全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１２（０３）：１１６～１１８
第一作者简介：冯健（１９７８－），男，博士，工程师，现主要从事林木分
子遗传及生物技术和土壤微生物研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｊｉａｎ－０２０５
＠１６３．ｃｏｍ。
基金项目：辽宁省科技支撑计划资助项目（２００７２０７００４）。
收稿日期：２０１１－１０－１２
基于ＩＧＳ序列的两株蜜环菌分子鉴定
冯 　 健，范 俊 岗，金 若 忠，陈 　 罡
（辽宁省林业科学研究院，辽宁 沈阳１００３２）
　　摘　要：以从猪苓［Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　ｕｍｂｅｌａｔｕｓ（Ｐｅｒｓ．）Ｆｒ．］菌核和榛蘑（Ａｒｍｉｌａｒｉｅｌａ　ｍｅｌｅａ）子实
体中分离得到菌株ｂｓ和ｚｍ为试材，通过对其ＩＧＳ区段进行分析并结合分离材料和培养菌丝的
形态特征确定其分类学地位。结果表明：菌核和子实体的生境及形态学特征初步鉴定为蜜环菌；
对２个菌株的分类学地位进行了分析确定，并利用引物５ＳＡ和ＣＮＬ１２扩增其ＩＧＳ区域，进行
ＢＬＡＳＴ比对分析，菌株ｂｓ和ｚｍ均为高炉蜜环菌，为辽宁省猪苓的伴生菌。
关键词：蜜环菌；ＰＣＲ；ｒＤＮＡ
中图分类号：Ｓ　９４９．３２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１２）０３－０１１６－０３
　　蜜环菌（Ａｒｍｉｌａｒｉａ）广泛分布于世界各地，可引起
多种针叶树及阔叶树根腐病，其寄主植物多达３００属，对
林业造成巨大的经济损失［１］。然而，蜜环菌又是一类具
有重要经济价值的高等真菌。一些中药制剂，如脑心
舒、银蜜片等，已广泛应用于临床治疗；同时也是名贵中
药天麻（Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｅｌａｔａ）和猪苓（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｕｍｂｅｌａｔａ）栽培
必备的共生菌［１－２］。
蜜环菌担子果形态变异大，基于形态学的蜜环菌属
的分类一直较为混乱，全世界有２５０多个种划归该属，同
时也有一些蜜环菌被划分到其它属种［２－３］。随着生物技
术的发展，分子生物学方法广泛应用于真菌系统学研究
和分类鉴定中。目前，在蜜环菌狭义种遗传多样性和分
子系统学研究中，应用较多的方法主要包括扩增ＩＧＳ
（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｐａｃｅｒ，基 因 间 隔 区）、ＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ，内转录间隔区）、限制性内切酶的酶
切、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，限
制性 片 段 多 态 性）和 ＲＡＭＳ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ，随机扩增微卫星）等［２］。该文以野生猪苓
菌核和榛蘑子实体为材料，从中分离得到２个菌株，通
过对其ＩＧＳ区段进行分析并结合分离材料和培养菌丝
的形态学特征确定其分类学地位。
１　材料与方法
１．１　试验材料
１．１．１　菌株　该试验待鉴定的菌株为辽宁省林业科学
院森林保护实验室自丹东市宽甸县红松林分离和筛选
得到。将菌核从野外带回，在无菌室内，用犀牛牌刀片
削去菌核表皮，挑选内部黄白色部分切割成豆粒大，用
无菌镊子夹住，放入含ＰＤＡ培养基的试管中即可完成
菌株的分离，待菌索长出，再行转管、纯化。另外，为准
确鉴定这２株菌株，从沈阳农业大学购得１株已经过鉴
定的蜜环菌。将分离自猪苓菌核的菌株命名为ｂｓ，分离
自榛蘑子实体的菌株命名为ｚｍ，从沈阳农业大学购得的
菌株命名为ｎｙｄｘ。
１．１．２　主要试剂及引物　ｒＤＮＡ－ＩＧＳ扩增所用试剂、
ＤＮＡ凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限
公司。ｒＤＮＡ－ＩＧＳ分析所用的引物５ＳＡ／ＣＮＬ１２由英潍
捷基（上海）贸易有限公司合成。其它试剂为国产分析
纯试剂。
１．２　试验方法
１．２．１　菌株形态观察　将保存菌株接种于ＰＤＡ培养
基斜面上，置于生化培养箱中２５℃培养７２ｈ，观察并记
录菌落特征和菌株形态特征。菌索２４ｈ定植，犹如小须
根，背光条件下，可见荧光。这２种菌不像香菇等在
ＰＤＡ培养基上可以长出白色菌丝构成菌落，只是在培养
基内部生长，后期部分菌索穿出培养基表面。菌索刚开
始时是白色，后期变褐色。
１．２．２　真菌基因组ＤＮＡ的提取及检查　采用ＣＴＡＢ
法［５］提取菌丝体基因组总ＤＮＡ，用１．２％的琼脂糖凝胶
电泳定性检测，再用紫外分光光度计定量检测。
１．２．３　ｒＤＮＡ－ＩＧＳ分析　采用引物５ＳＡ和ＣＮＬ１２扩增
其ｒＤＮＡ－ＩＧＳ片段。引物序列为５ＳＡ：５′－ＣＡＧＡＧＴＣ－
ＣＴＡＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＴ－３′，ＣＮＬ１２：５′－ＣＴＧＡＡＣＧＣＣＴＣＴＡ－
