全 文 ：2016（4）dible fungi
云芝菌丝体多糖是从云芝液体发酵培养菌丝体中分离
得到的由醛糖和酮糖通过糖苷键缩合而成的多聚物，其与蛋
白或多肽的结合物被称为糖蛋白或糖肽，云芝多糖作为一种
天然生物大分子，功效广泛，且安全无毒，越来越成为生物学
和医学关注的热点。药理实验表明，其具有抗肿瘤、抗溃疡、
保肝等多种生物活性。由于液体发酵菌丝体中含有许多未
完全利用的玉米粉、豆饼粉，提取得到的菌丝体粗多糖中淀
粉含量较高，影响了多糖的纯度。利用耐高温 α-淀粉酶和
糖化酶的高效专一性，α-淀粉酶将淀粉酶解转化为大量的糊
精和低聚糖，糖化酶使其进一步水解为葡萄糖和少量的麦芽
糖等小分子糖，而相应的酶对云芝多糖不发生作用，从而实
现淀粉与多糖的初步分离。试验以酶解液的葡萄糖值（DE
值）为评价指标，对耐高温 α-淀粉酶和糖化酶酶解除淀粉的
工艺进行研究。现将试验结果总结如下。
1 材料与方法
1.1 供试材料 云芝菌丝体粗多糖，由江苏省苏微微生物
研究有限公司项目研究实验提供；耐高温 α-淀粉酶（酶
活>10万 μ/g、每克淀粉用 6~8个单位，最适温度 100℃±5℃，
最适 pH6.0~7.0），阿 拉丁试剂上海有限公司；糖化酶（酶
活>2500 μ/g 、1 g酶粉在 40℃、pH4.6的条件下，1 h水解可溶
性淀粉产生 1 mg葡萄糖的酶量为 1个酶活力单位（U），最适
温度：58~60℃。最适 pH4.5），上海源聚生物科技有限公司；
苯酚、3，5-二硝基水杨酸、丙三醇、无水乙醇、氢氧化钠、三氯
乙酸等试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 云芝粗多糖成分测定 蛋白质的测定：GB/T 5009.5—
2010；淀粉的测定：GB/T 5009.9—2008（酶水解法）。云芝菌
丝体粗多糖采用蒽酮-硫酸法测定。
1.2.2 云芝粗多糖酶解除淀粉工艺研究
1.2.2.1 云芝粗多糖酶去除淀粉方法 云芝粗多糖水溶液调
节 pH6.5，加入耐高温 α-淀粉酶酶解一段时间，再调节
pH4.5，加入糖化酶酶解。然后在 4℃冰箱冷却降酶活，
4000 r/min离心 10 min，过滤收集上清液。
1.2.2.2 还原糖和DE值的测定 采用 3，5-二硝基水杨酸比
色法（DNS法）测定还原糖的含量。酶解液按同样方法进行测
定，将测得的各吸光值代入标准曲线方程，计算酶解液中还原
糖含量，再根据公式计算酶解液的葡萄糖值（DE值）。DE值
（%）=酶解后样液中还原糖含量/酶解前样液中淀粉含量×100。
1.2.2.3 样品的预处理 云芝菌丝体粗多糖配制成样品试剂
前用 85%的乙醇洗去样品中的还原糖滤干乙醇。
1.2.2.4 预备实验 对耐高温 α-淀粉酶酶解效果及糖化酶
酶解效果的影响因素的确定：根据样品淀粉含量以耐高温
α-淀粉酶及糖化酶理论用量及最佳条件酶解预实验确定酶
用量及时间参数，以淀粉酶适宜温度、适宜 pH确定温度、pH
实验参数。
1.2.2.5 耐高温 α-淀粉酶酶解优化实验 根据预实验选取
确定以淀粉酶用量 0.5~1 mg/g（以底物计）、pH5.0~7.0、温度
80~100℃ 、时间 10~60 min，以DE值为指标，探索这 4个因素
对耐高温 α-淀粉酶酶解效果的影响。在单因素实验的基础
上进行 L9（34）正交优化实验，因素水平见表 1。
酶解法去除云芝菌丝体粗多糖中淀粉的研究
刘广建 1，2 郑惠华 3 薛 璟 1，2 蒋 益 1，2 季宏更 1，2 汪 洁 1，2全卫丰 1，2
（1江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡 214063；2江苏省<苏微>菌物工程技术研究中心，江苏无锡 214063；
3江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通 226009）
摘 要 以水提醇沉的方法得到的云芝液体发酵菌丝体粗多
糖为原料，通过酶解法去除淀粉的研究，为今后云芝菌丝体粗
多糖的进一步分离纯化提供了条件。试验选取酶用量、温度、
pH、酶解时间为参数。采用正交试验优化酶解法去除云芝菌丝
体粗多糖中淀粉的最佳工艺参数研究，结果表明：耐高温 α-淀
粉酶在加酶量 1 mg/g、pH6.5、温度 100℃、酶解时间 40 min；糖化
酶在加酶量 40 mg/g、pH4.5、温度 60℃、酶解时间 2 h的条件下，
能明显酶解去除云芝菌丝体粗多糖中的淀粉。
关键词 云芝 菌丝体粗多糖 酶解淀粉 正交实验
文章编号 1000-8357（2016）04-0052-03
收稿日期：2015-12-30一稿：2106-03-23修改稿。
作者简介：刘广建，大学本科，副研究员，主要从事食用菌科研开发
工作。联系电话：13013671486。
菇；重度感染者，进行深埋、焚烧等无害化处理，大量污染时
要重新灭菌，然后重新接种。
参考文献
[ 1 ] 张维瑞，张绍升，罗佳 .食用菌病虫害诊断与防治原色图谱[M].
