全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 July 2011, 30(4): 663-668

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（No. 2009-13）
*Corresponding author. E-mail: sdhcy@yahoo.cm.cn
收稿日期: 2011-01-04, 接受日期: 2011-03-02

CO1 在侧耳属物种快速鉴定中的应用
宋驰 1,2 陈强 2 徐璟煜 2 张金霞 2 边银丙 1 黄晨阳 2*
1华中农业大学应用真菌研究所 武汉 430070
2中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 北京 100081



摘 要：以侧耳属 Pleurotus15 个种的 15 个菌株为材料，根据 GenBank 上侧耳属细胞色素 c 氧化酶亚基Ⅰ基因（cytochrome
c oxidase subunit 1 gene，CO1）序列信息，设计引物 CO332F、CO332R，进行第一轮 PCR 扩增，结果显示所有菌株都能得
到单一条带，根据条带大小，15 个菌株可分为 4 组。随后针对每个种设计特异性引物，进行第二轮 PCR 扩增，结果显示每
个菌株只有在自己特异的引物中出现目的条带。通过两轮扩增，根据扩增条带的大小和有无，即可对 15 个种进行快速鉴定。
关键词：内转录间隔区，两轮 PCR，种特异引物

Application of CO1 for rapid identification of Pleurotus species
SONG Chi1, 2 CHEN Qiang2 XU Jing-Yu2 ZHANG Jin-Xia2 BIAN Yin-Bing1
HUANG Chen-Yang2*
1The Institute of Applied Mycology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
2Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: 15 strains belonging to 15 species of Pleurotus were used. Primer CO332F and CO332R were designed by the cytochrome
c oxidase subunit 1 gene (CO1) sequence of Pleurotus downloaded from GenBank. Results of the first-step PCR amplification
showed that all the strains can get one band. The 15 strains were divided into four groups by the band size. Species-specific primers
were designed accordingly. Results of the second-step PCR amplification showed that each species can get one band by the
species-specific primers. In conclusion, the 15 species of Pleurotus can be identified by two-step PCR in accordance with the band
size and the presence or absence of the band.
Key words: ITS, two-step PCR, species-specific primer

