全 文 ：食用菌学报 9 9 9 6 1( 1): 9 一 13
A eta E d u li sF t一n gi
培养时间与培养基种类
对毛木耳同工酶酶谱的影响
阎培生 ` 罗信昌
(华 【} ,农业大学应用真菌研究 J梦r , 武汉
周 启
(华中农 业大学生命科学技术学院 , 武汉
4 3 ( ) ( )7 ( ) )
4 3 (川 7〔) )
摘 要 通过 研究幼养 ! !寸问和培养墓 种类对毛 木耳 同 ! _ 酶凝 胶 l1\ 、.)J 图 i普的 影响 , 证实酷酶 同
卜酶在 毛木耳中是一种稳定表达的酶类 , 培养时间和培养从种 类对生!、 龙明撇影响 ; 苹果酸脱 氢酶 同
〔酶不受培养基种类的影响 , 似随培养 l付问的 延 长 , 山 5 一 l() dl 付的 一 茶带减 为 巧 一 2 d5 时的 二 条
带 ;多酚氧化酶同 卜酶和过氧化物酶同 J二酶受培 养从种类的彰响 掀著 , 仁毛除培 养初期酶带数较少外 ,
石: 1 0 一 2 5 d 时酶带数稳定不变。 !41此 :可筛选 出最适培养 }!扫rl] 和培养刀一 忡类 , ) IJ 几木耳属菌株的分类
鉴定。
关键词 毛木 耳 ; 同 l 酶酶语 ; :.iJ 养时 1习; 士吝养从
木耳是我国传统栽培 食用菌 , 但 目前生产中应用的菌种比较成乱 , 这不利于木耳生产的进
一步发展 , 更不利于木耳育种工作 , 因此 , 有必要对木耳菌株 .进行 自效的分类鉴定 。 传统的木
耳分类主要是根据外部形态特征及内部构造进行 〔 ’ 、 , 尤其是 I o w y 提出的根据木耳子实体 内
部构造进行分类川 ,解决了木耳分类中长期存在的混乱 局面 , 但内部构造作为一种形态特征
指标 , 也容易受外界环境变化的影响 。 同工酶作为一种分子标记 , 不易受外界环境 条件的彩
响 , 具有稳定性 , 因此 , 自 C la ll g 等首次应用凝胶电泳技术对真菌进行研究以来闭 , 已有大童
的文献报道利用同工酶对真菌进行分类研究 〔4 一 7〕 。 有关木耳的同工酶研究报道较少娜 一 ’ 。` , 研
究的同工酶种类亦少 , 缺乏系统性 , 为此 , 我们较系统地研究了毛木耳同工酶凝胶电泳 , 以期有
助于木耳属菌株的快速有效鉴定 。
1 材料与方法
1
,
1 供试菌株
毛木耳 ( A , ` ,一 (I 、 l a ,一故 P ,l) yt 厂 i访 a ) , 本室保存菌株 。
1
.
2 培养基
1
.
2
.
1 马铃薯葡萄糖培养基 ( 简称 P D ) 去皮马铃薯 2() ( )g , 葡 萄糖 2() g , 水 l() () m l 。
1
.
2
.
2 牛肉膏蛋 白栋培养基 ( 简称 B )P 牛肉寸于5 , ( ) g , 蛋白陈 川 . () g , N a 1C 5 . ( ) g 。
1
.
2
.
3 完全培 养基 ( 简称 C M ) 葡萄糖 2() g , 蛋 自陈 2 9 , 醉 王士行 2 9 , M g (S ) 4 · 71 几0 0 , 5 9 ,
K H Z P (五 () . 4 6 9 , K Z I{ P ( ) 4 1 9
1 2
.
4 麦芽抽提物培养基 ( 简称 Y M ) 麦芽抽提物 0 . 3 埃, , 酵母介 0 . 3 % , 蛋 白陈 (j . 5 埃, , 葡萄
收稿日期
` 第 一 作
19 9 7 一 12 一 2() 初稿 ; l , , 8 一 3 一 6 修改稿
若 : 刑教授 , 在读博 卜 ] _ 作 l朴位 : 莱阳农学院 掖保 系 , 山东 , 莱阳 , 2() 月叫
DOI : 10. 16488 /j . cnki . 1005 -9873. 1999. 01. 003
10 食 用 菌 学 报 6卷
糖 l `沁 。
1
.
3 培养方法
在 1 ) 5( mI洲 三角瓶中分别装入 0 5 mI J 上述四种液体培养基 , 灭菌后 , 按无菌操作分别接入 5
块直径 0 . cs m 、厚度 0 . c2 m 的活化菌种块 , 仪 25 ℃ 恒温箱 中挣止培养 1( )d , 每处理重复 3 次
培养时间实验 中 , 在 15() m I _ 三角瓶中分别装入 S Om I J C Y M 液体培养基 , 按 无菌操作接入 5 块
直径 0 . s c m 、 厚度 o . Z c m 的活化菌种块 , 段 2 5℃ 恒温箱睁止培养 5 、 10 、 15 、 20 和 25 d , 每处理重
复 3 次 。 培养结束后 , 将上述处理 3 个重复的菌丝体混合 , 经蒸馏水冲洗十净后 , 用滤纸吸干
水分 , 保存于 一 2 0℃冰箱中备用 。
1
.