北京：金盾出版社，2009.
[ 2 ] 郑其春，陈容庄，陈志平，等 .食用菌主要病虫害及其防治[M].北
京：中国农业出版社，1995.
[ 3 ] 钱玉夫 .实用香菇栽培学[M].北京：学苑出版社，1993.
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贮 藏 加 工
表1 耐高温α-淀粉酶酶解正交实验因素水平
水
平
1
2
3
A（温度）/℃
80
90
100
因素
B（淀粉酶用量）/（mg·g-1）
0.5
0.8
1
C（pH）
6.0
6.5
7.0
D（时间）/min
20
30
40
52
dible fungi2016（4）
1.2.2.6 糖化酶酶解优化实验 根据预实验选取确定以糖化
酶用量 20~40 mg/g（以底物计）、pH4.0~5.0、温度 55~65℃ 、时
间 1~2 h，以 DE值为指标，研究这 4个因素对耐高温 α-淀粉
酶酶解效果的影响。在单因素实验的基础上进行 L9（34）正交
优化实验，因素水平见表 2。
表2 糖化酶酶解正交实验因素水平
水平
1
2
3
A（温度）/℃
55
60
65
因素
B（糖化酶用量）/（mg·g-1）
20
30
40
C（pH）
4.0
4.5
5.0
D（时间）/h
1
1.5
2
2 结果与分析
2.1 云芝菌丝体粗多糖的成分分析 样品云芝菌丝体粗多
糖的成分测定结果：云芝多糖 46.7%、蛋白质 35.15%、淀粉
18.26%。样品云芝菌丝体粗多糖中淀粉含量 18.26%，主要
原因为云芝液体发酵结束后菌丝体中残留有未完全利用的
玉米淀粉和豆饼粉。蛋白质含量 35.15%，主要原因为云芝菌
丝体中蛋白质含量高及云芝菌丝体胞内多糖为含蛋白质的
糖肽。
2.2 云芝粗多糖酶解除淀粉工艺研究分析 为了去除云芝
菌丝体粗多糖中的淀粉，研究采用耐高温 α-淀粉酶和糖化
酶酶解脱除云芝粗多糖中的淀粉。α-淀粉酶和糖化酶均具
有很强的专一性。云芝菌丝体中提取的胞内多糖为含蛋白
质的糖肽，主要成分 b（1-4）、b（1-3）或 b（1-4）、b（1-6）为主
链，侧链上有 b（1-3）或 b（1-6）结合的分枝，多糖含量 30％ ~
60％，蛋白质含量 10％~30％；主要的单糖组成是葡萄糖，其
次为甘露糖，少量的半乳糖、木糖和岩藻糖 。耐高温 α-淀粉
酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断 α
（1-4）链最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主。糖化酶
能在常温条件下将淀粉分子的 a（1-4）和 a（1-6）糖苷键切开，
而使淀粉转化为葡萄糖。耐高温 α-淀粉酶和糖化酶能酶解
去除云芝菌丝体粗多糖中的淀粉而对于云芝多糖没有破坏。
2.3 样品的预处理 样品的预处理的目的就是为了去除样
品中可能存在的还原糖对后期试验中DE值分析的影响。试
验中出现样品没有预处理，使试验中 DE值偏高，而且影响
DE值变化，使正交优化实验影响因子数据受到干扰，后经检
测样品中存在还原糖，又重新试验。
2.4 预备实验 对耐高温 α-淀粉酶酶解效果及糖化酶酶解
效果的影响因素的确定，其中酶的用量就是一个关键因素，
处理好，可以减少后面一些重复试验。α-淀粉酶理论用量
0.5 mg/g（以底物计），那么预试验以用酶量 0.5 mg/g和 1 mg/g
（以底物计）对样本进行处理，pH6.5、在 90℃水浴中酶解，每
10 min用碘液检测一次，10 min后 1 mg/g处理的已不显蓝色，
20 min后 0.5 mg/g也不显蓝色了，证明此用量可行。因此确
定以淀粉酶用量 0.5、0.8、1 mg/g（以底物计）为研究参数。糖
化酶理论用量为 10 mg/g（以底物计），那么预试验以，用酶量
10 mg/g和 20 mg/g（以底物计）对样本进行处理，pH4.5、在
60℃水浴中酶解，每 30 min检测一次DE值，1 h后测定DE值
分别为 25.41%、45.5%，数据不理想，可能酶的酶活与理论数
据有差距，重新以糖化酶 40 mg/g（以底物计）处理 1 h后测定
