性蛋白溶液用ｐＨ　７．０，２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液
（ＰＢＳ）透析，并以相同的缓冲液平衡Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１００凝胶过滤
柱。样品液以０．５ｍＬ／ｍｉｎ的流速上柱，以兔血细胞检测活
性，收集活性部分，透析，冷冻干燥。
１．２．２　分子量测定　用 ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ质谱精确测定ＰＦＬ
的分子量；用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行不连续变性和非变性的Ｔｒｉｃｉｎｅ－
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，测定凝集素亚基的分子量。
１．２．３　蛋白基本性质　凝血活性的测定：用２０μＬ样品与２０
μＬ生理盐水进行倍比稀释，再加入红细胞悬液，震荡５ｍｉｎ，在
室温放置１ｈ后，显微镜观察结果。凝血活性的最高稀释倍数
的倒数为凝血活性单位［８］。糖抑制实验：将糖或糖蛋白用生理
盐水倍比稀释，加入ＰＦＬ，振荡混匀３０ｍｉｎ后，每孔依次加入
２％的兔血红细胞悬液，振荡３０ｍｉｎ，检测凝血活性。ＰＦＬ初
始量为８个凝集活性单位。
１．２．４　抗肿瘤活性　采用 ＭＴＴ方法，观察 ＰＦＬ对宫颈癌细
胞株 ＨｅＬａ，肝癌细胞株 ＨｅｐＧ２和鼻癌细胞株ＣＮＥ－２的细胞
毒性。取对数生长期的各种细胞，接种于培养板中，每孔１００
μＬ（１　１０４ｃｅｌ／ｍＬ），培养２４ｈ，加入不同浓度的 ＰＦＬ（ＰＦＬ
组），置培养箱中４８ｈ。后每孔加入１０μＬ（５ｍｇ／ｍＬ）ＭＴＴ，培
养４ｈ。弃培养基，后在５７０ｎｍ处测吸光度（Ａ）值。细胞存活
率（％）＝ＰＦＬ组Ａ值／对照组Ａ值×１００％，其中，对照组为未
经任何处理的细胞。
１．２．５　乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活力测定　将ＣＮＥ－２细胞接种于
孔培养板，１２ｈ后加入不同浓度的ＰＦＬ，培养２４ｈ收集细胞，
加入ＬＤＨ底物（ｐＨ　８．２，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　１０ｍＬ中各组
分浓度为：ＰＭＳ　０．２８ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｌ（＋）－乳酸０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＩＮＴ
０．６６ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮＡＤ＋１．３ｍｍｏｌ／Ｌ），分别测定上清液中各指
数。坏死指数：ＬＤＨ 数量（ＬＤＨｎ）；凋亡指数：悬浮细胞中的
ＬＤＨ数量（ＬＤＨａ）；细胞内ＬＤＨ 指数：培养板中贴壁细胞中
的ＬＤＨ 数量（ＬＤＨｉ）。计算公式为：凋亡率（％）＝ＬＤＨａ／
（ＬＤＨａ＋ＬＤＨｎ＋ＬＤＨｉ）×１００％，坏 死 率 （％）＝ＬＤＨｎ／
（ＬＤＨａ＋ＬＤＨｎ＋ＬＤＨｉ）×１００％。
１．２．６　ＰＦＬ作用于肿瘤细胞后的形态观察　取处于对数生
长期的ＣＮＥ－２细胞，接种于培养板中（１．０×１０４／ｍＬ），培养２４
ｈ后，在倒置显微镜下观察。对照组加培养基，实验组加入
