全 文 ：·实验与技术·
松茸菌丝生长最佳葡萄糖用量的研究
李维国 ,常立民 ,赵永光
(吉林师范大学分析测试中心 ,吉林四平　136000)
摘　要　对不同量葡萄糖下松茸的生长状况进行了研究 ,结果表明 , 25 g/ L时生长速度和生长势为最佳;30
g/ L时开始出现生长速度下降 、生长势减弱的抑制效应。
关键词　松茸;菌丝;葡萄糖;生长
中图分类号　S646.1+5　　　文献标识码　B　　　文章编号　1005-7021(2003)03-0059-03
　　本研究是吉林省科委重点科研项目“长白山
野生动植物开发 —松茸半人工栽培”中的课题 ,本
课题的研究是在实验室将葡萄糖用量设计不同梯
度(处理)对松茸菌丝进行培养的基础上 ,根据试
验结果进行统计分析 ,确定葡萄糖对松茸菌丝生
长的作用以及最佳用量范围 ,从而对研究松茸的
最佳生态条件及营养生理提供理论依据 。同时通
过研究不同葡萄糖用量下松茸菌丝的生长规律 ,
对大批量扩繁高质量的适于野外接种的优良菌种
时选择最佳生态条件 、实现大面积松茸半人工栽
培具有重大实践意义 。因此 ,该课题的研究既具
有学术意义 ,更具实用价值。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验地点　东北师范大学城市环境科学
院生态实验室。
1.1.2　试验菌种　选用东北师范大学松茸科研
组在天佛指山筛选的松茸 2 号菌种 。
1.1.3　培养基　以改良 MMN 培养基为基础 ,根
据试验各处理的具体要求适当调整葡萄糖用量 。
配方为(g/L):去皮土豆(煮出液)100 ,葡萄糖 10 ,
磷酸二氢钾 0.5 ,磷酸二氢铵 0.25 ,硫酸镁 0.2 ,
氯化钙 0.1 ,氯化钠 0.05 ,麦芽糖 0.05 ,琼脂 20 ,
1 %FeCl3溶液 1.2 mL。
1.1.4　试验设备　高压灭菌锅 、恒温培养箱 、净
化工作台 、烧杯 、三角瓶 、培养皿 、试管 、注射器 、酒
精灯 、pH 试纸 、移液管 、天平 、接种工具等。
1.2　方法
1.2.1　试验设计　本研究于 2000 年 1 月 5 日
开始实施 ,首先进行 200管松茸一级菌种的扩繁 ,
然后根据现有试验条件进行了 2 次梯度不同的葡
萄糖试验(分别称为试验一和试验二)。
菌丝培养期间逐日(或每隔 3 d)定时观察 、记
录菌落生长状况 ,测量菌落直径(从 3 个方向测
量)。每个实验结束后进行菌落的彩色摄影 、在显
微镜下测量不同处理的菌丝直径并进行菌丝的显
微照像。试验数据由计算机处理 ,并进行统计分
析 ,作出柱形图(平面图 、立体图)及趋势面图 ,计
算出日均生长速度(cm/d),日均生长速度=(菌
落直径-菌种块直径)/培养时间。进行显著性检
验 、建立回归方程 。
　表 1　试验的设计
项目 处理(梯度) 单位重复
次数葡萄糖试验一 6 8 10(CK)12 14 g/ L 7
葡萄糖试验二 0(CK) 6 10 15 20 25 30 g/ L 5
1.2.2　200 管一级菌种的扩繁　①目的:为试验
提供试验菌种;为菌剂生产提供菌种。 ②操作步
骤:1)称量:培养基采用改良 MMN 配方。用天平
称取去皮土豆(切成 1 cm 大小的方块)300 g ,加
3 000 mL水 ,煮沸 30 min过滤 ,滤液放入干净的
3 000 mL烧杯中 ,然后称取葡萄糖 30 g ,磷酸二
氢钾 1.5 g ,磷酸二氢铵 0.75 g ,硫酸镁 0.6 g ,氯