DE值为 83.64%，因此确定以糖化酶用量 20、30、40 mg/g（以
底物计）为研究参数。
2.5 耐高温 α-淀粉酶酶解优化结果 利用耐高温 α-淀粉
酶使淀粉初步水解，为后续糖化酶酶解除淀粉创造条件。耐
高温α-淀粉酶酶解除淀粉的正交优化实验结果见表 3。
表3 耐高温α-淀粉酶酶解正交试验结果
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
A
3
1
3
2
2
1
1
2
3
11.61
10.89
13.55
2.66
B
3
2
1
1
3
1
3
2
2
9.33
13.34
13.37
4.04
C
1
3
3
2
3
1
2
1
2
12.26
13.10
10.68
2.42
D
2
2
3
2
1
1
3
3
1
10.75
11.66
13.63
2.88
DE/%
14.8
11.24
11.15
8.94
9.65
7.91
15.67
14.08
14.70
由表 3可知，耐高温 α-淀粉酶酶解除淀粉优化试验中各
因素对 DE值的影响主次顺序为 B>D>A>C，即 α-淀粉酶用
量>酶解时间>酶解温度>pH。综合考虑后得到耐高温 α-淀
粉酶酶解的优化工艺条件组合为A3B3C2D3，即加酶量 1 mg/g、
pH6.5、温度 100℃、时间 40 min。在该优化条件下进行验证
试验，最后测得淀粉酶酶解DE值为 16.89％。
2.6 糖化酶酶解优化结果 糖化酶酶解除淀粉正交优化实
验结果见表 4。
表4 糖化酶酶解除淀粉正交优化试验结果
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
A
3
1
3
2
2
1
1
2
3
79.96
80.61
80.46
0.65
B
3
2
1
1
3
1
3
2
2
70.95
82.21
87.87
16.92
C
1
3
3
2
3
1
2
1
2
79.91
80.89
80.23
0.98
D
2
2
3
2
1
1
3
3
1
76.97
80.42
83.64
6.67
DE/%
87.63
81.79
74.25
71.84
84.65
66.76
91.32
85.34
79.51
由表 4可知，糖化酶酶解除淀粉优化试验中各因素对DE
值的影响主次顺序为 B>D>C>A，即糖化酶用量>酶解时间>
pH>酶解温度，综合分析结果得到糖化酶酶解的最佳工艺条
件组合为A2B3C2D3，即酶解温度 60℃，加酶量 40 mg/g，pH4.5，
贮 藏 加 工
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2016（4）dible fungi
蛹虫草（Cordyceps militaris）为子囊菌亚门麦角菌目麦角
菌科虫草属的菌种[1]，与冬虫夏草（Cordceps sinensis）同为虫草
同属异种，是一种药食两用的名贵食药用菌。蛹虫草中所含
的多种活性物质，如虫草素、虫草多糖、虫草酸等活性成分，
具有抗肿瘤、抗炎、提高免疫力等多种功效。研究表明，虫草
多糖是一种半乳糖甘露聚糖，它能促进淋巴细胞转化，提高
血清 IgG的抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌、
抑癌的能力。它不仅能激活 T、B淋巴细胞、巨噬细胞和自然
杀伤细胞，还能活化补体、促进细胞因子包括肿瘤坏死因子
和白细胞介素生成，从而对免疫系统发挥多方面的调节作
用 [2]-[3]。此外，虫草多糖还具有抗炎抑菌作用。目前研究表
明，虫草素具有较好的抗癌活性，其抗癌机理为抑制mRNA
的合成。现已用于白血病、脑瘤及其它肿瘤的治疗。
目前，人工栽培蛹虫草已获得成功，并实现了规模化生
产，年产量已达到万吨[4]，其中大部分是用于保健食品中。为
了提高产品的功效和附加值，一般需要对蛹虫草进行提取，
再做相应的产品。在蛹虫草栽培子实体的同时会产生大量
的菌皮，其成分与子实体类似[5]。蛹虫草菌皮来源广泛，价格
低廉，以变废为宝的理念，充分利用蛹虫草菌皮，以蛹虫草菌
皮作为提取虫草多糖和虫草素的原料，以虫草多糖和虫草素