4 电泳样品制备及电泳条件
取冷冻菌丝体 0 . 5 9 , 加入 l m l 洲 0 . I M T r iS 一 H C I( p H 6 . 8) 缓冲液 , 在冰浴中研磨成匀浆 , 于
1 2 () o
r
/ m in 下离心 巧 m i n , 取上清液与等体积 40 % 蔗糖及少许嗅酚兰液混匀后 , 作电泳样品 。
用 D Y Y 一 1 S A 型稳压稳流电泳仪和 D Y Y 一 1 2 8 A 型夹心式垂直板 电泳槽进行聚丙烯
酸胺凝胶电泳 , 胶板面积为 1 4 . 5 9 . 5 c m , 厚度为 o . 3c m , 浓缩胶浓度为 3 啊, , p H 6 . 7 , 分离胶浓
度 为 7 . 5 % , p H S , 9 , 制备方法参阅文献 〔1 1〕, 电极缓 冲液 为 丁 1r s 一 ;(l y ( p L 18 . 3 )缓 冲系统 。 电
泳时 , 每一样 品槽加 入 10 0讨一 样 品 , 于 4℃ 电泳 , 浓缩胶 时稳 压 2 0 0 V , 进 入 分离胶 后稳 压
3( )( v
, 电泳完毕后 , 进行染色 。
1
.
5 同工酶的检测
电泳结束后 , 立即染色 , 染色后用水冲洗干净 , 保存于 7 % 醋酸中 , 并拍照 、 描 图 。 酉旨酶同
工酶 、 过氧化物酶 同工酶及苹果酸脱氢酶同工酶显色方法参阅文献 〔1 1〕, 多酚氧化酶同工酶显
色方法参阅文献 〔8〕。
电泳迁移率 ( fR )为酶带 向正极泳动距离与澳酚兰指示剂向正极泳动距离之 比 。
2 结果与分析
2
.
1 培养时间对毛木耳同工酶凝胶电泳图谱的影响
2
.
1
.
1 醋酶 同工酶与苹果酸脱氢酶同工晦 培养时间对毛木耳醋酶 同工酶 电泳图谱无明显
影啊 , 在 5 一 25 d 内均 出现 5 条明显可辨的褐色酶带 ( 图 I A ) , 迁移率亦完全 一 致 , 但各酶带的
显色程度不同 , 多数酶带随培养时间的延长 , 色泽加深 。 另外 , 随培养时间的延长 , 在 15 一 2 5 d
内 , 在近负极区出现一条不十分明显的弱宽带 。
苹果酸脱氢酶同工酶随培养时问的延长 , 酶带数减 `以 13) I B ) , 由培养 5 一 1 ()d 时的 3 条带
减为 15 一 2 5 d 时的 2 条带 , 但对酶带的染色程度无明显 彩响 , 而且 消失的一 条酶带为一细带 ,
其 `它两条均 为宽带
2
.
1
.
2 过氧化物晦同工晦与 多酚氧化晦 同工晦 过氧化物酶同工酶带数在培养 5(1 时有 2 条
酶带 , 培养 1(j 一 2 5 d 后 , 酶带数稳定在 3 条 (图 I C ) , 但随培养时 间的延长 , 各酶带显色深度呈
增加趋势
由图 I D 可知 , 多酚氧化酶同工酶在 s d 内有 2 条酶带 , 在 l() 一 2 5 d 内 , 则稳定地存在 4 条
酶带 , 表明培养时间对多酚氧化酶同工酶酶谱 彩响较少 _ .
2
.
2 培养基种类对毛木耳同工酶凝胶电泳图谱的影响
2
.
2
.
1 酉旨酶 同工酶与苹果酸脱氢酶同工酶 四种培养纂对酷酶同工酶酶谱的彩啊 见图 Z A .
l !UI 阎培生 :结 养}I寸l川 , J培 养 i)t 仲类对毛木耳 I J _ { 卿 f海i释的彩响
不同培养基成分对毛木耳酷酶同工酶酶谱的彩响不明显 , 除牛肉育 、 蛋白陈培养基 比其它三种
培养基在近正极区少一条浅弱紫红带外 , 其它酶带位投及数 目完全 一致 , 只是显色深浅略有差
别 。
同样 , 四种培养基对苹果酸脱氢酶同工酶酶谱亦无影响 , 均稳定地存在 3 条谱带 (图 ZB ) 。
2
.
2
.
