全 文 ：dible fungi2016（3）
云芝胞内多糖（coriolus versicolor intracelluar polysaccha⁃
rides）系从云芝子实体或培养的菌丝中提取纯化的结合蛋白
多糖，是良好的生物效应调节剂，具有抑制肿瘤、调节免疫、
降低放、化疗毒副反应等多种药理作用，并有抗艾滋病毒活
性。目前云芝多糖主要提取自液体发酵的菌丝体。产量高、
生物性状优异、生产性状良好的云芝菌株是保障云芝生产和
云芝产业发展良好的先决条件。笔者应用离子束诱变技术
选育高产云芝多糖发酵菌株，大大提高诱变选育的成功率，
并在云芝液体发酵菌株选育上建立一个新的高效方法，为真
菌发酵技术的发展开辟新的道路。对新菌株最佳培养基及
液体发酵参数的优化，以发酵产物多糖为指标，筛选出适合
高产多糖新菌株的最佳发酵参数，为工业化生产云芝多糖提
供成熟的工艺。
1 材料与方法
1.1 供试材料 ① 供试菌株：云芝菌株 SYZ1、SYZ2、SYZ3、
SYZ4、SYZ5、SYZ6、SYZ7、SYZ8。其中 SYZ1、SYZ2、SYZ3、
SYZ4、SYZ5来自中国农科院，SYZ6为江苏省苏微微生物研
究有限公司提供，SYZ7引自山东金乡真菌研究所，SYZ8引自
东北食用菌研究所。②培养基：RM4再生培养基为麦芽糖
5 g，葡萄糖 10 g，酵母粉 4 g，0.6 mol／L甘露醇，琼脂 5.5 g，pH
自然，蒸馏水定容至总体积为 1000 mL。PD液体培养基为马
铃薯 200 g煮汁，葡萄糖 20 g，KH2PO4 10 g，MgSO4 5 g，用蒸馏
水定容至 1000 mL。基础发酵培养基为葡萄糖 20 g，玉米粉
20 g，豆饼粉 10 g，KH2PO4 10 g，MgSO4 5 g，VBl100 mg，用蒸馏
水定容至 l000 mL。
渗透压稳定剂：0.6 mol/L蔗糖溶液。液体发酵培养基配
方：a.玉米粉 20 g，豆饼粉 10 g，葡萄糖 10 g；b.豆饼粉 10 g，蛋
白胨 3 g，葡萄糖 40 g；c.玉米粉 20 g，豆饼粉 10 g，蛋白胨 3 g，
葡萄糖 40 g；d.玉米粉 30 g，豆饼粉 15 g，葡萄糖 15 g；e.玉米
粉 30 g，豆饼粉 15 g，蛋白胨 3 g，葡萄糖 30 g；f.玉米粉 30 g，豆
饼粉 15 g，蛋白胨 3 g，葡萄糖 40 g。以上配方均加 KH2PO4
10 g，MgSO4 5 g，VBl100 mg，水 1000 mL。
1.2 试验方法
1.2.1 高产云芝菌丝体多糖出发菌株筛选 8株云芝菌株
SYZ1、SYZ2、SYZ3、SYZ4、SYZ5、SYZ6、SYZ7、SYZ8接种于
PDA培养基培养皿中培养后，打孔法定量接种至 PD液体培
养基中，150 r／min 旋转式摇床 28℃避光培养 7 d，之后
4000 r/min离心 5 min，收集菌丝体。65℃烘干至恒重，测定菌
丝质量得云芝液体发酵生物量，同时进行云芝菌丝体多糖测
定。以云芝菌丝体多糖产量最高者作为筛选云芝多糖高产
出发菌株。
1.2.2 低能N+离子束诱变筛选
1.2.2.1 低能N+离子束诱变 （1）样品前处理：将培养 5 d出
发菌株 SYZ2的菌丝，用 2％溶壁酶在 30℃下酶解 5 h，用 8层
擦镜纸过滤酶解液，用渗透压稳定剂共 8 mL分次洗涤过
滤。取过滤液，4000 r/min离心 10 min，去上清液，用渗透压
稳定剂 8 mL离心洗涤，得纯化的原生质体。将原生质体用
渗透压稳定剂 10 mL稀释，制成原生质体悬液，用血球计数
板计数。将精制原生质体悬液稀释至 106个/mL，取 0.1 mL涂
布于培养皿中，无菌风风干，立即注入低能 N+离子。离子注
入条件参考文献[2]。
1.2.2.2 初筛 将经离子束注入后的平板用 0.6 mol/L蔗糖