ＰＦＬ（浓度２ｐｍｏｌ／Ｌ），培养２４ｈ，用碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏ－
ｄｉｄｅ，ＰＩ）染色，荧光显微镜下观察。
１．２．７　糖蛋白抑制后的抗肿瘤活性　取对数生长期的ＣＮＥ－
２细胞，接种于培养板（每孔１００μＬ，１×１０
４／ｍＬ），培养２４ｈ，
加入被糖蛋白抑制凝血活性后的ＰＦＬ（２ｐｍｏｌ／Ｌ），继续培养
２４ｈ，用 ＭＴＴ法测定Ａ值，计算细胞抑制率。
１．２．８　蛋白抑制剂对抗肿瘤活性的影响　取对数生长期的
ＣＮＥ－２细胞，接种于培养板（每孔１００μＬ，１×１０
４／ｍＬ，培养２４
ｈ，加入蛋白抑制剂（ｚ－ＩＥＴＤ－ｆｍｋ、ｚ－ＤＥＶＤ－ｆｍｋ和ｚ－ＶＡＤ－ｆｍｋ）
作用１ｈ，加入ＰＦＬ，继续培养２４ｈ，用 ＭＴＴ法测定Ａ值。
２　结　　果
２．１　基本性质　Ｓ－１００层析检测出天然状态ＰＦＬ表观分子量
约为 ３３×１０３，Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 表 明 ＰＦＬ 的 分 子 量 为
１３．２×１０３ 和１９．１×１０３ 的２个亚基组成，质谱分析ＰＦＬ亚基
的分子量分别为１２．７５×１０３ 和１８．９９×１０３，结果综合表明该
凝集素是由两个不同分子量的亚基组成的同源二聚体，亚基间
以二硫键的形式连接。凝血活性研究 ＰＦＬ在浓度为０．０１
ｐｍｏｌ／Ｌ时仍能凝集兔红细胞，具有很强的凝血活性；糖抑制实
验结果显示甲状腺球蛋白能抑制该凝集素的凝血活性，且完全
抑制４个凝集活性单位的甲状腺球蛋白最低浓度为０．５８
ｐｍｏｌ／Ｌ。
２．２　抗肿瘤活性　ＰＦＬ对鼻癌细胞ＣＮＥ－２细胞抑制活性更
强，在浓度为２ｐｍｏｌ／Ｌ时能达到４８．１％的抑制率；同浓度下
对宫颈癌 ＨｅＬａ细胞和肝癌 ＨｅｐＧ２细胞分别达到２８．３％和
１９．１％的抑制率，见图１。在所测定的细胞系中，ＰＦＬ对ＣＮＥ－
２细胞抑制活性最强，故选取其作进一步的研究对象。
２．３　ＰＦＬ作用于肿瘤细胞后的形态观察　在细胞形态上，对
照组细胞连接紧密，大小均匀，发出均匀的荧光；而加ＰＦＬ组
的细胞变圆，细胞皱缩，荧光变得致密，细胞正处于形成凋亡小
体的过程中。说明ＰＦＬ可以诱导ＣＮＥ－２细胞凋亡，见图２。
图１　　ＭＴＴ法测定ＰＦＬ的细胞毒性
　　Ａ：对照组；Ｂ：ＰＦＬ组。
图２　　ＣＮＥ－２细胞的形态观察
２．４　ＬＤＨ活性测定　细胞死亡的方式有坏死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）和凋
亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）两种。本研究通过测定不同时间后ＬＤＨ 的活
力，来确定ＰＦＬ诱导ＣＮＥ－２细胞的死亡方式。测定的结果显
示，当培养２４ｈ，ＰＦＬ 的浓度为２ｐｍｏｌ／Ｌ，细胞凋亡率为
３５．２％，细胞坏死率为１３．５％；４８ｈ后，细胞的凋亡率为
５３．２％，而细胞的坏死率仅为１９．１％，见图３。可见，ＰＦＬ作用
于肿瘤细胞以诱导凋亡为主。
图３　　ＬＤＨ活性测定分析图
２．５　ＰＦＬ诱导细胞凋亡机理的初步研究
２．５．１　糖结合位点被阻断后对肿瘤细胞凋亡的影响　ＰＦＬ
的糖结合位点被甲状腺球蛋白抑制后对肿瘤细胞生长的抑制
活性如图４所示，当糖结合位点被糖蛋白半抑制后，ＰＦＬ对
０５５１ 重庆医学２０１４年５月第４３卷第１３期
ＣＮＥ－２细胞生长的抑制活性明显降低，抑制率降为１３．２％，全
