全 文 ：菌 物 学 报 24（1）：61~70, 2005
Mycosystema
毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究
杨建明 1,2 张小敏 2 邢增涛 3 陈明杰 2 曹晖 2* 谭琦 2 潘迎捷 2
(1南京农业大学生命科学学院 南京 210095; 2农业部食用菌遗传育种重点开放实验室 上海市农业遗传育种重点开放实验室 上海
市农业科学院食用菌研究所 上海 201106; 2安徽技术师范学院 凤阳 233100)
摘 要：对毛木耳 Auricularia polytricha AP4的粗酶液进行 PAGE电泳后发现含有三种漆酶同工
酶，并且通过运用 Native SDS-PAGE获得三种漆酶的分子量大小分别约为：LacA (110kD); LacB
(84kD); LacC (65kD)。对漆酶粗酶液通过硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析进行纯化，用
SDS-PAGE证明获得纯化的单一漆酶 LacB。LacB漆酶的反应的最适温度为 30℃，最适 pH为 3.0。
此酶氧化 ABTS 的 Km 值为 6.64× 10 － 5mmol/L,金属离子对酶活的影响很大，其中
Ca2+,Mg2+,Zn2+,Na2+,Ag2+对漆酶 LacB有明显的激活作用；Co2+, Hg2+, Fe3+, Fe2+, Ba2+ 等对酶活有明
显的抑制作用。LacB和其它真菌漆酶一样具有底物专一性不强的特点，并且 LacB对 RB亮兰染
料有很好的脱色作用。
关键词：同工酶, 粗酶液, 酶学性质
中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2005）01-0061-0070

漆酶（Laccase, 苯二醇氧化还原酶，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏
血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族（张敏等 2003）。漆酶能氧化酚
类和芳香族化合物，同时伴随 4个电子的转移，将分子氧还原成水。漆酶最早发现于日本漆树的
汁液中，后来证实，漆酶除了存在于植物中，还广泛地存在于真菌（尤其是白腐菌）中（Thurston
CF, 1994）。最近，也有报道称漆酶存在于细菌中（Givaudan et al., 1993； Alexandre & Zhulin, 2000）。
由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，其在生物制浆（Eggert et al., 1997; Srebotnik
E&Hammel , 2000）、生物漂白（Nyanhongo et al., 2002; Wong & Yu, 1999）、以及有毒化合物的降解
（Majcherczyk et al. 1998; Pickard et al., 1999）等方面具有潜在的应用价值，因而引起人们越来越多的
研究兴趣，成为环境保护用酶的研究热点。
我们从木耳属的27个菌株中筛选到一漆酶高产菌株毛木耳Auricularia polytricha AP4, 对AP4
产生的漆酶进行了分离纯化，并且就获得的单一组分漆酶 LacB 的酶学性质进行了初步研究，这
为以后克隆此酶的基因或其应用奠定了理论基础。
1 材料和方法
1.1 供试菌株
毛木耳 AP4 来自上海农科院食用菌研究所菌种保藏中心