化钠 0.15 g ,氯化钙 0.3 g ,麦芽糖 0.15 g , 1 %
FeCl3溶液 3.6 mL ,琼脂 60 g 放入烧杯中;2)熔
化:加热并不断搅拌直至琼脂完全熔化 ,补足加热
蒸发所失水分 ,用水定容至 3 000 mL ;3)调 pH
值:用 pH 试纸检验培养基的酸碱度 , 同时用
10 %的盐酸和 10 %的氢氧化钠将培养基 pH 调
至 6.5;4)分装:趁培养基未凝 ,用注射器抽取培
养基装入试管 ,避免沾污管口。每试管(中号)装
15 mL ,共装 200 管 ,管口塞棉塞 ,以过滤空气避
免杂菌进入;5)灭菌:将装好的试管每 7 只为一
捆 ,用牛皮纸 、绳在塞口处扎紧 ,放入高压灭菌锅
内 ,排尽空气后在 4.903×104 Pa 、112 ℃下灭菌
30 min;6)摆斜面:灭菌后趁培养基未凝将试管倾
斜一定角度(管口处垫上物品)制成斜面。在保持
培养基与棉塞一定距离(2 cm 以上)的情况下 ,斜
收稿日期:2001-09-27
作者简介:李维国　男 ,硕士 ,高级讲师。现从事环境保护及微生物的教学与科研工作。
59微生物学杂志 2003年 5月第 23卷 第 3期　JOURNAL OF MICROBIOLOGY May 2003 Vol.23 No.3
面应尽可能大些;7)接种:在无菌净化工作台上
(SW-CJ-1FD净化工作台)用酒精灯严格按无菌
操作规程迅速将菌块(大小约 0.3 cm×0.3 cm)
放置于斜面中央;8)培养:接种后的试管倾斜放入
恒温培养箱 ,斜面向下 ,控制恒温 22 ℃。培养期
间每天定时观察(用放大镜)并记录菌丝生长状
况。经 13 d菌丝长满斜面 ,菌落洁白 ,菌苔较厚 ,
长势较好 。由于净化工作台和恒温培养箱都预先
用甲醛加高锰酸钾熏蒸消毒过 ,因此污染少 ,污染
率不超过 1 %。
1.2.3　试验的操作步骤　①配制培养基:按配制
2 000 mL改良 MMN 培养基的配方量分别称取
各组分放入 3 000 mL 烧杯中 ,但葡萄糖暂不加
入。土豆汁的制备方法与前述的菌种扩繁时相
同。用水定容至 2 000 mL ,在电炉上加热至琼脂
完全熔化 ,补足因蒸发所失水分。用 10 %NaOH
和 10 %HCl调 pH 至 6.5。取干净的 250 mL 三
角瓶 5个 ,称取葡萄糖 1.2 , 1.6 , 2.0 , 2.4 , 2.8 g
依次放入 5 个三角瓶中 ,并依次贴上标签 ,标记
葡 6 、葡 8 、葡 10 、葡 12 、葡 14 ,然后每个三角瓶均
放入 200 mL 熔化的培养基 ,振荡使葡萄糖完全
熔解。瓶口塞上棉塞 ,用牛皮纸包好放入高压灭
菌锅。所剩培养基妥善保管 、备用;②灭菌:培养
基在 4.903×104 Pa 、112 ℃灭菌 30 min ,同时在
另一个灭菌锅中将 35 个干净的培养皿及注射器
112 ℃灭菌 30 min。起动净化工作台(台内已用
酒精棉全部擦拭),中量鼓风 ,开启紫外灯至少灭
菌 30 min ,关闭紫外灯后再开启日光灯;③倒平
皿:将灭菌后的培养皿从高压灭菌锅中取出立即
放入净化工作台 ,然后再从另一灭菌锅中依次取
出盛培养基的三角瓶 ,充分振荡后 ,用灭菌的注射
器从三角瓶中每次抽取 20 mL 放入培养皿(Υ10
cm),每瓶放 7 皿(7 次重复),剩余培养基弃之。
每皿按三角瓶的标签(处理号)贴上记录处理号和
重复号的标签;④接种:待皿中培养基完全凝固 ,
在净化工作台上用酒精灯严格按无菌操作规程进
行接种。接种时应尽可能选用生长状态相同的菌