ＡＧＴＣＡＧ－３′。扩增体系为：１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ　２．５μＬ，
１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　２ μＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２２μＬ，
５Ｕ／μＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡ酶０．３μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ　５ＳＡ和ＣＮＬ１２
引物 各 １μＬ，５０ｎｇ／μＬ 模 板 ＤＮＡ　１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ
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北方园艺２０１２（０３）：１１６～１１８ ·生物技术·
１６．２μＬ，反应总体积为２５μＬ。扩增反应条件为：９４℃
预变性２ｍｉｎ后；９４℃变性４０ｓ，５８．９℃退火４０ｓ，７２℃延
伸１００ｓ，共３５个循环；最后于７２℃补平１０ｍｉｎ，终止温
度为４℃。扩增产物于１．５％琼脂糖凝胶中电泳检测。
１．２．４　ｒＤＮＡ－ＩＧＳ片段的回收、克隆和测序　采用ＤＮＡ
凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）从１．５％
的琼脂糖凝胶中回收ｒＤＮＡ－ＩＧＳ扩增片段。回收产物
用普洛麦格ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ连接，转化于大肠杆
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α菌株感受态细胞，经蓝白斑筛选和ＰＣＲ
鉴定后，每个样品均随机挑选３个阳性克隆交付上海生
工生物工程技术服务有限公司完成测序。
１．３　序列比较
将测得的序列用Ｂｌａｓｔｎ软件从ＧｅｎＢａｎｋ搜索到的相
关序列，用Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ软件进行比对后手工校正。
２　结果与分析
２．１　２株蜜环菌的分离与形态学鉴定
由图１可知，来自猪苓菌核分离的菌株，生长类似
密环菌菌索。来自榛蘑的菌株子实体肉质，菌盖幼时半
球形至钟形，成熟时圆形。菌柄上具有菌环，柄基部膨
大球形，菌柄上有绒毛状菌墓残留物。另外，将这２株
待鉴定菌株与购得的已鉴定为蜜环菌的菌株在固体培
养基上培养并定期进行观察，结果表明，这３个菌株生
长非常相似，具有蜜环菌典型的形态特征。根据上述观
察结果，初步鉴定，从猪苓菌核和榛蘑子实体中分离得
到的２株菌株为蜜环菌。
图１　ｂｓ和ｚｍ的菌索
Ｆｉｇ．１　Ｒｈｉｚｏｍｏｒｐｈ　ｏｆ　ｂｓ　ａｎｄ　ｚｍ
２．２　３株蜜环菌的分子鉴定
为进一步确定这２株蜜环菌的分类地位，采用分子
生物学方法对其进行鉴定。分别提取３株蜜环菌的
ＤＮＡ（ｓｂ、ｚｍ和ｎｙｄｘ），采用通用引物５ＳＡ和ＣＮＬ１２扩
增其ｒＤＮＡ－ＩＧＳ片段。将获得的扩增片段进行测序、序
列比对等生物信息学分析，结果表明，３株蜜环菌的同源
性为９８．３８％，ｓｂ和ｚｍ的同源性为９９．０７％，ｓｂ与ｎｙｄｘ
的同源性为９６．７５％，ｚｍ与ｎｙｄｘ的同源性为９７．１０％
（图２）。将３株蜜环菌测序结果在ＮＣＢＩ上进行Ｂｌａｓｔ分
析表 明，ｓｂ 和 ｚｍ 与 高 卢 蜜 环 菌 相 似 性 较 高
（ＥＵ６３６２４０．１），ｎｙｄｘ与黄小蜜环菌（ＡＦ４５１８０３）相似性
比较高。为构建这３株蜜环菌的系统进化树，从
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ数据库中下载其它蜜环菌
ｒＤＮＡ－ＩＧＳ序 列，包 括 高 卢 蜜 环 菌 （ＥＵ６３６２４０．１、
ＡＦ４５１８２９．１）、黄小蜜环菌（ＤＱ１１５５８１、ＡＦ４５１８０２．１、
ＡＦ４５１８０３）、芥 黄 蜜 环 菌 （ＡＹ５０９１６９）、Ａｒｍｉｌａｒｉａ
ｃａｌｖｅｓｃｅｎｓ（ＦＪ６２６８４９）、奥 氏 蜜 环 菌 （ＡＦ４５１８１５）、
Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｎａｂｓｎｏｎａ （ＡＹ５０９１７８）和 北 方 蜜 环 菌
（ＧＱ８４７５２０）。系统进化树构建结果表明，ｂｓ和ｚｍ与高
卢蜜环菌（ＥＵ６３６２４０．１、ＡＦ４５１８２９．１）亲缘关系较近，
ｎｙｄｘ与黄小蜜环菌（ＡＦ４５１８０３）亲缘关系较近（图３）。
这一结果与ＮＣＢＩ比对结果一致。