*通讯作者 Corresponding author
收原稿日期：2004-06-01，收修改稿日期：2004-07-23
DOI:10.13346/j.mycosystema.2005.01.012
62 菌 物 学 报 24卷
1.2 试剂和仪器
1.2.1 试剂：2,2’-连氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（简称 ABTS），L-asparigen 为 Sigma 产品;
DEAE-Sepharose fast flow 为 Amersham Biosciences 产品；牛血清蛋白，低分子量标准为北京鼎
国产品，其它试剂均为国产分析纯。
1.2.2 主要仪器：核酸蛋白检测仪为 Beckman DU600; AKTA explorer (Amersham Biosciences)
1.3 产酶培养基
CMC 5g/L, KH2PO4 1.0g, K2HPO4 0.4g, MgSO4.7H2O 0.5g, CaCl2.2H2O 0.0148g, VB1 2.5mg
酵母提取物 1.0g, 土温 80 2mL, 微量元素混合液 1mL, NH4NO3+L-asparigen 26mmol/L。
微量元素混合液（ /L） : FeC6H5O7.H2O 4.8g, ZnSO4.4 H2O 2.6g, MnCl2.4H2O 2.0g,
CoCl2.6H2O 0.4g, CuSO4.5H2O 0.4g。 培养基的初始 pH4.0, 培养温度 25℃。
1.4 漆酶活力测定 (Bourbonnais & Paice, 1992)
1mL反应混合液中，含 5mmol/L ABTS100µL, 醋酸缓冲液（pH3.0）800µL, 粗酶液 100µL, 以
1min内催化氧化 1µmol/L ABTS的酶量为 1个酶活单位（IU）。已知 420nm处 ABTS的摩尔消光
系数为 3.6×104mol/L-1cm-1
1.5 蛋白浓度的测定
按参考文献（Edens et al., 1999）进行，以牛血清蛋白作为标准蛋白质。
1.6 粗酶液的制备
收集培养至 12d菌龄的菌丝培养液 2L，在 4℃ 10000g 离心 30min。收集上清液即粗酶液备
用。
1.7 硫酸铵分级沉淀漆酶蛋白样品的制备
向 AP4粗酶液中加入 80%饱和度的硫酸铵进行分级沉淀，于 4℃ 20000g 离心 30min，弃上
清液，取沉淀重溶于 20mL重蒸水中，于 16℃在 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH5.8）中透析过夜。
于 4℃ 10000g 离心 30min，取上清液保存于新的 50mL离心管中，在-70℃冷冻 2h以上，置于英
国生产的 EDWARD冷冻干燥机，在 T=-55℃, P=3×10-2mba条件下冷冻干燥 72h，获得的样品冻
干粉于-70℃保存备用。
1.8 DEAE-Sepharose fast flow离子柱层析分离纯化漆酶蛋白
用 3mL10mmol/L磷酸缓冲液（pH5.8）溶解冻干粉后，4℃ 10000g离心 30min, 取上清液，
再将它加到已经用 10mmol/L 磷酸缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose fast flow阴离子柱（1.5cm×
30cm）上。用 350mL 10mmol/L磷酸缓冲液（pH5.8）洗脱后，再用磷酸缓冲液配置的 0-1.0M NaCl
进行梯度洗脱，流速为 0.5mL/min（5mL/管）。将在 280nm处有吸收峰的管子收集起来，用 ABTS
法测量其酶活，将有漆酶活性部分分步收集起来，超滤浓缩至 5mL。
1.9 酶学性质的测定
1.9.1 毛木耳漆酶同工酶电泳：将粗酶液进行 PAGE电泳，再用 1.8.3方法染色。
1.9.2 漆酶蛋白分子量的测定及纯化蛋白鉴定：将经 80%硫酸铵分级沉淀后获得的漆酶蛋白样品
和标准分子量蛋白进行 SDS-PAGE，分离胶的浓度为 12％，浓缩胶的浓度为 4％；然后以相对迁
移率作图求得漆酶的分子量。
1.9.3 Native PAGE 和 Native SDS-PAGE 电泳染色：按文献 (Chen et al., 2003) 方法染色
1.9.4 考马斯亮兰染色：参考文献(郭尧君，1999)方法染色
1.9.5 动力学常数 Km 值的测定：漆酶 LacB 酶液与不同浓度的底物反应后测定其酶活力。用
Linewear-Burk作图法求出酶对该底物的 km值。
1期 杨建明等：毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究杨建明 63
1.9.6 温度对漆酶 LacB活性的影响：在不同温度下按 1.4方法测定漆酶活力。
1.9.7 温度对漆酶 LacB稳定性的影响：漆酶在不同温度下保温 120min,按 1.4方法每 15min测一
次值。
1.9.8 pH对漆酶 LacB活性的影响：分别采用不同 pH值的缓冲液配制底物和稀释酶液，按 1.4方
法测定漆酶活性。
1.9.9 pH对漆酶 LacB稳定性的影响：将酶液放于不同的 pH的缓冲液内于 4℃保存 24h,再用 1.4
方法测定其漆酶活性。
1.9.10 金属离子对漆酶 LacB 活性的影响：在酶的反应液中加入不同的金属离子，使其终浓度为
5mmol/L，然后按 1.4方法测定其酶活力。
1.9.11 LacB对 RB亮兰染料的降解 (Vyas & Molitoris, 1995)：在染料溶液中加入不同活性浓度的纯
化酶液，使溶液的染料浓度为 0.3g/L，作用 24h后，用 Beckman DU600 在染料的最大吸收波长
（595nm）处测吸光度，得到吸光度为A1；用同样的方法在染料溶液中加入等量的100℃灭活 10min
的酶液作对照，测得其吸光度为 A0,则酶对染料的脱色率为 r%= (A0-A1) / A0×100%
1.9.12 漆酶 LacB作用专一性的测定：1mL 反应体系中含有 0.8mL 醋酸缓冲液（pH5.0），0.1mL
纯化的 LacB (50µg/mL)和 0.1mL10种不同的底物，在底物的最大吸收峰测量其反应速度，判断其
能否被 LacB氧化，然后再根据各个底物的摩尔消光系数计算酶活力。
2 结果和分析
2.1毛木耳漆酶同工酶电泳
收集培养至 12d菌龄的液体培养液，于 4℃ 10000g 离心 30min后取其上清液即粗酶液，将
其进行 PAGE电泳，再用漆酶同工酶染色法获得其漆酶同工酶谱带，如图 1所示。
从图中可发现有三条绿色谱带，从而可推测毛木耳 AP菌株至少含有三种漆酶同工酶，因为
不能排除还有其它漆酶同工酶因表达量较少而用该染色方法不能显现出来。
2.2 漆酶分子量的测定
将粗酶液经过 80％饱和度的硫酸铵分级沉淀后，将蛋白样品进行Native SDS-PAGE电泳，与
标准蛋白的分子量相比获得三种漆酶的分子量大小分别约为 LacA (110kD)；LacB (84kD)；LacC
(65kD)。如图 2所示。