DOI:10.13346/j.mycosystema.2011.04.013
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侧耳 Pleurotus 是全球广泛分布的大型真菌
（Vilgalys & Sun 1994）。其对纤维素及木质素的降
解能力强，是生物降解的很好材料（Carlile et al.
1994）。大多侧耳属真菌可以食用，已在世界各地商
业化栽培，具有很高的经济价值（Cohen et al. 2002）。
《真菌辞典》（第十版）（Dictionary of the fungi）
记载侧耳属有 20 个种（Kirk et al. 2008）。但是，
MycoBank 已记录的分类单元名称却超过 700 个
（http://www.mycobank.org/）。主要因为传统的分类
方法大多基于菌丝体、孢子和子实体的形态学特征
并结合生理生化性状的描述。形态特征容易受到培
养条件、地域及环境因素的影响，使得传统的分类
不能完全满足物种鉴定的要求（王呈玉等 2006）。
随着分子生物学的发展，ITS 成为侧耳属分子
分类鉴定的主要方法（Bunyard et al. 1996；Vilgalys
et al. 1996；Thorn et al. 2000；郑和斌等 2006；黄
晨阳等 2010）。但 ITS 序列种内差异较大，Nilsson
et al.（2008）发现真菌界 ITS 种内平均变异为
2.51%，其中担子菌门平均变异为 3.33%（SD=5.62）。
所以，无法做出界定种的限值。Nilsson et al.（2008）
认为 1%－3%比较合适。黄晨阳等（2010）研究发
现，糙皮侧耳 P. ostreatus (Jacq.) P. Kumm 和白黄侧
耳 P. cornucopiae (Paulet) Rolland 的 ITS 差异仅为
0.3%。另外，ITS 扩增产物的直接测序相对比较耗
时，并且经常会出现套峰等现象（Huang et al.
2010），需要进一步克隆测序，而采用克隆测序时，
需要测序多个克隆子，才能保证克隆测序的准确性
（Kobayashi et al. 1999），这样不仅增加了物种鉴定
的时间而且增加了物种鉴定的成本。同时，ITS 序
列进行 Blast 比对时，由于数据库序列信息的不准
确性（Nilsson et al. 2006；Brock et al. 2009），使得
比对时可能会有错误的结果。
细胞色素 c 氧化酶亚基Ⅰ基因（cytochrome c
oxidase subunit 1 gene，CO1）位于线粒体基因组中，
其序列 5′端变异明显，在动物和红藻类植物中，CO1
作为 DNA 条形码广泛用于物种的分类鉴定（Hebert
et al. 2003a，b；Saunders 2005；Hebert et al. 2010）。
CO1 作为 DNA 条形码在真菌中也有研究，在青霉
亚属 Penicillium subgen. Penicillium 的 370 个菌株
中，种内的差异为 0.06%，种间的差异为 5.60%，
能有效的用于青霉亚属种间的分类鉴定（Seifert et
al. 2007）；在锤舌菌属 Leohumicola 的研究中表明，
CO1 序列种间差异为 2.42%，种内差异为 0.24%，
可用于锤舌菌属各种的分类鉴定（Nguyen & Seifert
2008）。但 Rossman（2007）研究表明，CO1 序列
在真菌中进化速率慢，不利于物种的鉴定。Vialle et
al.（2009）研究表明，在部分真菌中 CO1 序列有内
含子插入，影响通用引物的设计。
本实验室对侧耳属 15 个种 27 个菌株的 CO1
研究表明，种内 CO1 序列一致（未发表），其中，
部分种的 CO1 序列有内含子存在。由于内含子的数
量和位置不同，使得侧耳属种间序列差异大，能很
好的用于侧耳属种间的鉴定。与此同时，由于内含
子的存在，PCR 扩增产物过大，给直接测序带来困难。
本文以侧耳属 15 个种的 15 个菌株为实验材
料，根据 CO1 序列信息，设计特异引物进行 PCR
扩增，达到物种快速鉴定的目的。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试菌株经过分类学家确认，编号及在
GenBank 的登录号见表 1，菌种保藏于国家标准菌
株库（China Center for Mushroom Spawn Standards
and Control，CCMSSC）。
1.2 菌丝培养及总 DNA 提取
实验菌株接种至 PDA 试管中活化，活化的菌
株接种于铺有玻璃纸的 PDA 平皿上，25℃避光培
养 9d，收集菌丝用于 DNA 的提取。菌丝总 DNA
的提取使用试剂盒：Plant Genomic DNA Kit（天根
生化），按试剂盒操作步骤进行。
1.3 序列分析及引物设计
使用软件 DNAMAN 5.2.2（Lynnon Biosoft，
Canada）和 DNAssist 2.2（Patterton & Graves 2000）
分析侧耳属各菌株的 CO1 序列，根据编码区序列设
计了引物 CO332F：5′-TTACAAGGAGATCATCAA
TT-3′；CO332R：5′-TGCTAAGTGTAGACTGAAGA-
3′，根据扩增条带大小，将侧耳属菌株分为 4 组。
为了进一步将 4 组菌株区分开来，又针对每组菌株
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设计了特异的引物。具体引物序列见表 2。
1.4 PCR 扩增和电泳检测
PCR 扩增反应在 BIO-RAD iCycler Thermal
Cycler 上进行。PCR 反应体系：反应体积 20μL，
其中 r Taq（5U/μL）0.1μL，dNTPs（各 2.5mmol）1μL，
10×r Taq buffer（ Mg2+ plus ） 2μL，前端引物
（10μmol），后端引物（10μmol）各 1μL，模板 DNA
2μL，ddH2O 12.9μL。
PCR 扩增程序：94℃预变性 5min；然后 94℃
变性 40s，55℃退火 40s，72℃延伸 120s，32 个循
环；最后 72℃补平 7min，4℃保存。扩增产物经 1.0%
的琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 第一轮扩增
使用引物 CO332F，CO332R 对供试菌株进行
扩增，15 个菌株都能扩增得到单一条带，大小从
320bp 至 4,500bp 不等（图 1-A，B，C，D）。根据
条带的大小，供试菌株被分为 4 组，第一组：P.
calyptratus、P. cystidiosus、P. djamor、P. dryinus 和
P. eryngii var. ferulae，片段大小约 320bp；第二组：
P. ostreatus、P. citrinopileatus、P. cornucopiae 和 P.
eryngii var. tuoliensis，片段大小约 1,700bp；第三组：
P. eryngii、P. pulmonarius 和 P. abieticola，片段大小
约 3,400bp；第四组：P. australis、P. smithii 和 P.
rattenburyi，片段大小约 4,500bp。
2.2 特异性引物扩增
根据第一轮扩增的分组结果，对各组菌株使用
特异引物进行扩增（图 1-E，F，G，H）。PCR 产物
的大小见表 2。各菌株仅在特异引物中才能扩增出
目的条带。根据条带的大小和有无，即可将供试菌
株全部区分开。
表 1 供试菌株信息及 CO1 序列的登录号
Table 1 Information of tested strains and CO1 GenBank accession numbers

