全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 March 2010, 29(2): 178-184

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2010 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：浙江省自然科学基金（No. Y306107）；浙江省科技计划重点项目（No. 2004C22003）
*Corresponding author. E-mail: zhye@cjlu.edu.cn
收稿日期: 2009-03-12, 接受日期: 2009-07-13

菰黑粉菌的分离鉴定及其发酵液中植物激素的检测
尤文雨 邹克琴 俞晓平 刘倩 安欣欣 赵煦泓 叶子弘*
中国计量学院生命科学学院 杭州 310018



摘 要：在显微镜下观察孢子形态，并观察单菌落的形态和菌株的微观形态，PCR 扩增其 ITS-5.8S rDNA 序列，测序并在
NCBI 中进行同源比较，确定其种属。液体培养该菌株，通过高效液相色谱法检测发酵液中植物激素。结果表明：用菌落形
态与孢子形态鉴定和分子生物学鉴定的方法，对茭白中分离的一个菌株鉴定为菰黑粉菌，且在其发酵液中检测到植物激素
IAA、ABA 和 GA3，其中 IAA 含量为 0.1306mg/L，ABA 含量为 0.01367mg/L。
关键词：菰黑粉菌，形态，分子鉴定，HPLC

Isolation and identification of Ustilago esculenta and detection
of plant hormones in the fermentation broth
YOU Wen-Yu ZOU Ke-Qin YU Xiao-Ping LIU Qian AN Xin-Xin ZHAO Xu-Hong YE Zi-Hong*
College of Life Science, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China
Abstract: The morphology of spores and colonies were observed and the ITS-5.8S rDNA squences of the strains were cloned,
sequenced and analyzed by using BLAST. The strain was cultured in liquid culture and plant hormones were detected by high
performance liquid chromatography (HPLC). The result showed that the isolated strain was Ustilago esculenta, and indole acetic acid
(IAA), abscisic acid (ABA), and gibberellic acid3 (GA3) were detected in the fermentation broth, and the contents of IAA is
0.1306mg/L, ABA is 0.01367mg/L.
Key words: Ustilago esculenta, morphology, molecular identification, HPLC