2.3 漆酶的纯化
将粗酶液经过 80％饱和度的硫酸铵分级沉淀后，再经过 DEAE-Sepharose fast flow阴离子柱
图 1 AP4漆酶同工酶 PAGE电泳
Fig. 1 PAGE of AP4 laccase isoenzymes
图 2 漆酶的 Native-SDS-PAGE 电泳
Fig. 2 Native-SDS-PAGE of Laccase
64 菌 物 学 报 24卷
层析，绝大部分杂质已被除去，整个分离结果见表 1。图 3DEAE-Sepharose fast flow的洗脱曲线，
从图中可看出：在 280nm处有两个主吸收峰，即峰 I和峰 II。然后用 ABTS作底物用 1.3方法检
测漆酶活性，发现两者都具有很高的漆酶活性。 图 4 是纯化后的漆酶蛋白组份用 SDS-PAGE电
泳对其纯度的检测电泳结果，结果表明组份 I已是单一组份了，而组份 II是由两种蛋白组成，还
需继续纯化。将图 4和图 2的结果比较我们不难发现，组份 I是毛木耳漆酶同工酶中的 LacB，而
组份 II则是由两种漆酶同工酶 (LacA和 LacC) 组成。
表 1 漆酶分离纯化结果
Table1 The result of Purified LacB
纯化步骤
Purification process
体积 (mL)
Volume
总蛋白
(mg)
Protein
总酶活 (IU)
Total activity
比活 (IU/mg)
Specific activity
得率 (%)
Recovery yield
提纯倍数
Purification
fold
Crude extract 2000 80 389.2 4.87 100 1
(NH4)2SO4沉淀 20 28.6 291.9 10.2 75 2.1
DEAE-sephrase fast flow
I (LacB)
II(LacA+La cC)