2 过氧化物酶 同工酶 与多酚氧化晦 同工晦 由图 2( 二可知 , 培养荃种类对毛木耳过氧化
物酶同工酶酶谱有显著影响 , 酶带数最少 2 条 (牛 肉音 、 蛋白膝培养基 ) , 最 多 7 条 (马铃薯 、 葡
萄糖培养基 ) , 表明过氧化物酶同工酶是一种诱导酶 , 随培养基成分的变化而呈 多态性 。
由图 ZD 可知 , 四种培养基对毛木耳多酚氧化酶同工酶酶谱亦生 (有显著彩啊 , 不同种类的
培养基 , 其酶谱差异显著 , 酶带数最少 2 条 (牛肉音 、 蛋白陈培养基 ) , 最多 6 条 ( 马铃薯 、 葡萄糖
培养基 ) , 呈明显的多态性 。
迁移率 迁移 一攀 Rf
迁移率 R f 迁移率 R「
八 醋 酶 , l` . 苹果酸 脱致酶 , 〔 l 过 氧化 物晦 , 1) . 多酚乳化酶
E s 一e r o s 。 , 1弓. M 台 la 一( 、 、 {。 l 、y击 ( ) g 。 丫一a 、 。 、 C . I )。 r ( 。x id a 。、、 , 1) . 1〕 ( ) ly , l一u , 1、 。l ( ) x l d。 、 。
图 l 培养 时间对毛木耳同工酶酶谱的影响
F ig
.
1 E f fe e t
峨》 f e u l t z一r e t i n 、 e o n t h e i姗 z y n一e z y n 一o g r a n 一 叮,f 气 . p口 Iyt ir e h 。
3 讨论
已有研究表明 , 真菌同工酶分析结果易受取样部位 (营养菌丝体 、 子实体 、 分生饱子 、 菌核
等 ) 、 核相 (双核 、 单核 ) 、 培养条件 (时间 、培养基 )的彩咧 , 导致结果不稳定 、不 准确 , !司此 , 条件
一致是极为重要的 〔` 2 ! 。 本研究结果表明 , 毛木耳酷酶同工酶是 一稳定的酶系 , 不 易受培养时
间和培 养基种类的彩啊 , 这与李惠君等 鱿’ 3〕对香菇菌丝体酷酶 同工酶的研 究结果相同 , 而与
()l 飞m fls a 等川对香菇的研究结果不同 。 金针菇的醋酶同工酶带数也随培养时问的延长而增加 ,
由 2() d 培养期 内的 2 一 3 条带增 ·加到 3() d 培养期 内的 4 一 7 条带 一’ 5 ` 。 毛木耳苹果酸脱氢酶同
12 食 用 菌 学 报 6 卷
迁移率 f R迁移率 f R
Y M CY M C Y M
迁移率 f R迁移率 f R
Y M C Y M Y M C Y M
A
. 酮畴 , B . 苹果酸脱 氢酶 , C . 过 载化物晦 , D . 多酚氧化晦
A
.
E
s t c r a s e
,
13
.
M
a
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图 2 培养基对毛木耳同工酶酶谱的影响
F ig
.
2 E f fe c t o f n l e d i u n 、 un t h
e i , ) yz n , e , y n l .) g r a n , o r A
.即勺盆icr h`
工酶不受培养基种类的影响 , 但随培养时间的延长 , 靠近正极区的一条细带消失 , 而稳定地存
在 2 条宽强带 , 这是因为苹果酸脱氢酶是 T C A 环中重要的酶 , 比较稳定 , 但 ( )l m as a 等川 发
现 , 香菇苹果酸脱氢酶同工酶酶谱在不同培养基组成及不同培养时间下有变化 。 毛木耳过氧
化物酶同工酶和多酚氧化酶同工酶酶谱受培养基种类的影响显著 , 但受培养时间的影响较少 ,
在 10 一 2 5 d 内 , 酶谱十分稳定 ,这与陈立国阁对黑木耳 多酚氧化酶 同工酶的研究结果相似 , 他
发现黑木耳多酚氧化酶同工酶在 6 一 63 d 均稳定地显示 3 条酶带 , 但显色有快慢 , 显色深浅随
菌龄不同而异 。
综上所述 , 可以认为醋酶同工酶 、 苹果酸脱氢酶同工酶 、 多酚氧化酶 同工酶和过氧化物酶
同工酶是适宜毛木耳凝胶 电泳分析的酶系 , 在 10 一 1 5d 培养期内 , 采用 P D 培养基或 CM 培养
基 , 可获得稳定的 、 呈 多态性的酶谱 , 从而可用于快速有效地分类鉴定木耳属菌株 。
参 考 文 献
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3 5 1 一 3 5 8 .
N a 一: 一r e , 19 6 2 , 19 3
1期 阎培生 :培养时间与培养基种类对毛木耳同工酶酶谱的影响 13
4O m h翻 M , F u ur k a w a H . A n a l邓is o f e s t e r a se a n d m a la r e d e h y d r o g e n a s e iso z y m e o f L o n z i 越 u l a 改入笼 l“ b y isoe le e -
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