菰黑粉菌 Ustilago esculenta P. Hennings 为黑粉
菌纲黑粉菌科黑粉菌属真菌。在自然界中菰黑粉菌与
茭白Zizania latifolia (Griseb.) 共生，属于其内生真菌，
它主要分布在茭白茎中。菰黑粉菌在中国、日本、越
南、印度、俄罗斯、美国均有分布（郭林 2000）。
菰黑粉菌生活在茭白茎中，抑制茭白开花结
实，刺激茭白茎部膨大（Terrell & Batra 1982）。茭
白膨大的茎部可供食用，它在中国南、北方以及台
DOI:10.13346/j.mycosystema.2010.02.020
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湾省都有种植，在太湖一带的浙江和江苏有大量栽
种（Guo et al. 2007）。Hennings（1895）发现菰黑
粉菌后，它开始进入离体环境下人工培养。Chan &
Thrower（1980a）在菰黑粉菌人工培养条件上做了
大量研究，摸索出一系列适合菰黑粉菌生长的环境
如生长温度、pH、C/N 等。Chung & Tzeng（2004a）
还发现在最适环境下生长，7d 菰黑粉菌生长量达到
最大。菰黑粉菌在一些茭白茎中能够形成黑色的厚
垣孢子堆，在一些茭白茎中，肉眼无法观察到。对
于肉眼无法观察到的菰黑粉菌的确认以及厚垣孢
子萌发后菌株的确认，形态学鉴定有其局限性，分
子鉴定弥补了形态学鉴定的缺陷，是当前微生物鉴
定更有力的手段。
在许多植物与病原微生物相互作用中，病原真
菌能产生激素，导致植物组织膨大（Chung & Tzeng
2004b）。与菰黑粉菌同属的玉米黑粉菌能够刺激玉
米形成膨大的玉米瘤，且研究发现玉米黑粉菌能够
分泌植物激素（Guevara et al. 2000）。在茭白与菰黑
粉菌的互作中，茭白茎部膨大原因分子机理还不确
定。菰黑粉菌是否在茭白组织中也分泌植物激素，
参与刺激茭白茎部膨大，目前也不能肯定。但在菰
黑粉菌的体外培养中，Chung & Tzeng（2004b）发
现它能够分泌生长素 IAA，但菰黑粉菌是否还可以
分泌其他植物激素，关于菰黑粉菌植物激素分泌情
况的研究报道不多。
本研究结合形态鉴定和分子鉴定对分离自茭
白中的菰黑粉菌菌株进行鉴定。在菰黑粉菌鉴定确
认后，探寻其液体培养下激素分泌情况，为茭白与
菰黑粉菌互作机制的研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
浙茭 2 号灰茭，于 2007 年 11 月采自浙江省农
业科学院，采摘后置于-70℃保存。
1.2 试剂和菌株
Taq 酶、dNTP 均购自博日科技有限公司；
pMD18-T Vector 购自大连宝生物公司；琼脂糖凝胶
DNA 回收试剂盒、大肠杆菌 Escherichia coli DH5α
均购自天根生化科技有限公司；IAA、GA3、ABA
均购自 Sigma 公司；甲醇（色谱纯），购自天津四
友公司。
1.3 仪器
LEICAI DMI4000B 荧光倒置显微镜，PCR 扩
增仪、电泳仪，Bio-Rad 公司；高效液相色谱系统：
210 型泵，410 型自动进样器，335 型二极管阵列检
测器，Prostar 6.3 色谱工作站，美国 Varian 公司。
1.4 方法
1.4.1 菰黑粉菌的分离和培养：将浙茭 2 号灰茭用蒸
馏水洗净，晾干，再用 75%酒精擦拭表面，待酒精挥
发干后，用无菌小刀横向切开，用接种环挑取黑色的
冬孢子于 1mL 无菌水中，混匀，取 50µL 涂布于 PDA
固体培养基中，28℃培养。并不断纯化至单菌落。
1.4.2 菰黑粉菌的形态鉴定：挑取少量黑色孢子溶
于无菌水中，取 10µL 在显微镜下观察孢子形态。
待 PDA 固体培养基中长出单菌落后，肉眼观察菌
落形态，同时用牙签沾取单菌落置于无菌水中，取
10µL 菌液显微镜下观察。
菰黑粉菌 ITS-5.8S rDNA 分子鉴定：挑取单菌
落接种于 PDA 液体培养基中，在摇床中，130r/min、
28℃恒温震荡培养。第 7 天取培养液 20mL，
8,000r/min 室温离心 2min，取菌体，参照杨艳秋等
（2007）CTAB 法提取菌株基因组 DNA。应用真菌
通用引物 ITS1 和 ITS4 扩增其 ITS1、5.8S rDNA 及
ITS2。上游引物 ITS1 序列为：5′-TCCGTAGGTGA
ACCTGCGG-3′，下游引物 ITS4 序列为：5′-TCC
TCCGCTTATTGATATGC-3′，引物由上海生工生物
技术有限公司合成。PCR 反应体系为：10×PCR
Buffer 5µL，dNTP Mixture 4µL，Primer ITS1 1µL，
Primer ITS4 1µL，DNA template 1µL，Taq 酶 1µL，
加 ddH2O 至 50µL。PCR 反应条件为 94℃ 5min，
94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，30 个循环，72℃
