全 文 ：文章编号:1001-4829(2008)01-0121-04
收稿日期:2007-09-20
基金项目:四川省育种攻关项目
作者简介:许晓燕(1981-), 女 ,硕士研究生 , 主要从事微生物
和菌物学研究。
利用 AFLP和 SRAP标记
分析 19株毛木耳的遗传多样性
许晓燕1 ,余梦瑶 1, 2 ,罗 霞 1 ,江 南 1 ,曾 瑾 1, 4 ,魏 巍1, 2 ,郑林用 3＊
(1.四川省中医药科学院,四川 成都 610041;2.四川大学生命科学院 ,四川成都 610064;3.四川省农科院科技处 ,四川 成都
610066;4.成都中医药大学 ,四川 成都 611137)
摘 要:利用 AFLP和 SRAP标记对 19株毛木耳进行遗传多样性分析。 12对 AFLP引物扩增得到 624条片段 , 14对 SRAP引物扩
增得到 459条片段 ,采用聚类分析都供试材料被分为 4个群。 结果表明 , AFLP和 SRAP标记均适合毛木耳遗传多样性分析 ,而
SRAP标记较 AFLP标记简便 ,更适于大规模的遗传多样性分析。
关键词:毛木耳;AFLP标记;SRAP标记
中图分类号:S646.6 文献标识码:A
MoleculardiversityofAuriculariapolytricharevealedbyAFLPandSRAP
XUXiao-yan1 , YUMeng-yao1 , 2 , LUOXia1 , JIANGNan1 , ZENGJin1, 4 , WEIWei1 , 2 , ZHENGLin-yong3＊
(1.CeluarandMolecularLabofChineseMaterialMedica, SichuanInstituteofChineseMaterialMedica, SichuanChengdu610041, China;
2.LifeScienceCollegeofSichuanUniversity, SichuanChengdu610064, China;3.SichuanAcademyofAgricultureSciences, SichuanCheng-
du610066, China;4.ChengduUniversityofTCM, SichuanChengdu611137, China)
Abstract:DuetounsatisfyingatemptstofingerprintA.polytricha, twodiferentmolecularmakersystems, AFLPandSRAP, wereestab-
lishedandtestedtoquantifymoleculardiversityamong19strainsofthisfungus.Atotalof624and459polymorphicbandsweredetectedby
12AFLPprimersand14SRAPprimercombinations, respectively.Byparsimonymethod, aphylogenetictreewasconstructedbasedoneach
analysis.Andthetwotreesshowedthat19A.polytrichastrainsweredistributedintofourgroups, respectively.Theseresultsdemonstratedthat
bothmethodsweresuitableforthediscriminatingamongstrainsofA.polytricha, andthenovelSRAPmarkersaremoreeficientandprefera-
ble.TheresultalsoindicatedthatthehighlevelofgeneticdiversityofA.polytrichaandtheirrelationshipbetweeneachothers.Thesefinds
wouldbebenefittofutureresearchinA.polytricha, especialyinbreedingandmedicinedevelopment.Italsogaveausefulmethodforother
fungifingertyping.