35
150

0.17
15.1

5.06
77.8

29.7
77.4

1.3
20

6.1
15.9

图 3 漆酶的 DEAE-Sephrase fast flow 柱层析
Fig. 3 Chromatography of laccase on
DEAE-Sephrase fast flow
图 4 组份 I和 II的 SDS-PAGE 和组份 I
的 Native PAGE
Fig. 4 SDS-PAGE of I and II ;Native PAGE of I

2.4 动力学 Km值测定
我们采用 ABTS 作为漆酶反应底物， 在 30℃、pH为 3.0的条件下取不同浓度的 ABTS，测
定其反应速度（υ），得到 1/υ与 1/[S]的关系曲线见图 5，从而得到漆酶 LacB对 ABTS的 Km为
6.64×10－5mmol/L。
2.5 温度对 LacB酶活力的影响
在不同温度下测定 LacB的酶活力，结果见图 6所示。由图 6可见 LacB的最适温度为 30℃,
在 25℃~60℃范围内均显示较高的酶活，大于 60℃时，酶活力下降很快。
2.6 温度对 LacB漆酶稳定性的影响
由图 7可看出当在 25℃保温 120min后其残余酶活还有 60%左右,而当温度提高到 30℃保温
1期 杨建明等：毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究杨建明 65
120min后其残余酶活只有 24.4%,当温度为 40℃时,105min后 LacB完全失活；从图 8不难发
现：LacB在 25℃条件下其酶活下降较慢，而随着温度的升高，其酶活下降速度加快，当温度升
至 50度时其在 15min后就检测不到该酶的活性（结果未显示），表明该酶对温度的变化极其敏感，
是属于对热敏感型的漆酶。


2.7 pH对 LacB漆酶活性的影响
由图 9可知，漆酶 LacB的最适 pH为 3.0， LacB在 pH2.2时基本失活，在 pH2.6-4.0范围内，
相对酶活在 60％以上，pH高于 5.0时 LacB相对酶活很低。
2.8 pH对 LacB漆酶稳定性的影响
图 10结果表明，漆酶 LacB在 pH3.6以上比较稳定，残余酶活保持在 60％以上，尤其当 pH
为 6.0时,残余酶活 85％以上；而在 3.6以下酶活损失较大，由此表明 LacB不是耐酸性酶。

0
10
20
30
40
50
60
70
25 30 35 40
T/℃
相
对
剩
余
酶
活
R
e
l
a
t
i
v
e

a
c
t
i
v
i
t
y
(
%
)
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
-10 0 10 20
1/S
1
/
V
图 5漆酶 LacB的动力学曲线
Fig. 5 The curve of Linewear-Burk of LacB
图 7 漆酶 LacB 热稳定性的动态曲线
Fig. 7 Dynamic curve of temperature stability of LacB
0
20
40
60
80
100
120
0 15 30 45 60 75 90105120
t/min
相
对
剩
余
酶
活
R
e
l
a
t
i
v
e

r
e
s
i
d
u
a
l
a
c
t
i
v
i
t
y
(
%
) 25度
30度
35度
40度
图 6温度对漆酶 LacB活性的影响
Fig. 6 Effect of temperature on LacB activity
图 8 漆酶 LacB 的热稳定性
Fig. 8 Temperature stability of LacB
0
20
40
60
80
100
120
152530404550556065708090
T/℃
相
对
剩
余
酶
活
R
e
l
a
t
i
v
e

