全 文 ：超高效液相色谱串联质谱法测定银耳中
米酵菌酸
周鹏
（福建省产品质量检验研究院，福建福州 350002）
摘 要：建立了快速测定银耳中米酵菌酸的超高效液相色谱串联质谱分析方法。样品采用甲醇提取，混合强阴离子
交换固相萃取柱（PAX）净化，UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）色谱柱分析，以 10 mmol/L乙酸铵-乙腈为流动相，梯
度洗脱，串联四级杆质谱多反应监测负离子模式检测，基质匹配外标法定量。结果表明，米酵菌酸在 1.6 μg/L~80 μg/L线
性范围内，相关系数（r）0.999 9，检出限 0.5 μg/kg，加标回收率 82 %～102 %，相对标准偏差 RSD≤8.5 %。本方法快捷准
确、灵敏度高，可用于银耳中米酵菌酸的确证方法。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；米酵菌酸；银耳；固相萃取；基质效应
Determination of Bongkrekic Acid in Tremella Fuciformis Berk by Ultra High Performance Liquid
Chromatography-tandem Mass Spectrometry
ZHOU Peng
（Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，Fuzhou 350002，Fujian，China）
Abstract：A method based on ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem mass
spectrometry （UHPLC -MS/MS） was developed for determination of bongkrekic acid （BAK） in tremella
fuciformis berk. The sample was extracted with methanol， and then cleaned up by anion exchange solid-phase
extraction （SPE）. The target analyte was separated on UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm） column， 0.01 mol/L
ammonium acetate and acetonitrile as the mobile phase gradient elution， detected by MS/MS system under
negative electrospray ionization（ESI-） mode with multiple reaction ion monitoring（MRM）.The detection limit
was 0.5 μg/kg. The linear correlation coefficient was 0.999 9. The recovery ranged from 82 % to 102 % with
RSD less than 8.5 %. This method was suitable for the identification and quantification of bongkrekic acid in
tremella fuciformis berk due to its simplicity， good purification and high sensitivity.
Key words：ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UHPLC-MS/MS）；
bongkrekic acid （BKA）； tremella fuciformis berk； solid phase extraction （SPE）； matrix effect
食品研究与开发
Food Research And Development
2015年 11月
第 36卷第 22期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.031
基金项目：福建省科技厅民生科技专项资助项目（2013Y6003）
作者简介：周鹏（1980—），男（汉），工程师，硕士，研究方向：复杂体
系分离分析。
米酵菌酸（bongkrekic acid，BKA）是椰毒假单胞
菌酵米面亚种代谢物中的一种，它存在于发酵食品、
变质银耳等食物中，毒性较强，食用者会出现恶心、呕
吐、抽搐、休克等中毒症状，损伤肝、脑神经细胞以及
肾脏组织[1-2]，致死率高达 40 %～100 %，在我国引起多
起食物中毒事件，需严加防范。近期研究又发现米酵
菌酸对细胞线粒体通透性转换孔有抑制作用，从而又
开始对米酵菌酸的生物合成及其在细胞凋亡、损伤等
方面展开了大量的研究[3-8]。在我国最新颁布的相关标准
中[9-10]明确规定了银耳中米酵菌酸含量小于 0.25 mg/kg。
目前米酵菌酸的检测方法较少，主要有液相色谱法[11]、
薄层色谱法[11]以及紫外分光光度法 [12]，液质联用分析
法还鲜见报道。现有方法处理复杂，灵敏度差、易受到
样品基质的干扰，使得测定结果出现偏差。根据我国
相关规定：基于色谱分析而没有使用分子光谱测定的
方法，不能用于确证方法[13]。因此，急需开发一种处理
快速、特异性强、灵敏度高的分析方法，作为银耳中米
检测分析
123
酵菌酸的确证方法。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