抑制后，抑制率仅为４．１％。可见，ＰＦＬ是通过识别ＣＮＥ－２细
胞表面的糖链作用于细胞，并诱导细胞凋亡。
２．５．２　蛋白抑制剂对ＰＦＬ诱导的ＣＮＥ－２细胞凋亡的影响　
ｃａｓｐａｓｅ－８和ｃａｓｐａｓｅ－３以及整个ｃａｓｐａｓｅｓ家族的抑制剂（ｚ－
ＩＥＴＤ－ｆｍｋ、ｚ－ＤＥＶＤ－ｆｍｋ和ｚ－ＶＡＤ－ｆｍｋ）对ＰＦＬ诱导的细胞凋
亡的影响如图５所示。分别加入ｃａｓｐａｓｅ－８和ｃａｓｐａｓｅ－３的抑
制剂 ｚ－ＩＥＴＤ－ｆｍｋ、ｚ－ＤＥＶＤ－ｆｍｋ 和 ｚ－ＶＡＤ－ｆｍｋ 后，ＰＦＬ 对
ＣＮＥ－２细胞生长的抑制率明显降低，表明抑制剂的加入可抑
制细胞凋亡，就说明ＰＦＬ是通过激活ｃａｓｐａｓｅｓ家族而诱导细
胞凋亡的，ｃａｓｐａｓｅ－８和ｃａｓｐａｓｅ－３参与了ＰＦＬ诱导的 ＣＮＥ－２
细胞的凋亡。
图４　　糖结合位点被阻断后的ＰＦＬ对ＣＮＥ－２
细胞凋亡的影响
图５　　ｃａｓｐａｓｅ抑制剂对ＰＦＬ诱导的ＣＮＥ－２细胞
凋亡的影响
３　讨　　论
重楼作为药用价值突出的中药材，成为近年来的研究重点
和热点。目前，国内外对于重楼的活性成分，特别是对甾体皂
苷做了充分的研究，证明其具有止痛、止血、抗肿瘤、免疫调节
和抗生孕等多种生理活性。然而，对重楼活性蛋白的报道却很
少见。本研究从球药隔重楼中分离得到一种活性蛋白ＰＦＬ。
该蛋白是由两个不同相对分子质量１２．７５×１０３ 和１８．９９×１０３
的亚基组成的同源二聚体，此结构在凝集素中较为罕见。由于
重楼属于百合科植物，曾有报道表明从百合科土茯苓根茎纯化
出来的土茯苓凝集素也分别是由相对分子质量为１５×１０３ 和
１７×１０３ 的２个亚基组成［９］，这两种凝集素的分子亚基构成上
具有很大的相似性。凝血活性研究表明，ＰＦＬ在浓度为０．３６
μｇ／ｍＬ时仍能凝集兔红细胞，与其他凝集素相比，显示很强的
凝血活性；糖抑制实验结果显示甲状腺球蛋白能抑制该凝集素
的凝血活性。
最近的一些研究显示，植物凝集素具有显著的抗肿瘤活
性，这使得学术界对于凝集素抗癌的机制给予了更多的关注。
鉴于ＰＦＬ强凝血活性和特殊的分子结构，作者着重研究了其
抗肿瘤活性。ＭＴＴ法检测表明ＰＦＬ对宫颈癌 ＨｅＬａ株、肝癌
ＨｅｐＧ２株以及鼻咽癌ＣＮＥ－２细胞株的生长都有抑制作用；而
对不同细胞系抑制作用的不同，可能与不同肿瘤细胞表面的糖
蛋白结构和构象的不同有关。ＰＦＬ对ＣＮＥ－２细胞呈现明显的
细胞毒性，且能通过时间依赖性和剂量依赖性的方式引起
ＣＮＥ－２细胞凋亡。当ＰＦＬ的糖结合位点被甲状腺球蛋白全抑
制后对肿瘤细胞生长的抑制活性明显降低，提示ＰＦＬ是通过
识别ＣＮＥ－２细胞表面的糖链而作用于细胞，并诱导细胞发生
凋亡。
细胞凋亡在多细胞动物进化过程中扮演着极其重要的作
用。因此，如果能研究清楚抑制肿瘤生长的细胞凋亡分子机制
或信号通路，对于开发抗肿瘤药物至关重要［１０］。有研究显示，
凝集素的糖结合位点以及其他一些位点具有诱导细胞凋亡活
性［１１］。ＣｏｎＡ是第一个报道的具有抑制肿瘤细胞活性的豆类
凝集素。它能通过ｃａｓｐａｓｅ依赖途径和线粒体凋亡途径诱导
Ａ３７５细胞程序性死亡［１２］。黄精凝集素作为甘露糖结合凝集
素，能通过线粒体介导途径诱发肿瘤细胞的凋亡和自噬［１３］。
本研究揭示ＰＦＬ能通过典型的ｃａｓｐａｓｅ依赖型的细胞凋亡诱
发肿瘤细胞，该过程有３个ｃａｓｐａｓｅ抑制因子参与，特别是
ｃａｓｐａｓｅ－３和ｃａｓｐａｓｅ－８的抑制因子。ｃａｓｐａｓｅｓ激活级联反应在
凋亡调控中占核心作用，它有２条主要途径：线粒体依赖途径