r
e
s
i
d
u
a
l
a
c
t
i
v
i
t
y
(
%
)
66 菌 物 学 报 24卷
2.9 金属离子对酶活力的影响
结果见表 2，多种金属离子对漆酶 LacB都有一定的影响，其中Ca2+,Mg2+,Zn2+,Na2+,Ag2+对漆
酶 LacB有明显的激活作用；Mn2+有一定激活作用；Cu2+,K2+无明显影响；Co2+, Hg2+, Fe3+, Fe2+,Ba2+
有很强的抑制作用。
图 9 pH对漆酶 LacB活性的影响
Fig. 9 Effect of pH on LacB
图 10 漆酶 LacB的 pH稳定性
Fig. 10 pH stability of LacB
2.10 LacB对 RB亮兰染料的降解
用纯化的不同活性的 LacB对工业染料 RB亮兰做脱色试验 结果见表 3，从表中我们可以发
现随着 LacB活性的增加，对染料 RB亮兰的脱色率也在增加，用 ABTS做底物，在 420nm处测
量 LacB的活性，当活性达到 2.08IU时，LacB对染料RB亮兰的脱色率达到 77.4％，表现了很好
的脱色效果。
2.11 酶作用专一性的测定：由表4结果可知,LacB像其它漆酶一样具有底物专一性不强的特点, 它
可氧化传统的漆酶底物，如:ABTS，Syringaldazine 和 2,6-二甲氧基酚 (2,6-DMP)，愈创木酚
(Guaiacol),邻苯二酚(Catechol)，且 ABTS为 LacB的最适底物。然而奇怪的是 LacB不能氧化酪氨
酸和β- (3,4-dihydroxyphenyl)alanine (DOPA)，它们是酪氨酸酶和多酚氧化酶的标准底物。
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 5 6 7
pH
相
对
剩
余
酶
活
R
el
at
iv
e
re
si
du
al
a
ct
iv
ity
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
2.2.42.62.83 3.23.43.63.84 5 6 7
pH
相
对
酶
活
R
e
l
a
t
i
v
e

a
c
t
i
v
i
t
y
(
%
)
1期 杨建明等：毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究杨建明 67
表 2 金属离子对漆酶 LacB的影响
Table2 Effect of metal ions on laccase activity
Metal
ions(5mmol/L)
Relative
activity(%)
Metal
ions(5mmol/L)
Relative
activity(%)
Metal
ions(5mmol/L)
Relative
activity(%)
Control 100 Mg2+ 160.5 K2+ 97.6
Mn2+ 106.2 Ca2+ 178.2 Co2+ 60.2
Na2+ 140.6 Ag2+ 158.2 Hg2+ 30.2
Zn2+ 169.9 Cu2+ 95.2 Fe3+ 14
Fe2+ 2.8 Ba2+ 40.2
表 3 不同活性的 LacB 对 RB亮兰降解的结果
Table3 Results of RB brilliant blue decolorized by LacB
LacB activity(IU) 脱色率（％）
0.026 2.1
0.13 9.9
0.26 22.1
0.52 40.2
1.04 74.2
2.08 77.4
表 4 LacB的底物专一性
Table4 Substrate specificity of LacB
Substrate Concentration
(mmol/L)
maxa (M-1cm-1) Wave length
(nm)
Colour
Developmentb
Activity(IU/L)
ABTS 5.0 36,000 420 green 173.2
Guaiacol 5.0 14,800 477 yellow 80.6
Catechol 5.0 2,211 450 brown 23.2
Tyrosine 2.5 - 480 N.D.c －
Ferulic acid 5.0 12,483 287 N.D.c 70.6
Syringaldazine 0.5 6,5000 525 red 15.4
L-DOPA 5.0 - 460 N.D.c －
2,6-DMP 2.5 35,645 470 yellow 34.3
2,4-DMP 2.5 35,645 470 yellow 45.7
2,3-DMP 2.5 35,645 470 yellow 51.2
a: Molar extinction coefficients were obtained from the literature (Munoz et al. 1997; Xu, 1996)
b: Colour development based on visual evaluation;c:N.D.:Not detected.