Keywords:Auriculariapolytricha;AFLP;SRAP
自 Grodziker于 1974年创立了 RFLP技术 , Bot-
stein[ 1]利用该技术于 1980年构建了人类遗传连锁
图谱 ,目前已经建立的 DNA分子标记技术达十余
种 ,并广泛应用于动 、植物和微生物等。其中 ,扩增
片段长度多态性 (AFLP)是 1993年由荷兰科学家
Zabeau和 Vos[ 2]提出的一种检测 DNA多态性的方
法 ,它可以检测整个生物基因组的多态性 ,具有高
效 、分辨率高 、可靠性好 、重复性好等特点。相关序
列扩增多态性 (SRAP)是一种基于 PCR的新型标
记 ,由美国加州大学的 Li和 Quiros博士 [ 3]于 2001
年提出。 SRAP独特的引物设计使其可以检测基因
的可阅读框(ORF)区域 ,是一种无需任何序列信息
即可直接 PCR扩增的新型分子标记技术 ,以其操作
简便迅速 、成本低 、可靠性好 、重复性高 、易于测序等
特点迅速被各国分子生物学家所接受。
本实验室利用 AFLP和 SRAP分子标记对 19株
毛木耳(Auriculariapolytricha)进行分析 ,以揭示其
遗传多样性 ,为全面评估其种质资源及高效精深加
工提供理论依据和基础材料 。
1 材料与方法
1.1 供试材料
19株毛木耳 ,见表 1。
1.2 菌丝体总 DNA的提取
采用 CTAB法 [ 4]提取菌丝体总 DNA。
121
2008年 21卷 1期
Vol.21 No.1
西 南 农 业 学 报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences
表 1 进行 SRAP和 AFLP标记的 19株毛木耳和黑木耳 、盾形木耳
Table1 AuriculariastrainsusedforAFLPandSRAPanalysis
编号 No. 原名 Strains 来源 Source 编号 No. 原名 Strains 来源 Source
A1 781 福建三明真菌所 A12 青优 四川省食用菌菌种场
A2 951 四川省食用菌菌种场 A13 黄 10 四川省食用菌菌种场
A3 川耳 1号 四川省农科院土肥所 A14 江枫黄耳 四川省农科院土肥所
A4 川耳 7号 四川省农科院土肥所 A15 琥珀 四川省农科院土肥所
A5 台毛 1号 福建轻工所 A16 特大 四川省食用菌菌种场
A6 台毛 3号 福建轻工所 A17 大光 福建轻工所
A7 上海 1号 四川省农科院土肥所 A18 故乡 19 四川省农科院土肥所
A8 上 1 四川省农科院土肥所 A19 紫木耳 四川省食用菌菌种场
A9 小上 3 四川省食用菌菌种场 A20 黑木耳 四川省农科院土肥所
A10 大上 3 四川省食用菌菌种场 A21 盾形木耳 四川省农科院土肥所
A11 三优 四川省食用菌菌种场
表 2 AFLP引物序列
Table2 PrimersequenceusedforAFLPanalysis
引物
Primers
编号
No.
碱基序列
Sequences(5 -3 )
EcoI接头 E1 CTCGTAGACTGCGTACC
E2 AATTGGTACGCAGTCTAC
MseI接头 M1 GACGATGAGTCCTGAG
M2 TACTCAGGACTCAT
预扩增引物 Ea GACTGCGTACCAATTCA
Mc GATGAGTCCTGAGTAAC
选择性扩增引物 Eaaa GACTGCGTACCAATTCAAA
Eaac GACTGCGTACCAATTCAAC
Eaca GACTGCGTACCAATTCACA
Eact GACTGCGTACCAATTCACT
Eacg GACTGCGTACCAATTCACG
Eaga GACTGCGTACCAATTCAGA
Eagc GACTGCGTACCAATTCAGC
Eat GACTGCGTACCAATTCATT
Eatc GACTGCGTACCAATTCATC
Eatg GACTGCGTACCAATTCATG
Mcaa GATGAGTCCTGAGTAACAA
Mcat GATGAGTCCTGAGTAACAT
Mcac GATGAGTCCTGAGTAACAC
Mcag GATGAGTCCTGAGTAACAG