延伸 10min。用无菌水代替模板做阴性对照。反应
结束后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，并
回收目的条带。回收按琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂
盒说明进行。回收产物连接到 pMD18-T Vector，然
后转化到大肠杆菌 DH5α，37℃培养 12h 后挑取单
菌落进行菌落 PCR 鉴定，对鉴定为阳性的单菌落进
行 LB 液体培养基培养，12h 后按 OMEGA Plasmid
mini Kit 说明书提取大肠杆菌质粒，然后用 KpnⅠ
和 SptⅠ进行双酶切鉴定。将鉴定为阳性的菌株送
上海英骏生物技术有限公司进行序列测序。测序结
果在 NCBI 数据库中 BLAST，进行同源性比较。
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1.4.3 菰黑粉菌发酵培养：将鉴定为菰黑粉菌的菌
株接种到 PDA 液体培养基中，130r/min、28℃恒
温震荡培养。培养 5－7d，菰黑粉菌达到对数生长
期（林源吉等 2006），检测发酵液体中植物激素的
含量。
1.4.4 样品前处理及色谱条件的确定：收集发酵液
1.35L，4℃、5,000×g，离心 3min；取上清，用 HAc
调 pH 至 2.5；加入等体积乙酸乙酯震荡萃取 15min；
取乙酸乙酯相，40℃减压蒸干；用甲醇冲洗蒸发瓶，
收集甲醇，定容至 10mL。参照卢颖林等（2007）
的方法，本研究色谱条件确定为：温度 25℃；流动
相为甲醇：0.6%乙酸（45:55，V/V）；流速 0.6mL/min；
紫外检测波长 254nm，进样量 10µL。色谱柱为大
连依利特分析仪器有限公司 Hypersil C18 色谱分析
柱（250mm×4.6mm ID，25.0µm）。
1.4.5 标准曲线的建立：准确配制赤霉素 6.04mg/mL，
生长素 1.47mg/mL 和 0.84mg/mL 的标准溶液。取上
述溶液，配制成不同浓度混和标准液，经 0.45µm
微孔滤膜过滤，用峰面积（纵坐标）与浓度（横坐
标）进行线性回归。
1.4.6 系统稳定性分析及样品检测：将稀释 100 倍
的标准样品进行 5 次注射，计算保留时间和相应峰
面积的 RSD。取 10µL 样品注入高效液相中，进行
分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的鉴定
2.1.1 孢子形态及菌株生长特征鉴定：显微镜下孢
子为圆形或近球形，黑色或褐色。孢子单个存在，
直径大小在 5－10µm（图 1-A，B）。在 PDA 固体
培养基中培养 3d 后，菌株形成单菌落，背面和正面
均为白色，大小 1－3mm，与酵母有些相似。培养 7
－10d 后，单菌落逐渐变大，形状为不规则圆形，边
缘不完整，波状，中间隆起或有脊状突起，单菌落
颜色由白色逐渐变黄，且随培养时间的延长而加深
（图 1-C）。培养 15－20d 后单菌落边缘长出白色菌
丝。挑取生长 7d 的单菌落，在显微镜下观察，能看
到单个的两端尖锐中间分隔的梭状短菌丝（担孢
子），大小为 30－200µm（图 1-D）。参考《中国真
菌志第十二卷黑粉菌科》和有关文献（韩秀芹等
2004；周礼红和梁宗琦 2007），初步鉴定该菌为菰
黑粉菌。
2.1.2 菌落的 ITS-5.8S rDNA 鉴定结果：菌株利用
真菌通用引物 ITS1、ITS4 扩增得到的 PCR 产物大
小在 750bp 左右（图 2-A）。PCR 产物经回收，并克
隆到 pMD18-T Vector。转化后，菌落 PCR 阳性菌株
（图 2-B）经 Kpn 和 PstⅠ双酶切鉴定为阳性后（图
2-C），送上海英骏生物技术有限公司测序，产物大
小为 775bp，提交至GenBank获得Accession number
为 FJ527029。测定的序列在 NCBI 上进行 BLAST
同源序列比对，菌株 Z2 ITS-5.8S rDNA 序列与
Ustilago esculenta 的具有 99%的同源性。可以确定
菌株Z2为Ustilago esculenta或类Ustilago esculenta
的一种。利用 MEGA4.0 软件对 Ustilago esculenta
同属不同种的 14 种菌株进行进化树分析（图 3），
结果表明，菌株 Z2 的序列同源性与 Ustilago
esculenta（AY345002.1，AB211928.1）最为接近。
结合菌株形态，鉴定此菌为 Ustilago esculenta。
2.2 激素混标的分离与分析
按一定的比例将 3 组分配制成适当浓度的混
标，按 1.4.4 的色谱条件进样分析，三种激素得到
较好的分离（图 4）。其保留时间分别为：GA3 保留
时间 7.167min；IAA 保留时间 12.738min；ABA 保
留时间 20.126min。