3 讨论
漆酶是一类很有应用价值潜力的氧化酶,在木质素降解过程中起到关键的作用（Galliano et al,
1998），利用漆酶进行生物漂白能有效的降低传统方法在制浆过程中给环境造成的污染
68 菌 物 学 报 24卷
(PoppiusLevlin et al. 1997)，由于白腐菌产生的漆酶有宽的底物特异性,能催化许多芳香类化合物的氧
化,因此在一些芳烃类化合物的降解中也有很好的应用价值.许多文献都已报道了对不同来源漆酶
的分离纯化及性质的研究（Motoda-Setsushi, 1999; Kahraman & Gurdal, 2002）。大多漆酶的分离手段和
传统的酶分离方法并无太多差异，一般多是经过超滤、硫酸铵分级沉淀、离子交换柱和凝胶柱，
最后经 SDS-PAGE鉴定其纯度。本文利用硫酸铵分级沉淀和离子交换柱获得了一个电泳级纯度的
漆酶 LacB,并对它的酶学性质作了研究。
本文在测量毛木耳漆酶分子量的实验中未使用常规的方法：即先通过各种分离纯化的方法获
得单一的电泳级条带,再用 SDS-PAGE 测量其分子量，而却是在未得到纯化蛋白的情况下采用了
Native SDS-PAGE方法获得毛木耳三种漆酶同工酶的分子量。该方法是将同工酶染色方法与测量
蛋白分子量方法结合起来。来源于真菌的漆酶大都是糖基化的单亚基酶，分子量一般在 50~110kD
（Christopher, 1994）。它们可特异性地氧化底物 ABTS而生成绿色产物,从而条带很容易被分辨出。
通过比较毛木耳漆酶的PAGE（图 1）和 Native SDS-PAGE（图 2）我们不难发现毛木耳漆酶也是
由单亚基组成的酶。当将 Native SDS-PAGE（图 2）与 SDS-PAGE（图 4）联系起来分析时，我们
发现两图中的三种漆酶同工酶蛋白谱带所在的位置一致，这也证明我们采用的Native SDS-PAGE
电泳测量漆酶同工酶分子量的方法的正确性和可行性。然而如果需要单一漆酶的酶学性质进行深
入的研究，我们就必须还要通过使用各种分离蛋白的方法来纯化蛋白获得单一漆酶组份。
本文利用硫酸铵分级沉淀和离子交换柱方法纯化漆酶蛋白时获得了两个组分，一个组分是由
LacA和 LacC组成，另一个是单一漆酶蛋白 LacB.其中 LacA和 LacC未分开的原因可能是因为它
们的等电点非常接近。我们对获得的单一电泳级纯度的漆酶 LacB 作了酶学方面的研究。发现其
酶学性质与已报道的漆酶性质差异较大。在酶的最适反应温度和耐热性方面，大多数漆酶的最适
反应温度在 50℃左右.耐热性方面,虽然不同文献采用的衡量方法不一样，，但大多数漆酶保温时间
50-100min的 t1/2在 60-80℃之间（Fukushima, Kirk, 1995; Eggert,et al., 1996）。本文中 LacB的最适反
应温度为 30℃，比文献值低了 20℃。其耐热性与文献值相比也差了很多，当在 25℃保温 120min
后其残余酶活还有 60%左右，而当温度提高到 30℃保温 120min后其残余酶活只有 24.4%,当温度
为 40℃时，105minLacB完全失活，,表明该酶对温度的变化非常敏感。酶的最适反应温度和耐热
性,是酶的重要特性之一，它的不同表明其可能是一个不同于其它已知漆酶的特殊类型。
80年代以来，人们对漆酶底物的专一性进行了大量的研究，取得了一定的进展.初步估计，漆
酶催化氧化不同类型的底物已达 250多个（Ji & Hu, 1997）。人们对于漆酶催化底物氧化反应的化
学机理研究得较清楚,但是对于底物专一性不高的机理性研究还未见报道.本文获得的漆酶LacB也
像其它漆酶一样具有底物专一性不强的特点,它可氧化传统的漆酶低物,然而奇怪的LacB不能氧化
酪氨酸和β- (3, 4-dihydroxyphenyl) alanine (DOPA)，它们是酪氨酸酶和多酚氧化酶的标准底物。
许多文献曾报道了许多白腐菌及其产生的漆酶对染料的脱色作用 (Kapdan et al., 2000; Reyes
et al.,1999).在本实验中发现，漆酶 LacB对染料 RB亮兰（Remazol brilliant blue R）有很好的脱色
作用，RB 亮兰是一种很重要的工业染料，也经常用作许多染料合成的前体物质 (Abadulla et al.,
2000)，由于 RB 亮兰的多环结构具有一定的代表性，再加上其性质相对稳定，因此，漆酶对 RB
亮兰有很好的脱色效果可以将其应用于染料的脱色研究提供很好的依据。
我们从木耳属的 27个菌株中筛选到一漆酶高产菌株毛木耳 AP4,对 AP4产生的漆酶进行了分
离纯化，并且就获得的单一组分漆酶 LacB 的酶学性质进行了初步研究，这为以后克隆此酶的基
因或其应用奠定了理论基础。