1290超高效液相色谱仪串联 6490三重四级杆质
谱仪：均为美国 Agilent公司；离心机：Avanti；J-E冷冻
高速离心机：美国贝克曼公司；DS-8510 DTH超声波
清洗机：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；VOR－
TEX MAX II型涡旋混合器：美国 Thermo Scientific公
司；固相萃取仪：美国安捷伦科技公司。
1.0 mg/mL米酵菌酸标准品：Sigma公司；甲醇、乙
腈、甲酸（均为色谱纯）：美国 Merck公司；乙酸铵（优级
纯）：北京百灵威科技公司；氢氧化钠、氨水、磷酸（均为
分析纯）：国药集团；试验用水：milli-Q制备的超纯水；
混合强阴离子交换固相萃取柱（PAX，60 mg/3 mL）：艾
杰尔公司。
1.2 标准溶液的配制
准确移取 0.50 mL 标准品溶液于 25 mL 容量瓶
中，甲醇定容，配制成 20 mg/L的标准储备液。分别移
取适量的标准储备液用 50 %甲醇溶液稀释定容，配制
成系列标准工作溶液，4℃下避光保存。
1.3 液相色谱条件
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Waters BEH C18>2.1×100 mm>1.7 μm；柱
温：40 ℃；进样量：2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流动相 A：
0.01 mol/L乙酸铵，流动相 B：乙腈。梯度洗脱程序为：
0~4 min，20%B-40%B；4.01min~6 min，90%B；6.01 min~
8.0 min，20 % B。
1.3.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子
模式；监测模式：多反应监测（MRM）；脱溶剂气温度：
160℃；脱溶剂气流速：16 L/min；雾化气压力：241.3 kPa；
鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L /min；毛细管电压：
3 000 V；喷嘴电压：0 V。监测离子对为 485.1/441.1、
485.1/397.2，定量离子对为 485.1/441.1。
1.4 样品前处理
样品经高速粉碎机粉碎后，准确称取 2.0 g于 50mL
具塞离心管中，加入 10mL甲醇涡旋混匀，超声辅助提取
30min。4 000 r/min离心 5min，准确移取 5mL上层清液
于 5 mL刻度氮吹管中，40 ℃下氮吹至干，加入 3 mL
0.1 mol/L NaOH涡旋复溶后过 PAX柱（固相萃取柱使用
前分别用 3mL甲醇、3mL0.1mol/LNaOH活化，保持柱体
湿润），再分别用 3mL1%氨水（体积分数）、3mL1%氨水
甲醇（体积分数）溶液淋洗，弃去淋洗液，抽干，最后用
3 mL 0.5%甲酸甲醇（体积分数）洗脱，洗脱液于 45℃下
氮吹至近干，用 50 %甲醇水（体积分数）溶液定容至
1.0 mL，过 0.22μm尼龙滤膜后上机测试。
2 结果与讨论
2.1 样品前处理条件优化
现有的米酵菌酸处理方法为液液萃取法[9-10]，采用
固相萃取法分析米酵菌酸还鲜见报道，需进一步优
化。试验采用 2.0 mg/L米酵菌酸标准溶液，分别考察了
亲水亲脂固相萃取柱（PEP，60 mg/3 mL）、混合弱阴离
子交换柱（PWAX，60 mg/3 mL）、混合强阴离子交换柱
（PAX，60 mg/3 mL）以及中性氧化铝柱（500 mg/3 mL）
的保留特性。米酵菌酸经 PEP、PWAX、中性氧化铝柱
处理后，回收率为 0 %，而经 PAX柱处理后，回收率可
达到 95 %以上。分析发现，米酵菌酸极性较强，在 PEP
柱上无法保留，并且在 PWAX柱上也无法保留，而在
中性氧化铝柱上的保留又过强，难以洗脱；米酵菌酸
在 PAX柱上具有良好的保留特性，洗脱容易，回收率
接近 100 %，适合米酵菌酸的富集、净化。试验发现，
pH对米酵菌酸的洗脱强度有很大影响，考察了洗脱液
中不同浓度甲酸对洗脱强度的影响。结果表明：当洗
脱液中不含甲酸时几乎无法洗脱米酵菌酸，当甲酸浓
度大于 0.2 %以后洗脱完全，且随着甲酸浓度的增大，
回收率几乎无变化，试验结果见图 1。
考虑到基质的影响以及溶液配制的稳定性，最终
选择了 0.5 %甲酸甲醇溶液作为洗脱剂。
2.2 色谱质谱条件优化与基质效应
试验比较了乙腈-水、乙腈-0.3 %甲酸、乙腈-
0.01 mol/L乙酸铵作为流动相对色谱峰型以及灵敏度
的影响。由于米酵菌酸有 3个羧基，具有一定极性，采
用乙腈-水体系色谱峰变形严重，难以识别；采用乙
腈-0.3 %甲酸可以获得较好的色谱峰型，但是本试验
采用的电喷雾质谱负离子模式（ESI-）进行检测，抑制
了米酵菌酸的电离，灵敏度较低；采用乙腈-0.01 mol/L
乙酸铵体系可以获得较好的峰形以及较高的灵敏度。
图 1 不同甲酸浓度对洗脱强度的影响
Fig.1 Effect of different concentration of formic acid on the
elution strength
100
80
60
40
20
0
回
收
率
/%
0 0.2 1.0
甲醇浓度/%
0.4 0.6 0.8
周鹏：超高效液相色谱串联质谱法测定银耳中米酵菌酸 检测分析
124
论上待测化合物的峰面积与进样量应为线性关系，但
是基质匹配的标样在进样量小于 2 μL时，峰面积与纯
溶剂配制的标样极为接近，即基质效应很小；随着进
样量的增大，峰面积与溶剂配制的标样差别增大，即
基质效应变强，对目标化合物的抑制越来越强；当进
样量超过 5 μL时，进样量对目标化合物的响应影响有