图 1（A,B）厚垣孢子（400×）；（C）菌株单菌落；（D）菌株的短菌丝(400×)
Fig. 1 (A, B) Chlamydospore (400×); (C) Single colonies; (D) Short mycelium (400×).
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图 2（A）ITS-5.8S rDNA 的 PCR 扩增；（B）重组菌落 PCR 鉴定；（C）重组质粒酶切鉴定
A 中 7 为阴性对照，其他为同一模板扩增结果，B、C 中 1、2、3、4 表示 4 个重复.
Fig. 2 (A) PCR product of ITS-5.8S rDNA; (B) PCR characterization of individual bacterial colonies; (C) Digest of the recombinant plasmid. A: 1-6:
6 times replication, 7: Negative control; B, C: 1-4: 4 times replication.

图 3 菌株 Z2 ITS-5.8S rDNA 序列的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of strain Z2 according to ITS-5.8S rDNA.


图 4 混标中赤霉素、生长素和脱落酸的分离与检测
Fig. 4 Gibberellic acid (GA3), indole acetic acid (IAA) and abscisic acid
(ABA) in mixed standard solution separated and detected on 254nm.
2.3 系统的稳定性分析
在相同的色谱条件下，对同一浓度的混标连续
进样 5 次，记录各组分的保留时间、峰面积值。分
别计算保留时间和峰面积的相对标准偏差（表 1），
各组分保留时间 RSD 均小于 1.0%，说明保留时间
比较稳定；峰面积 IAA、ABA 的 RSD 均小于 10%，
GA3 峰面积 RSD 大于 10%，故本研究选择 IAA，
ABA 定量研究，GA3 定性研究。
2.4 各组分标准曲线的建立
选择一系列不同浓度的标准样品注入 HPLC，
得到各个组分的标准曲线如表 2（其中 x 表示激素
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含量，y 表示 HPLC 峰面积），从而建立起已知激素
浓度与 HPLC 峰面积大小之间的函数关系。
2.5 样品植物激素的检测及分析
取发酵液 1,350mL 用 1.4.4 方法处理，取 10µL
检测，得到样品色谱图（图 5）。向样品加入标准样
品，在同样色谱条件下进行 HPLC 分析（图 6）。经
表 1 激素保留时间和峰面积的相对标准偏差
Table 1 Relative standard deviation of retention time and peak area
组分
Components
保留时间
Retention time RSD
峰面积
Peak area RSD
GA3 0.5151% >10%
IAA 0.8928% 5.3255%
ABA 0.7026% 2.9478%
Note: GA3: Gibberellic acid3; IAA: Indole acetic acid; ABA: Abscisic acid.
比较找到相应的激素响应峰，其峰面积增大，说明样
品中的激素和标准样品中的激素叠加出峰。通过
Prostar6.3 色谱工作站得到相应峰的峰面积。通过标
准曲线求得样品中激素含量。其中 IAA：0.1306mg/L；
ABA：0.01367mg/L。该研究同时也检测到植物激素
GA3，其定量研究还需要进一步进行。
表 2 激素标准曲线
Table 2 Standard curve of GA3, IAA and ABA
组分
Components
标准曲线
Calibration curves
相关系数
Correlation
coefficient
线形范围
Linear range
(mg/L)
IAA y=189861x－7751.1 0.9992 0.735－147
ABA y=699874x－20339 0.9999 0.42－84
Note: GA3: Gibberellic acid3; IAA: Indole acetic acid; ABA: Abscisic acid.