CCMSSC 编号
CCMSSC No.
菌株编号
Strain No.
种
Species
序列登录号
GenBank No.
1 CCMSSC00752 CBS102498 Pleurotus abieticola R.H. Petersen & K.W. Hughes GU552317.1
2 CCMSSC00690 CBS100128 P. australis Sacc. HQ840667
3 CCMSSC00754 CBS325.85 大幕侧耳 P. calyptratus (Lindblad) Sacc. GQ449284.1
4 CCMSSC00348 ACCC51261 金顶侧耳 P. citrinopileatus Singer GU552318.1
5 CCMSSC00457 ACCC50234 白黄侧耳 P. cornucopiae (Paulet) Rolland GQ926485.1
6 CCMSSC00755 CBS615.80 泡囊侧耳 P. cystidiosus O.K. Mill. GQ449281.1
7 CCMSSC00766 CBS667.97 淡红侧耳 P. djamor (Rumph.: Fr.) Boedijn GQ449290.1
8 CCMSSC00759 CBS278.90 栎生侧耳 P. dryinus (Pers.) P. Kumm. GQ449287.1
9 CCMSSC00764 CBS100.82 刺芹侧耳 P. eryngii (DC.) Quél. GQ926496.1
10 CCMSSC00765 CBS282.32 阿魏侧耳 P. eryngii var. ferulae (Lanzi) Sacc. GU552315.1
11 CCMSSC00486 ACCC51060 白灵侧耳 P. eryngii var. tuoliensis C.J. Mou GQ926489.1
12 CCMSSC00695 CBS100130 肺形侧耳 P. pulmonarius (Fr.) Quél. GU108491.1
13 CCMSSC00696 CBS175.94 P. rattenburyi Segedin HQ840669
14 CCMSSC00772 CBS703.94 P. smithii Guzmán HQ840668
15 CCMSSC00769 CBS291.47 糙皮侧耳 P. ostreatus (Jacq.) P. Kumm. GQ926495.1
注：ACCC 为中国农业微生物菌种保藏管理中心；CBS 为荷兰微生物菌种保藏中心.
Note: ACCC: Agricultural Culture Collection of China; CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, The Netherlands.
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图 1 侧耳属快速物种鉴定示意图
Fig. 1 Chart of rapid identification of the genus Pleurotus. Lane 1－5: P. calyptratus, P. cystidiosus, P. djamor, P. dryinus, P. eryngii var. ferulae; Lane
6－9: P. ostreatus, P. citrinopileatus, P. cornucopiae, P. eryngii var. tuoliensis; Lane 10－12: P. eryngii, P. pulmonarius, P. abieticola; Lane 13－15: P.
australis, P. smithii, P. rattenburyi. Marker: DL2000 Marker; M: 2-log DNA ladder.
表 2 侧耳属种特异引物和目的条带大小
Table 2 Species-specific primers for Pleurotus and PCR aim band size