限。试验结果表明：进样量对基质效应的影响显著，采
用液质联用法进行分析时，不能依靠加大进样量来提
高方法的检出限。考虑到方法的灵敏度与基质效应，
选择 2 μL为本试验的进样量，试验结果见图 4。
2.4 分析方法确证
在上述优化条件下，使用基质匹配标准曲线，外
标法定量，考察了米酵菌酸在（1.6~80）μg/L范围内的
线性关系和相关系数。以空白样品基质中米酵菌酸 3倍
信噪比，确定化合物的检出限为 0.5 μg/kg，方法的灵
图 3 不同梯度洗脱程序米酵菌酸响应的影响
Fig.3 Effect of different gradient elution program on bongkrekic acid response
因此，本试验最终采用乙腈-0.01 mol/L乙酸铵体系作
为流动相。
试验采用 2.0 mg/L的标准品溶液进样，不经色谱
柱分离，直接进入三重四级杆质谱仪进行质谱参数的
优化。米酵菌酸容易失去一个质子形成 [M-H]-离子，
因此采用负离子模式进行检测。试验过程中优化了鞘
气温度及流量、雾化气压力、去溶剂气温度及流速、毛
细管电压、喷嘴电压、碰撞气能量以及碰撞池加速电压
等参数，并选择[M-H]-离子（m/z 485.1）为母离子。选定
母离子后，进行子离子扫描，获得二级质谱图，见图 2。
由图可见主要特征碎片为 m/z 441.1和 m/z 397.2，
推测分别为[M-H-CO2]-和[M-H-2CO2]-峰。
2.3 基质效应的探讨
不同于传统的荧光或紫外-可见光检测器，电喷
雾质谱虽然对分离度的要求大为降低，基质不会影响
到目标化合物的分离度，但是在其离子化过程中会产
生基质效应，从而影响检测的准确度。通常降低基质
效应的方法主要有稀释进样溶液、基质匹配标样以及
稳定同位素内标法等，它们均有各自的优缺点，提高
净化效率是最重要的途径 [14-16]，但是也很难完全消除
基质效应的干扰。
试验采用浓度为 40 μg/L的基质匹配标样进行试
验，发现通过调节梯度洗脱程序，米酵菌酸的峰面积
变化很大，说明不同梯度洗脱条件下，米酵菌酸与基
质的分离度差别很大，导致基质效应差异很大，最终
选择了响应最大的为最佳洗脱条件，试验结果见图 3。
在优化后的洗脱程序下，分别采用浓度为 40 μg/L
的纯溶剂配制标样与基质匹配标样，改变样品的进样
量，分析米酵菌酸峰面积的变化，并进行数据拟合。理
图 2 米酵菌酸的二级质谱图
Fig.2 Mass spectrum of Bongkrekic acid by daughter scan
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
2.1 2.2 4.9
保留时间/min
2.3 2.4
×104
2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8
*4.129
52 973
*3.633
52 685
*3.062
54 713*2.736
48 285*2.526
42 650
图 4 不同进样量对米酵菌酸响应的影响
Fig.4 Effect of different inject volume on on bongkrekic acid
response
1.溶剂配制标样；2.基质匹配标样。
250 000
200 000
150 000
100 000
50 000
0
峰
面
积
0 5 20
进样量/μL
10 15
y=-1.584 6x4+84.066x3-1 702.7x2+16 581x+473.89
R2=1
y=-206.27x2+13 632x+2 674.7
R2=0.999 9
1
2
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
360 370 490
质荷比/（m/z）
380 390
×104
400 410 420 430 440 450 460 470 480
365.000 0
397.200 0
441.100 0
485.100 0
周鹏：超高效液相色谱串联质谱法测定银耳中米酵菌酸检测分析
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名称 线性范围/（μg/L） 回归方程 相关系数（r） 添加量/（μg/kg） 回收率/% RSD/%
米醋菌酸 1.6~80 Y=1 073.424 49x-272.754 655 0.999 9 2.0 82~102 8.5
10 82~99 7.7
20 96~102 2.4
表 1 米酵菌酸的线性范围、线性方程、相关系数、回收率及精密度（n=6）
Table 1 Linear range，regression equations，correlation coefficient，recoveries and precision of bongkrekic acid（n=6）
敏度能够满足检测要求。
对空白银耳样品在 2.0、10、20 μg/kg 3 个加标水
平下进行米酵菌酸的加标回收试验，考察方法的回收
率和精密度，结果见表 1。
试验结果表面：在 3个添加水平下，米酵菌酸的
回收率为 82 %~102 %，符合分析准确度要求；相对偏
差为 2.4 %~8.5 %，符合精密度要求。
3 结论
本研究建立了固相萃取净化-超高效液相色谱-
串联质谱法检测银耳中米酵菌酸的方法。通过对分析
方法的优化，采用基质匹配标准曲线的方法，建立了
快速、准确、灵敏的超高效液相色谱-串联质谱法测定
银耳中米酵菌酸的方法，同时本方法可作为分析的确
证方法，为保障食品安全发挥积极作用。
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