1期 杨建明等：毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究杨建明 69
[REFERENCES]
Abadulla E, Tzanov T, Costa S, Robra KH, Cavaco-Paulo A, Gubitz GM , 2000. Decolorization and detoxification of textile dyes with a
laccase from Trametes hirsua. Appl Environ Microbiol, 66: 3357~3362
Alexandre G, Zhulin IB, 2000. Laccase are widespread in bacteria . Trends Biochem Sc, 18: 41~84
Bourbonnais R, Paice MG, 1992. Demethylation and delignificaion of kraft pulp by Trametes versicolor in the presence of
2,2’-azinobis(3-ethylbenthiazoline-6-sulfonate). Appl Environ microbiol, 36: 823~827
Chen SC, Ma DB, Buswell JA, 2003. Induction of laccase activity in the edible straw mushroom Volvariella volvacea. FEMS Microbiology
Letters, 218: 143~148
Christopher F, 1994. The structure and function of fungal laccase. Microbiology, 140 (1): 19
Edens WA, Goins TQ, Dooley D, Henson JM ,1999. Purification and characterization of a secreted laccase of Gaeumannomyces graminis var.
tritici. Appl Environ Microbiol, 65 (7): 3701~3704
Eggert C, TempU, Eriksson KE, 1996. The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and
characterization of the laccase. Appl Environ Microbiol, 62 (4): 1151~1158
Eggert C, Temp U, Eriksson KE, 1997. Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus. FEBS
Letters, 407: 89~92
Fukushima Y, Kirk TK, 1995. Laccase component of the Ceriporiopsis subvermispora lignin-degrading system. Appl Environ Microbiol,
61 (3): 872~876
Galliano H, Gas G ,Seris L, Cabanes J, 1998. Lignin degradation by Rigidoporus lignesus involves synergistic action of two oxidizing
enzyme:Mn peroxidase and laccase Enzyme Microb Technol, 13: 478~482
Givaudan A, Effosse A, Faure D, 1993. Polyphenol oxidase from Azospirillum lipoferum isolated from the rhizosphere: evidence for a laccase
in non-motile strains of Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiol Let, 108: 205~210
Guo RJ, 1999. Experimental techniques of protein electrophoresis. Beijing: Science Press, 175~181 (in Chinese)
Ji LC, Hu PZ, 1997. Research advance of oxidation of laccase. Industry and chemistry of Forest product, 17 (1): 79~84 (in Chinese)
Kahraman SS, Gurdal IH, 2002. Effect of synthetic and natural culture media on laccase production by white rot fungi. Bioresource
Technology , 82 (3): 215~217
Kapdan lK, McMillan G, Marchant R, 2000. Biological decolorization of textile dyestuff by Coriolus versicolor in a packed column reactor.
Environal Technol, 21: 231~236
Majcherczyk A, Johannes C, Huttermann A, 1998. Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) by laccase of Trametes versicolor.
Enz Micro Tech, 22: 335~341
Motoda-Setsushi, 1999. Purification and characterization of polyphenol oxidase from Trametes sp. MS39401. Journal of Bioscience and
Bioengineering, 87 (2): 137~143
Munoz C, Guillen F, Martinez AT, Martinez MJ, 1997. Induction and characterization of laccase in the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii.
Curr Microbiol, 34: 1~5
Nyanhongo GS, Gomes J, Gubitz GM, Zvauya R, Read J, Steiner W, 2002. Decolorization of textile dyes by laccase from a newly isolated
strain of Trametes modesta. Wat Res, 36: 1449~1456
Pickard MA, Roman R, Tinoco R, Vazquez-Duhalt R, 1999. Polycyclic aromatic hydrocarbons metabolism by white rot fungi and oxidation
by Coriolopsis gallica UAMH8260 laccase. Appl Environ Microbiol, 65: 3805~3809
PoppiusLevlin K,Wang W, Ranua M, Inoue H, 1997. Biobleaching of chemical pulps by laccase/mediator systems. Biological Sciences
Symposium, 1327~1335
Reyes P, Pickard M A, Vazqnez-Duhalt R, 1999. Hydroxybenzotriazole increase the range of textiles dyes by immobilized laccase. Biotechnol
70 菌 物 学 报 24卷
Lett, 21: 875~880
Srebotnik E, Hammel KE, 2000. Degradation of nonphenolic lignin by the laccase/1-hydroxybenzotriazole system. J Biotech, 81: 179~188
Thurston CF, 1994. The structure and function of fungal laccase. Microbiology, 140: 19~26
Vyas BRM, Molitoris HP, 1995. Involvement of an extracellular H2O2-dependent ligninolytic activity of the white rot fungus Pleurotus
ostreatus in decolorization of remazol brilliant blue R. Appl Environ Microbiol, 61: 3919 ~3927
Wong YX, Yu J, 1999. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes. Wat Res, 33: 3512~3520
Xu F, 1996. Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as
halide inhibition. Biochemistry, 35: 7608~7614
Zhang M, Xiao YZ, Gong WM, 2003. Structure and function of fungi laccase. The Journal of Biology, 20 (5): 6~8 (in Chinese)
[附中文参考文献]
郭尧君，1999. 蛋白质电泳实验技术. 北京:科学出版社. 175~181.
季立才，胡培植，1997. 漆酶氧化反应研究进展. 林产化学与工业，17 (1): 79~84
张敏，肖亚中，龚为民，2003. 真菌漆酶的结构与功能. 生物学杂志，20 (5): 6~8