和死亡介导途径［１４］。不同刺激信号经各自途径启动不同的
ｃａｓｐａｓｅｓ级联反应，进而激活下游的效应ｃａｓｐａｓｅｓ，诱发细胞凋
亡。不过，鉴于ＰＦＬ本身结构和性质的特殊性，其诱发肿瘤细
胞凋亡的机制目前还不如甘露糖结合凝集素或豆类凝集素清
楚。因此，后续的研究应该关注于阐述该凝集素诱导凋亡的具
体过程。
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ｍｉｎａｌ　ｋｉｎａｓｅ　１（ＪＮＫ１）ｉｎ　ｍｉｓｔｌｅｔｏｅ　ｌｅｃｔｉｎ　ＩＩ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐ－
ｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｙｅｌｏｌｅｕｋｅｍｉｃ　Ｕ９３７ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０００，６０（１１）：１６８５－１６９１．
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ｄｕｃｅｓ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｈａｓ　ａ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｅｆｆｅｃｔ　ｉｎ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏ－
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ａｎｔｉｈｅｐａｔｏｍａ　ａｎｄ　ａｎｔｉｓａｒｃｏｍａ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｏｙｓｔｅｒ
ｍｕｓｈｒｏｏｍ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｏｓｔｒｅａｔｕｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ，２０００，２７５（３）：８１０－８１６．　　 （下转第１５５４页）
１５５１重庆医学２０１４年５月第４３卷第１３期
房和（或）左房伞盘开始持续的压迫心房壁或主动脉壁。至于
发生压迫原因可能是由于，伞盘开始失去可塑性，另外，封堵后
心房容积减小，这些可能是导致影响接触型到间断压迫型改变
的原因。但是新的内膜形成可以阻止患者主动脉磨损，认为间
断压迫的危险性较低。仍然存在争议的是什么形状的封堵器
带来磨损的危险性。在较大的主动脉边缘患者中，一些作
者［１１－１４］认为主动脉边缘张开，那么磨损的危险性降低，在选择
的主动脉边缘缺乏，由于封堵器较大，磨损的危险性就较大。
本组研究中，主动脉侧张开的形状随时间推移变为紧贴
型。这些病例可能比刚置入时就紧贴的封堵器较日后的磨损
危险性大，刚置入时封堵器在主动脉侧呈张开形状，可以减少
对冠状静脉窦壁的磨损，但它可能增加上方心房壁的磨损。如
果置入即刻封堵器会持续压迫心房壁和（或）主动脉壁，就要换
小一点的封堵器。因此在封堵器置入后，对封堵器和主动脉壁
和心房壁关系的观察是必要，这样才能预防封堵器对心房壁、
主动脉壁的磨损。
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４５５１ 重庆医学２０１４年５月第４３卷第１３期