Mcta GATGAGTCCTGAGTAACTA
Mctg GATGAGTCCTGAGTAACTG
Mcca GATGAGTCCTGAGTAACCA
Mcct GATGAGTCCTGAGTAACCT
Mcga GATGAGTCCTGAGTAACGA
Mcgc GATGAGTCCTGAGTAACGC
1.3 AFLP标记分析
采用双酶切技术对总 DNA进行酶切。 EcoRI
和 MseI内切酶(MBI)酶切基因组 DNA后 ,采用 T4
连接酶(Promega),与 EcoRI接头和 MseI接头连接
(接头和引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成 ,
见表 2)。预扩采用 E+1/M +1引物组合 ,反应体
系为 20μl。选扩采用 E+3 /M+3引物组合 ,反应
体系为 20 μl。
PCR扩增在 Mycycler型 PCR扩增仪上完成。
AFLP选扩产物 95℃,变性 5min。在 8 %聚丙烯酰
胺变性凝胶上电泳分离(Sequi-GenGT38 cm ×50
cm, Bio-rad),电泳缓冲液采用 1×TBE, 恒功率 75
W,电泳 3 h,电泳结束后采用银染方法 [ 5]显影 。
1.4 SRAP标记分析
通过对产物多态性和重复性的预试 ,筛选出由
10个正向引物和 12个反向引物 (引物由上海捷瑞
生物工程有限公司合成 ,见表 3)组成的 14对引物
进行试验 。PCR扩增采用 Li和 Qurios的方法。在
8%聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳分离(Sequi-GenGT
38cm×50 cm, Bio-rad),电泳缓冲液采用 1×TBE,
恒功率 75W,电泳 3 h,电泳结束后采用银染方法[ 5]
显影 。
1.5 数据处理
AFLP和 SRAP的扩增产物分别按条带有无分
别赋值 ,有带记为 1,无带记为 0。采用 PAUP＊(ver-
sion4b)(进化系统简约性分析 PhylogeneticAnalysis
UsingParsimony)进行简约性分析并采用重复数为
500的 Bootstrap检验 [ 6] 。
122 西 南 农 业 学 报 21卷
表 3 筛选出的 SRAP引物序列
Table3 PrimersequenceusedforSRAPanalysis
正向引物
Forwardprimers
碱基序列
Sequences(5 -3 )
反向引物
Reverseprimers
碱基序列
Sequences(5 -3 )
F1 TGAGTCCAAACCGGATA R1 GACTGCGTACGAATTAAT
F3 TGAGTCCAAACCGGAAT R2 GACTGCGTACGAATTAAC
F4 TGAGTCCAAACCGGACC R4 GACTGCGTACGAATTTGA
F5 TGAGTCCAAACCGGAAG R6 GACTGCGTACGAATTGCA
F6 TGAGTCCAAACCGGACA R7 GACTGCGTACGAATTGAC
F7 TGAGTCCAAACCGGTGT R8 GACTGCGTACGAATTGGT
F8 TGAGTCCAAACCGGTCA R9 GACTGCGTACGAATTGTC
F10 TGAGTCCAAACCGGCTA R10 GACTGCGTACGAATTCCA
2 结果与分析
2.1 DNA提取
使用 CTAB法提取 DNA, DNA获得量较多 ,很
少有降解现象 ,而且蛋白质 、多糖 、RNA等杂质也非
常少 ,纯度较高 ,质量较好 。
2.2 AFLP标记分析
12对 AFLP引物扩增得到 667条片段 , 其中
617条属于多态性条带 。每组引物扩增的条带 、多
态性条带和多态率见表 4。
由图 1可知 ,根据 AFLP标记结果 , 19株毛木耳
可以分成 4个群 , I群包括 A1、A3、A4、A6、A7、A8、
A11、A12、A15、A16、A17、A19, I群包括 A2、A5、
A9 , II群包括 A10、A13, IV群包括 A14、A18。
表 4 AFLP引物扩增条带 、多态性条带和多态率
Table4 LevelofpolymorphismobtainedbyAFLPanalysisin19A.