提取率为指标，考察了提取时间、提取温度、料液比及提取次
数，优化出蛹虫草多糖及虫草素的综合提取工艺。
1 材料与方法
1.1 供试材料和仪器 蛹虫草菌皮购自张家港顺泰元生物
科技有限公司。N-腺苷、虫草素、腺苷标准品由 sigma公司提
供（纯度≥98%）。无水乙醇、浓硫酸、苯酚、甲醇为色谱纯，其
余化学试剂均为分析纯。实验用水为蒸馏水、超纯水。
Waters2695型高效液相色谱仪，色谱柱：AQ-C18柱（5 μm，
250 mm×4.6 mm），Waters2487紫外检测器；FA2004N分析天
平，DTN超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），
eppendorf 移液枪，Allegra 25R高速冷冻离心机（美国贝克曼
库尔特有限公司），MSC-100恒温混匀仪（杭州奥盛仪器有限
蛹虫草多糖及虫草素的综合提取工艺优化
吐尔尼散·吐地 1 张 忠 2 严培兰 3 周 帅 2 张 勉 1 唐庆九 2*
（1中国药科大学研究生院中药系，江苏南京 211198；2上海农业科学院食用菌研究所，上海奉贤 201403；
3上海农业科学院质量标准与检测技术研究所，上海奉贤 201403）
摘 要 以蛹虫草菌皮为材料，研究虫草多糖和虫草素的提取
工艺，通过单因素正交试验考察了提取温度、提取时间、料液比
及提取次数 4个因素对虫草多糖和虫草素提取率的影响，建立
了提取虫草多糖及虫草素的最佳工艺，即优化条件为：提取温
度 100℃，提取时间 2 h，料液比 1∶10，提取次数 2次，此时虫草多
糖提取率可达 8.72%，虫草素的提取率达到 0.2908%。
关键词 蛹虫草 虫草多糖 虫草素 提取工艺
文章编号 1000-8357（2016）04-0054-03
收稿日期：2015-12-25一稿；2016-03-02修改稿。
基金项目：科技部农业科技成果转化资金项目：高纯度虫草素规模
化制备技术的优化与应用。项目编号 2014GB2C000071。
作者简介：吐尔尼散·吐地，在读硕士，主要从事食用菌生物发酵与
有效成分的分离纯化工作。联系电话：15221602894。*通讯作者：唐庆九，研究院，博士，研究方向是药用菌中活性物质
的分离纯化、活性筛选以及工艺。
贮 藏 加 工
酶解时间 2 h。在该优化条件下进行验证试验，最后测得糖
化酶酶解 DE值为 92.79％。耐高温 α-淀粉酶和糖化酶酶解
除淀粉后得到的云芝菌丝体粗多糖经测定已不含淀粉。采
用硫酸-蒽酮法测得除淀粉后的云芝多糖纯度为 62.6%，这表
明淀粉酶和糖化酶酶解可达到有效去除云芝菌丝体粗多糖
中淀粉的目的，显著提高云芝多糖的纯度，为云芝菌丝体粗
多糖的进一步纯化创造了条件。
3 小 结
通过液体发酵方法提取得到云芝菌丝体粗多糖，由于发
酵原料残留，使通过水提醇沉得到的云芝菌丝体粗多糖含有
许多淀粉，经测定实验样品中淀粉为 18.26%。
云芝菌丝体粗多糖酶解除淀粉工艺优化研究结果表明：
采用耐高温 α-淀粉酶、糖化酶酶解去除淀粉效果较好。耐
高温α-淀粉酶酶解的优化工艺条件为加酶量 1 mg/g、pH6.5、
酶解温度 100℃、酶解时间 40 min，该条件下酶解后 DE值为
16.89%。糖化酶酶解的最佳工艺条件为酶解温度 60℃，加酶
量 40 mg/g，pH4.5，酶解时间 2 h。在该优化条件下进行验证
实验，最后测得糖化酶酶解DE值为 92.79％ 。酶解法除淀粉
后多糖纯度由 46.7%提高至 62.6%，耐高温 α-淀粉酶和糖化
酶能明显酶解去除云芝菌丝体粗多糖中的淀粉而对于云芝
多糖没有破坏，为云芝菌丝体粗多糖的分离纯化提供了可靠
的方法。
参考文献
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品工业技术，2012，10：243-246.
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技术学报，2006，25（1）：65-69.
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