渗透压稳定剂洗脱，取 0.1 mL涂布于再生培养基平板上，待
菌落长成后，挑选菌丝体之间有明显拮抗的菌株。然后转入
PDA培养基平板上与出发菌株进行拮抗试验，筛选出有明显
拮抗菌株。
1.2.2.3 诱变菌株复筛 将经过初筛后的菌株进行云芝液体
发酵试验，选择菌丝体多糖产量高于出发菌株的菌株作为诱
变的高产多糖新菌株，然后进行同工酶电泳试验最终确定是
否为高产菌丝多糖新菌株。
1.2.3 高产多糖的云芝新菌株最佳培养条件筛选 将高产
多糖新菌株 SYZ9接入液体发酵培养基中，接种量 8%，
140 r/min摇瓶培养 6 d。
以发酵产物菌丝体产量、多糖为指标，筛选出云芝新菌
株高产多糖的最佳培养基。
1.2.4 摇瓶与工厂化液体发酵最佳时间确定
1.2.4.1 摇瓶液体发酵时间确定 以最佳培养基，培养温度
28℃，摇床转速 150 r/min，接种量 8%。测定 pH、还原糖、云芝
诱变筛选云芝高产多糖菌株及其液体培养条件优化
刘广建 1 郑惠华 2 薛 璟 1 蒋 益 1 季宏更 1 汪 洁 1 全卫丰 1*
（1江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡 214063；2江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通 226009）
摘 要 对从不同地区引进多株云芝菌株，进行云芝液体发酵
试验，筛选出云芝菌丝体多糖产量高的菌株作为出发菌株，运
用低能 N+离子注入诱变选育出云芝液体发酵高产云芝多糖的
新菌株。对新菌株最佳培养基及液体发酵参数的研究与优化
使其液体发酵菌丝体多糖产量高于高产出发菌株 50%，液体发
酵量菌丝体多糖达到了 2.26 g/L。
关键词 云芝 低能N+离子 液体发酵 云芝多糖
文章编号 1000-8357（2016）03-0021-03
收稿日期：2015-09-06一稿；2015-12-08修改稿。
基金项目：江苏省南通市科技项目 2014AS生物技术和新医药（编号AS2014008）。
作者简介：刘广建，高级工程师，长期从事食药用菌的菌种选育与
栽培及产品的研究与开发工作。联系电话：13013671486。*通讯作者：全卫丰，副研究员，主要研究方向为食药用菌菌种选
育。联系电话：13961779420。
育 种 驯 化
21
2016（3）dible fungi
菌丝体干重、菌丝体多糖含量，以确定最佳发酵时间点。
1.2.4.2 工厂化（100 L）液体发酵时间确定 以最佳培养基，
发酵罐（通气加搅拌）容积 100 L，装液量 60 L，搅拌转速
150 r/min，通气量 1∶0.5~1；压差法接种，接种量为 8％，添加
0.1％ 豆油作为消泡剂，27~28℃条件培养。测定 pH、还原糖、
云芝菌丝体干重、菌丝体多糖。
2 结果与分析
2.1 高产云芝菌丝体多糖出发菌株筛选结果 从表 1可看
出，SYZ2菌丝体多糖含量为 1.83 g/100 mL，为 8株菌株中最
高，最后确定以 SYZ2作为诱变的高产出发菌株。
表1 高产菌丝体多糖出发菌株筛选结果
云芝菌株
菌丝体干重/（g·100 mL-1）
菌丝多糖/%
SYZ1
0.507
1.53
SYZ2
0.501
1.83
SYZ3
0.381
1.19
SYZ4
0.348
1.68
SYZ5
0.437
1.62
SYZ6
0.426
1.51
SYZ7
0.504
1.12
SYZ8
0.501
0.98
2.2 低能N+离子束诱变筛选结果 一共挑选出菌丝体之间
有明显拮抗的菌株有 96株。然后转入 PDA培养与出发菌株
SYZ2进行拮抗试验。以 SYZ2为中心四周接种四株初筛挑选
育 种 驯 化
表4 摇瓶液体发酵时间试验结果