图 5 254nm 下样品提取液色谱图
Fig. 5 HPLC chromatogram of sample.

图 6 加标样后发酵液提取液在 254nm 下的色谱图
Fig. 6 HPLC chromatogram of sample with mixed standard hormones.
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3 讨论
菰黑粉菌分为两个类型的菌株，一类是能形成
黑色厚垣孢子的称为 T 型，一类是不能形成厚垣孢
子堆的，称为 M-T 型（Terrell & Batra 1982）。在实
际生产中，茭白组织中也存在有黑色厚垣孢子和肉
眼看不见厚垣孢子堆两种情况。能形成厚垣孢子堆
的菰黑粉菌容易分辨，但在菰黑粉菌未形成厚垣孢
子时或厚垣孢子萌发形成菌株后，则不容易从形态
上对其确认，对经验不足的研究者来说更为困难，
因此用分子生物学技术来鉴定菰黑粉菌是一个有
力的辅助鉴定的手段。在目前的分子鉴定中，
ITS-5.8S rDNA 鉴定是常用的方法。本研究在孢子、
菌落形态初步鉴定后运用 ITS-5.8S rDNA 进行鉴
定，成功扩增到菰黑粉菌的 ITS-5.8S rDNA 序列。
所得序列与 NCBI 上公布的 Yoshida 等所测的菰黑
粉菌 ITS 序列进行比对，发现菰黑粉菌的 ITS-5.8S
rDNA 序列除 AB211926.1 差异极大外，其他的几乎
相同，但在该序列的两个地方分别存在一个碱基的
不同，且可以将其分成两组。这两个差异能否说明
菰黑粉菌存在更详细的分类，还有待进一步研究。
在菰黑粉菌 Z2 的系统发育树中可以看出，Z2 与黑
粉菌属的其他种存在一定的遗传距离，因此这两个
碱基的差异不会影响 ITS-5.8S rDNA 分子鉴定。
植物内生真菌在宿主体内分泌促生长类物质，
促进植物生长（Chung & Tzeng 2004b）。茭白茎在
菰黑粉菌的刺激下膨大。江解增等（2005）发现茭
白茎部膨大过程中，其体内激素含量在变化，Chan
& Thrower（1980b）认为茭白茎部膨大是由于茭白
茎部生长素和细胞分裂素含量的增加。这些都说明
激素在茭白茎膨大过程中起着重要的作用，但这些
激素是茭白植株自身产生的还是菰黑粉菌产生的，
或是两者共同作用的结果，目前尚未确定。本研究
从茭白中分离出菰黑粉菌，检测其体外植物激素分
泌情况。研究中采用外标法对菰黑粉菌液体培养中
发酵液里植物激素进行检测，检测到发酵液中同时
存在 IAA、ABA 和 GA3。说明在体外培养的环境
中，菰黑粉菌能够分泌植物激素。本研究结论与
Chung & Tzeng（2004b）结论一致。那么菰黑粉菌
在茭白组织生长过程中是否也能分泌植物激素
IAA，这还有待进一步验证。研究还发现菰黑粉菌
体外能够分泌 ABA、GA3 等植物激素，在茭白组织
中它是否也能分泌，其参与的功能是什么等问题还
需深入研究。
目前对菰黑粉菌的研究停留在形态学和体外培
养层次，对菰黑粉菌更深层次的报道还很少。由于
茭白和菰黑粉菌的基础研究不足，对两者的互作机
制及茭白孕茭机理还认识不足，因此笔者认为要弄
清楚茭白和菰黑粉菌的互作机制有必要对两者分别
进行更深入的研究。在充分了解两者的情况下，再
进一步探寻更复杂的茭白与菰黑粉菌的互作机制。
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