种。为保证接种量的一致性 ,采用特制的接种工
具切割成同样大小的菌块(2 mm ×2 mm),然后
逐一接入培养皿的中央。另外 ,为减小处理间的
误差 ,接种时以包含 5 个处理的 5 个培养皿为一
组顺序进行分组接种 ,并要绝对防止接种的菌块
在培养基表面滚动;⑤培养:接种的培养皿仍按组
倒置于培养箱内培养 ,控制恒温 22 ℃;⑥观察 、
测量:从培养的第 2 d开始逐日(试验二每隔 3 d)
测量菌落直径(从 3 个方向),并用放大镜观察长
势 ,作好详细记录。因为菌丝的粗细直接反映菌
丝的长势 ,因此还要在显微镜下测量各处理菌丝
的直径 。实验结束后对菌落进行彩色摄影 ,对菌
丝进显微照像。根据前次葡萄糖试验的结果发
现 ,从 6 ～ 14 g/L五个处理中菌丝生长速率呈现
递增的趋势 ,因此可以认为 ,在大于 14 g/L 的处
理中可能找到葡萄糖的最佳用量。于是重新调整
了设计梯度(处理)后又实施了试验二。具体操作
步骤大体与试验一相同。
2　结果与讨论
　　见表 2 , 3 ,4 ,5(彩色统计图及彩色照片略)。
　　　　表 2　　试验一各处理每日生长量(菌落直径/cm ,7 次重复平均)
处理/(g/ L)日期
14 12 10(CK) 8 6
1月 24日 接种 接种 接种 接种 接种
1月 25日 未长 未长 未长 未长 未长
1月 26日 0.625 0.616 0.563 0.529 0.528
1月 27日 0.986 0.998 0.967 0.964 0.937
1月 28日 1.713 1.704 1.533 1.502 1.492
1月 29日 2.238 2.161 2.103 2.019 1.985
1月 30日 2.888 2.723 2.644 2.469 2.392
1月 31日 3.338 3.241 3.178 3.123 3.054
2月 1日 3.948 3.734 3.694 3.650 3.554
2月 2日 4.578 4.401 4.353 4.235 4.104
2月 3日 5.168 5.080 4.903 4.766 4.563
2月 4日 5.668 5.551 5.378 5.266 5.154
2月 5日 6.408 6.287 6.086 5.875 5.771
2月 6日 6.888 6.763 6.553 6.275 6.104
2月 7日 7.568 7.404 7.319 6.925 6.854
2月 8日 8.018 7.837 7.578 7.333 7.288平均生长量/(cm/ d) 0.520 0.507 0.490 0.474 0.471差异显著性 极显著 极显著 CK 极显著 极显著(与对照比较)回归方程(X:葡萄糖 Y=0.426 90+0.006 55X(6≤X≤14)浓度 , Y:日均生长量)
60 　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
　　　　表 3　　试验一生长势(5 次重复平均)
处理/(g/ L) 14 12 10 8 6
菌丝直径/(μm) 3.982 6 3.511 0 3.120 5 2.460 5 1.569 0
　　　　表 4　　试验二各处理生长量(菌落直径/cm ,5 次重复平均)
处理/(g/ L)
日期
0(CK) 6 10 15 20 25 30
2月 17日 接种 接种 接种 接种 接种 接种 接种
2月 22日 2.410 2.620 2.630 2.710 2.850 2.920 2.800