发酵
时间/d
4
5
6
7
菌丝体干重/（g·L-1）
25.28
25.05
28.42
23.37
菌丝体多
糖产率/%
-
-
8.6
7.8
菌丝多糖含
量/（g·L-1）
-
-
2.41
1.82
pH
4.53
4.71
4.79
4.64
还原糖/（mg·mL-1）
27.7
20.5
15.9
16.1
表5 工厂化100 L发酵罐液体发酵结果
发酵
时间/h
0
18
22
26
42
46
50
56
60
66
菌丝体
（干）/（g·L-1）
-
-
-
-
30.72
28.65
24.28
25.97
26.58
24.67
菌丝体多糖
产率/%
-
-
-
-
*12.8
*11.5
*10.2
8.1
8.5
7.6
菌丝多糖/（g·L-1）
-
-
-
-
-
-
-
2.03
2.26
1.87
pH
4.93
4.69
4.55
4.50
4.54
4.60
4.61
4.63
4.65
4.55
还原糖/（mg·mL-1）
39.82
31.93
28.57
25.58
18.56
16.24
15.35
15.20
15.17
15.45
注：发酵未完成时由于玉米淀粉的存在，运用蒽酮硫酸法检测
时多糖数值偏高。
图1 5株菌株与出发菌株的拮抗试验
出的菌株，二次筛选后的菌株再进行彼此间的拮抗试验，最
后再与 SYZ2进行最后的拮抗筛选，共筛选出 5株，5株菌株
分别为 SYZ203、SYZ209、SYZ225、SYZ261、SYZ285（图 1）。
从表 2可以看出 SYZ209菌株发酵后菌丝体多糖含量为
2.46 g/100 mL，比出发菌株 SYZ2 高出 35.9%，从同工酶酶谱
（图 2）分析发现 SYZ209与出发菌株的谱带存在多个差异，因
此确定 SYZ209为高产菌丝体多糖新菌株。
图2 5株变异菌株与出发菌株同工酶酶普
从右往左分别为 SYZ2（出发菌株）、SYZ203、SYZ209、SYZ225、SYZ261、SYZ285
表2 5株变异菌株与对照菌株多糖含量比较
云芝菌株
菌丝体干重/（g·100mL-1）
菌丝多糖/%
SYZ2
（出发菌株）
0.516
1.81
SYZ203
0.522
1.82
SYZ209
0.547
2.46
SYZ225
0.493
1.95
SYZ261
0.506
2.03
SYZ285
0.541
2.17
2.3 高产多糖最佳发酵培养基配方的筛选结果 由表 3可
见，配方 e菌丝多糖含量最高为 8.6%，菌丝体干质量最高为
28.42 g/L。
2.4 摇瓶及工厂化液体发酵最佳时间试验结果 由表 4可
知，整个发酵过程中还原糖在降低，到发酵结束时还原糖基
本没有太大的变化。摇瓶液体发酵试验最佳时间为 6 d，云
芝菌丝体干重 28.42 g/L、菌丝体多糖含量 8.6%、每升发酵物
可产云芝菌丝体多糖 2.41 g；工厂化 100 L液体发酵罐试验：
表3 液体摇瓶发酵培养基筛选结果
配方
a
b
c
d
e
f
菌丝体干重/（g·L-1）
12.37
9.97
20.49
19.93
28.42
28.10
菌丝多糖产率/%
5.5
3.1
6.6
6.8
8.6
8.3
多糖含量/（g·L-1）
0.68
0.31
1.35
1.36
2.41
2.33
C∶N
22∶1
26∶1
24∶1
22∶1
19∶1
25∶1
注：SYZ9 菌株，接种量 8%，140 r/min旋转式摇床，28℃避光培
养 6 d
22
dible fungi2016（3）
整个发酵过程发现与实验室摇瓶液体发酵试验具有一致性，
发酵 22 h，菌丝体开始进入对数生长期，溶氧急剧下降，还原
糖质量浓度也开始显著下降，在发酵 20~60 h时菌丝体处于
对数生长期，发酵干物质开始下降，至 50 h降到最低为