polytrichastrains
引物组合
Primer/ primer
combination
条带 Bands
总数
Total
多态性条带
Polymorphic
多态率(%)
Percentageof
polymorphism
Eaaa/Mcaa 56 56 100.00
Eaaa/Mcat 51 42 82.35
Eaac/Mcat 58 54 93.10
Eaac/Mcag 94 93 98.94
Eaac/Mcca 63 60 95.24
Eaca/Mcca 60 59 98.33
Eact/Mcat 43 43 100.00
Eact/Mctg 35 33 94.29
Eact/Mcca 41 41 100.00
Eacg/Mcaa 48 46 95.83
Eagc/Mcaa 31 29 93.55
Eatg/Mcag 44 44 100.00
总数 624 600 96.15
平均数 52 50 96.15
2.3 SRAP标记分析
14对 SRAP引物扩增得到 459条片段 ,其中
440条属于多态性条带。每组引物扩增的条带 、多
态性条带和多态率见表 5。
由图 2可以看出 ,经过对 SRAP标记结果进行
分析 , 19株毛木耳可以分成 4个群 , I群包括 A1、
A3、A4、A6、A7、A8、A11、A12、A15、A16、A17、A19, II
群包括 A2、A5、A9, II群包括 A10、A13, IV群包括
A14、A18,与 AFLP标记分析的结果相似。
表 5 SRAP引物扩增条带 、多态性条带和多态率
Table5 LevelofpolymorphismobtainedbySRAPanalysisin19
A.polytrichastrains
引物组合
Primer/ primer
combination
条带 Bands
总数
Total
多态性条带
Polymorphic
多态率(%)
Percentageof
polymorphism
F1R9 39 39 100.00
F1R10 36 34 94.44
F3R2 19 19 100.00
F3R6 36 35 97.22
F4R9 25 24 96.00
F5R8 30 29 96.67
F5R10 35 35 100.00
F6R4 53 53 100.00
F7R4 31 29 93.55
F8R1 9 7 77.78
F8R2 29 26 89.66
F8R10 45 42 93.33
F10R7 43 43 100.00
F10R10 29 25 86.21
总数 459 440 95.86
平均数 32.8 31.4 95.86
1231期 许晓燕等:利用 AFLP和 SRAP标记分析 19株毛木耳的遗传多样性
图 1 由 AFLP标记得到的 19株毛木耳种系树
Fig.1 ParsimonyphylogenetictreebasedondatafromAFLP
analysisof19A.polytrichastrains
3 讨 论
在本试验中 ,笔者利用 AFLP和 SRAP标记对
19株毛木耳进行了遗传多态性分析。结果表明 ,毛
木耳具有较高的遗传多样性 。通过聚类分析 ,这 19
株毛木耳可以分成 4群 ,其中 I群包含 12株 ,占总
数的 63 %。在 I群中 ,某些菌株具有较高的相似
性 ,推论其在遗传关系上较近。而其它 3个群的菌
株数虽然只有 7株 ,但它们的亲缘关系较远 ,是育种
的良好材料。这一聚类结果与以前的结果大体相
似 ,但存在一定差异 。形态学上 A1与 A2在绒毛数
量 、颜色和子实体边缘形态 、颜色上相似 ,但与 A15
有明显不同 [ 7] ;同工酶分析并不能将 A10、A13与 I
群的其它菌株分开 [ 8] 。这些差异可能主要是由于
环境因素 、发育阶段和较少的同工酶基因多态性造
成的。而且 ,同工酶多态性往往在分析有性生殖产
生的个体差异中有用 ,但对于基因突变造成的差异
分辨率不明显。同时 ,与以前的 RAPD分析 [ 9]相比
较 ,在一些菌株的聚类位置上和本试验存在一些差
异 ,这可能是由于在研究中采用不同方法造成的 ,但
也应注意 RAPD的一些缺陷 ,如较差的重复性和较
低的信息量 。
比较 AFLP和 SRAP2种方法 ,可以发现 AFLP
和 SRAP都能很好的对 19株毛木耳进行聚类分析 ,
而且产生的结果几乎相同 ,说明两者都能应用于毛
木耳的遗传多样性分析 。同时 , SRAP作为一项新
的分子标记适用于真菌遗传多样性分析。从试验结
果也可以看出 , AFLP在信息量方面较 SRAP高 ,因
图 2 由 SRAP标记得到的 19株毛木耳种系树
Fig.2 ParsimonyphylogenetictreebasedondatafromSRAP
analysisof19A.polytrichastrains
此在应用中具有很好的前景 ,但其试验方法繁琐 ,成
本较高。 SRAP操作较 AFLP简便 ,信息量也较大 ,
同时 SRAP所扩增的片段可以非常容易的应用于测
序和共显性标记分析 , 尤其重要的是 , SRAP扩增
ORF区使得其适用于不同真菌的多种目的研究 ,如
SCAR标记 、图谱构建和基因克隆等 。因此 , SRAP
较 AFLP技术在遗传多样性分析中具有独到的优
势。
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(责任编辑 雷 波)
124 西 南 农 业 学 报 21卷