种属
Species
特异引物名称及序列（5′-3′）
Name and sequence of primer
目的条带大小
Band size (bp)
COCAF: TTATTTAATGTAATAATC
Pleurotus calyptratus
COCAR: GCTAATGGAGGATAAACC
220
COCYF: CATCAATTATTTAATGTT
P. cystidiosus
COCYR: GAGTGAGATTGAATACTT
250
CODJF: TTTATTATGATTTTCTTC
P. djamor
CODJR: GCTAATGGAGGATAAACA
200
CODRF: TTATGGTTATGCCTGGGC
P. dryinus
CODRR: AAATCAACAGATCCACCT
150
COAWF: AGATTAAATAATATCTCC
第一组菌株
Group I
P. eryngii var. ferulae
COAWR: AAGTGTAGACTGAAGATT
150
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT 第二组菌株
Group II
P. ostreatus
COOSR: CCGAAGGACCAAGGATAAG
1500




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续表 2
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT
P. citrinopileatus
COCIR: AAGCTTGAAAATTTGGAG
500
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT
P. cornucopiae
COCOR: TGTAGGTTCAGTAGGCAC
150
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT

P. eryngii var. tuoliensis
CONER: TACCTTAGGTTAGGGATT
1400
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT
P. eryngii
COERR: AATTGGGGCAGAACCTTT
1500
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT
P. pulmonarius
COPUR: TGCACCTACTTTATCTAAA
2600
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT
第三组菌株
Group III
P. abieticola
COABR: TATTTTAAATTAATTATGA
1400
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT
P. australis
COAUR: CGTAGGAAAGGGGCCGTAG
500
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT
P. smithii
COSMR: AAAGGGTCTGAAGGAGCC
180
CO332F: TTACAAGGAGATCATCAATT
第四组菌株
Group IV
P. rattenburyi
CORAR: ATTCACCGTCCTTCACTT
350


3 讨论
研究表明，使用本文的方法对未知侧耳属进行
物种鉴定时，首先使用引物 CO332F、CO332R 进
行第一轮 PCR 扩增，根据扩增出条带的大小分组，
选择每组的特异引物进行第二轮 PCR 扩增，根据特
异引物扩增出目的条带大小和有无就能快速的鉴
定物种。与 ITS 测序法物种鉴定相比，使用本方法，
重复性高，避免了测序，也没有重叠峰的困扰，节
约了时间和成本，更经济、更便捷。基于 ITS 的无
需测序的物种鉴定方法有 ITS-RFLP 法（Yang et al.
2007），但是，由于 ITS 种内差异较大，导致同一
种内的酶切结果不一致；同时，部分种，尤其是近
缘种，ITS 种间差异较小，难以找到合适的限制性
内切酶，所以 ITS-RFLP 的应用受到约束。同时，
使用本方法，无需使用限制性内切酶，更经济。另
外，对于 P. eryngii、P. eryngii var. ferulae 和 P. eryngii
var. tuoliensis 3 个近缘种（变种），仅依据 ITS 的大
小无法直接区别开来。而利用本方法，仅需第一轮
PCR 的扩增产物的大小，即可将 3 个种区别开来，
结果更快速和便捷。
《真菌辞典》（第十版）记载侧耳属有 20 个种
（Kirk et al. 2008）。鉴于收集材料的局限性，本文
以 15 个种为材料。对于侧耳属其他种的快速鉴定，
需要进一步研究。
为了使物种鉴定更加快捷，可以进一步挖掘侧
耳属菌株 CO1 序列的信息，设计种的特异引物，通
过一次 PCR 扩增就能准确的对菌种进行鉴定。在此
基础上设计特异的探针制作 DNA 芯片，对菌种进
行物种鉴定。
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