24.28 g/L，然后上升，至 60 h时菌丝体干重达最高为26.58 g/L，
之后菌丝体量略微有些降低；pH由开始的高位下降到发酵
26 h时 4.50，然后由低到高上升，到 60 h最高为 4.63，然后又
下降；还原糖由高到低，50 h后还原糖基本无变化；菌丝体多
糖含量从 42 h后开始检测发现，在 42~56 h下降到 8.1%，60 h
又上升到 8.5%，然后又下降；发酵 60 h时 pH最高为 4.63，还
原糖在低位无变化，根据还原糖质量浓度不再下降，以及 pH
回升，因此确定发酵罐发酵时间 60 h最佳，发酵终产物，云芝
菌丝体干重 26.58 g/L、菌丝体多糖含量 8.5%、每升发酵物可
产云芝菌丝体多糖 2.26 g。
3 小 结
从高产云芝多糖出发菌株的筛选、离子束注入诱变、诱
变新菌株的筛选以及适合新菌株的最佳培养基配方的筛选，
到最后摸索出从实验室摇瓶到工厂化发酵罐生产的新工艺，
可作为提高云芝液体发酵多糖产量的一种新模式。
试验筛选出高产多糖诱变新菌株为 SYZ209，并确立液
体发酵最佳的配方为葡萄糖 30 g，玉米粉 30 g，豆饼粉 15 g，
蛋白胨 3 g，KH2PO4 10 g，MgSO4 5 g，VB1 100 mg，加水
1000 mL。摇瓶液体发酵时间为 6 d，多糖产率为 8.6%，含量
为 2.41 g/L；工厂化发酵罐发酵时间为 60 h，多糖产率为
8.5%，含量为 2.26 g/L。
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该技术成为菌株分类鉴定与判断杂种优势的重要手段。
菌株间同工酶的相似程度可以间接的反映出菌株间的亲
缘关系，实践证明，在一定范围内，杂交亲本的相似系数越小，
亲缘关系越远，杂交优势就越明显，因此杂交亲本间亲缘关系
的远近是育种成败的关键。研究结果亲本杏 5DM2和杏 7的相
似系数为 0.727，两者有着相似的遗传基础，杂交子代中没有
出现强优势组合；亲本杏 528和杏 5DM2相似系数为 0.286，它
们之间亲缘关系较远，杂交子代5-528为强优势组合。根据杏
鲍菇品种酯酶同工酶分析比较杂交亲本与杂交新组合同工酶
酶谱，如果杂交子代酯酶同工酶酶谱出现“互补型酶带”和“杂
种新酶带”就是强优势组合，数量较少或者没有出现就是弱优
势或无优势组合，这与王俊玲[9]等研究结果相一致。
利用单核菌丝进行杏鲍菇种间杂交育种的方法是可行
的。出菇试验表明，得到的杏鲍菇杂交菌株5-528、C-5、5X-511、
5X-7的栽培周期、生物学效率和子实体性状等指标与杂交
亲本及其他杂交子代相比较均具有明显优势，属于杂交优质
菌株，经过生产适应性驯化，极可能成为性状优良的工厂化
生产品种新资源。
出菇试验结果表明：亲缘关系较为接近的杂交亲本的杂
交子代其杂种优势不明显，亲缘关系较远的杂交亲本的杂交
子代其杂种优势较为明显，这与酯酶同工酶分析结果相一
致，说明酯酶同工酶技术在杏鲍菇杂种优势预测、降低工作
量、减少成本等方面具有很好的研究价值与指导意义。
试验将 7株亲本两两杂交，从 21个杂交组合中成功得到
14株具有结实能力的杂交子，虽然对说明酯酶同工酶标记用
于预测杂种优势具有一定的指导作用，但样本量较少，存在
一定的局限性，所以在今后的研究中还应加大样本数量，以
增强说服力。
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育 种 驯 化
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（上接P20）
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