2月 25日 4.30 4.750 4.860 5.000 5.200 5.350 5.170
2月 28日 6.170 6.690 6.840 7.090 7.380 7.580 7.400
3月 2日 7.720 8.840 8.560 8.730 9.010 9.190 8.930
平均生长量/(cm/ d) 0.535 0.590 0.595 0.608 0.628 0.640 0.622
差异显著性(与对照比较) CK 极显著 极显著 极显著 极显著 极显著 极显著
回归方程(X:葡萄糖浓度 , Y=0.559 04+0.002 88X(0≤X≤25)
Y:日均生长量)
　　　　表 5　　试验二生长势(5 次重复平均)
处理/(g/ L) 0 6 10 15 20 25 30
菌丝直径/μm 3.212 5 3.472 0 3.954 3 4.204 5 4.305 0 4.397 8 4.228 3
　　结果表明 ,培养基中葡萄糖量增加 ,生长速度
加快 ,当增加到 25 g/ L时 ,生长速度达到极限 ,当
增加到 30 g/L 时 ,生长速度便开始下降 。与对照
0 g/L 相比 ,各处理均表现极显著差异 ,不加葡萄
糖或只加少量(6 g/L)葡萄糖不仅生长速度慢而
且长势明显减弱 ,菌苔薄 ,甚至呈现半透明状态。
从显微镜下观察测量的菌丝直径(随机选 5 条菌
丝测量)看 ,随着葡萄糖量的增加 ,菌丝直径逐步
变粗。当葡萄糖浓度增加到 25 g/L 时菌丝直径
达到最大值。当葡萄糖量增加到 30 g/L 时 ,由于
超过了松茸菌丝对糖的要求(超量供给),使环境
中渗透压高出了菌丝生长所能适应的限度 ,从而
表现高渗环境对生活细胞的抑制效应 ,菌丝也开
始变细 。如果葡萄糖量继续增加 ,最终将导致细
胞质壁分离 ,丧失生命活力。
根据此项实验结果 ,可以确认松茸菌丝对葡
萄糖要求的最佳值为 25 g/ L。这与通常配制培
养基时加入 10 g/ L 的葡萄糖量相比差异较大。
但为提高菌丝的生长速度 ,促进生长势 ,提高菌剂
的成功率 ,将葡萄糖量调整到 25 g/L 是必要的 。
3　结　论
3.1　纯培养条件(22 ℃)下的葡萄糖作为碳源 、
能源时 ,在 0 ～ 25 g/L 的浓度范围内 ,随浓度的增
加 ,菌丝生长速度和生长势相应提高 。葡萄糖浓
度影响菌丝日平均生长量的回归方程为:y =
0.559 04+0.002 88x(0≤X≤25 ,单位:cm)。25
g/L 为菌丝生长的最佳用量 , 30 g/ L 时 ,开始表
现生长速度下降 、生长势减弱的抑制效应。
3.2　根据菌丝在不同葡萄糖剂量下的生长规律 ,
建议提出适用于菌剂生产的 MMN 培养基配方
(g/ L):磷酸二氢钾 0.5 ,磷酸二氢铵 0.5 ,硫酸锰
0.2 ,葡萄糖 25 ,麦芽糖 0.05 ,维生素 B1 0.000 1 ,
硫酸镁 0.2 ,氯化钙 0.05 ,氯化钠 0.03 ,琼脂 20
～ 30 ,1 %FeCl3 溶液 1.2 mL。
致谢:本研究得到了东北师范大学盛连喜教授 、刘晶
玲副教授 、王振堂教授 、吕耀坤高级工程师 、张喜臣老师
以及吉林农业大学商学院韩星焕院长 、吉林大学罗灿博
士的热情关心和大力帮助 ,特此表示衷心感谢!
参　考　文　献
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613期　　　　　　　　　　　　　　　　李维国等:松茸菌丝生长最佳葡萄糖用量的研究