PURIFICATION AND PROPERTIES OF LACCASE PRODUCED
BY AURICULARIA POLYTRICHA
YANG Jian-Ming1, 2 ZHANG Xiao-Min2 XING Zeng-Tao3 CHENG Ming-Jie2
CAO Hui2* TAN Qi2 PAN Ying-Jie2
(1College of Life Sciences, Nan Jing Agricultural University, Nan jing 210095; 2Key Laboratory of Edible Fungus Genetic and
Breeding, Ministry of Agriculture , The People’s Republic of China; Key Laboratory of Agriculture Genetics and Breeding of
Shanghai; Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai201106; 4Anhui Technical Normal College,
Feng Yang 233100)
ABSTRACT: The result of PAGE for laccase crude extract showed that three kinds of isoenzymes exist in the
Auricularia polytricha AP4. The molecular weight of the three isoenzymes was determined by Native SDS-PAGE :
LacA (110kD), LacB (84kD), LacC (65kD). The LacB was purified from AP4 by ammonium sulphate fractionation,
DEAE sephrase fast flow chromatography.The optimum pH and temperature for LacB activity were 4.0℃
and 30℃, respectively. The LacB catalyzed the oxidation of ABTS with a Michaelis constant of 6.64×
10-5mol/L.Various metal ions showed different effects on the LacB activity. The activity was enhanced by Ca2+, Mg2+,
Zn2+, Na2+, Ag2+ , and was strongly inhibited by Co2+,Hg2+,Fe3+,Fe2+,Ba2+. LacB also is able to decolorize remazol
brilliant blue R efficiently.
KEY WORDS: Isoenzymes, laccase crude extract, enzymatic properties

* Corresponding author