ｎｙｄｘ　ＴＴＧＧＴＧＴＣＧＣ　ＡＣＡＴＴＡＧＡＣＴ　ＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡ　ＴＡＧＡＧＣＴＴＴＧ　ＣＴＣＧＴＧＡＡＣＣ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＴＧ　ＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡ　ＡＡＣＧＣＴＴＧＧＡ　ＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－Ｇ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－Ｇ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＡＣＧＡＡＴＴＧＴＡ　ＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴ　ＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴ　ＧＡＡＴＣＣＴＴＴＧ　ＣＡＧＡＣＧＡＣＴＴ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－Ｔ－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣ　ＧＧＧＧＴＡＣＴＧＴ　ＡＡＧＴＧＧＴＡＧＡ　ＧＴＡＧＣＣＴＴＧＴ　ＴＧＣＴＡＣＧＡＴＣ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＣＡＣＴＧＡＧＧＴＴ　ＡＡＧＣＣＣＴＴＧＴ　ＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴ　ＴＧＴＴＣＡＡＣＴＴ　ＴＧＴＴＧＧＡＣＴＴ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴ　ＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣ　ＴＧＡＡＡＣＣＴＴＧ　ＡＧＧＧＣＣＧＧＧＡ　ＴＡＧＴＡＴＣＣＴＴ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－Ｇ－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－Ｇ－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＴＧＴＧＣＡＣＴＣＧ　ＣＧＡＣＡＧＣＡＴＧ　ＴＴＡＣＴＴＡＧＡＴ　ＴＣＧＡＡＡＧＧＧＴ　ＡＡＧＣＴＡＡＣＡＡ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －Ｇ－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －Ｇ－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＣＡＡＣＧＣＣＴＴＡ　ＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴ　ＡＣＣＴＴＴＣＴＣＣ　 ＴＴＴＧＡＡＴＣＡＣ　ＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－Ｔ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－Ｔ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＧＡＧＣＣＴＴＧＡＡ　ＧＡＣＴＴＡＴＡＡＧ　ＧＣＡＣＴＴＡＧＴＴ　ＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴ　ＡＡＣＣＧＣＧＣＧＣ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－Ｔ－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－Ｔ－－－－
ｎｙｄｘ　ＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡ　ＣＧＧＴＣＴＴＴＡＴ　ＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧ　ＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴ　ＴＡＴＧＧＣＣＧＡＴ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－Ｃ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－Ｃ－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－Ｃ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－Ｃ－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＡＴＣＣＣＧＴＡＴＡ　ＴＧＧＴＡＴＡＧＣＣ　ＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧ　ＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧ　ＴＣＡＡＣＧＡＣＴＧ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－Ｇ－－ －－Ｇ－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－Ｇ－－ －－Ｇ－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＡＴＴＴＴＣＴＧＧＡ　ＴＣＧＴＴＡＧＴＧＡ　ＧＣＴＴＧＡＧＧＧＴ　ＣＴＧＣＣＣＴＡＡＧ　ＧＴＴＧＣＣＡＴＧＡ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－Ｃ－－－－－－Ｃ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－Ｃ－－－－－－Ｃ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＴＴＧＡＡＡＡＧＧＣ　ＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴ　ＡＡＧＴＡＡＧＴＴＡ　ＡＧＣＴＡＣＧＧＴＴ　ＡＣＣＴＴＴＴＴＡＡ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－Ｇ
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－Ｇ
ｎｙｄｘ　ＣＣＧＴＴＴＣＡＡＣ　ＴＧＴＴＴＡＣＴＴＡ　ＧＣＴＴＴＣＧＡＧＧ　 ＧＣＴＡＣＧＴＴＣＡ　ＡＡＡＴＴＴＧＡＡＣ
ｚｍ －－－－－－－－－－ Ｃ－－－－Ｇ－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ Ｃ－－－－Ｇ－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴ　ＴＣＴＧＡＡＡＣＧＡ　ＡＡＧＧＴＴＴＧＣＴ　ＡＡＧＴＡＡＡＣＣＡ　ＴＴＧＧＴＣＡＡＧＡ
ｚｍ　 Ｇ－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｂｓ　 Ｇ－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＣＣＧＧＴＴＴＧＣＡ　ＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧ －ＴＧＧＣＴＧＴＡＧ　 ＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴ　ＣＡＴＴ －ＧＡＣＴＴ
ｚｍ　 Ｔ－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －ＧＣ－－－－－－－ －－－－Ｔ－－－－－
ｂｓ　 Ｔ－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ Ｇ－－－－－－－－－ －ＧＣ－－－－－－－ －－－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＧＧＣＣＴＡＴＡＧＴ　ＧＣＧＡＧＴＴＧＧＴ　ＡＡＣＡＡＡＡＣＧＣ　ＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣ　ＡＴＡＣＴＴＧＴＴＡ
ｚｍ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －Ｃ－－－－－－－－
ｂｓ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－ －Ｃ－－－－－－－－
ｎｙｄｘ　ＴＣ－ＣＡＣＧＧＣＧ　ＡＧＡ
ｚｍ －－－－－－－－Ｔ－ －－－
ｂｓ －－Ａ－－－－－－－ －－－
图２　３株蜜环菌核酸序列比对结果
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｂｌａｓｔ　ｏｆ　３Ａｒｍｉｌａｒｉａｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
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·生物技术· 北方园艺２０１２（０３）：１１６～１１８
图３　３株蜜环菌与其它近缘种的系统发育树
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　３Ａｒｍｉｌａｒｉａｓ
ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ
３　结论与讨论
猪苓为传统中药，有利水渗湿作用，近年来医疗上
又发现其对医治肝炎和抗癌有疗效，具有较高的药用价
值。榛磨为我国东北特有的山珍之一，其富含人体必需
的多种氨基酸和维生素，是目前市场上深受消费者喜爱
的一种菌类。但是，猪苓和榛蘑人工繁殖均十分困难，
研究表明猪苓和榛蘑均需要蜜环菌伴生才能生长。因
此，明确猪苓和榛蘑的伴生蜜环菌对人工繁殖至关重
要。由于蜜环菌分类比较混乱，传统实验手段很难准确
鉴定蜜环菌的分类地位。随着生物技术的发展，将形态
学与现代分子生物学技术相结合的方法对蜜环菌进行
鉴定已得到广泛应用，尤其是分子技术的介入使得准确
鉴定蜜环菌不再困难。Ｄｕｃｈｅｓｎｅ　Ｌ　Ｃ等［６］在研究中发
现，蜜环菌属（Ａｒｍｉｌａｒｉａ）内各生物种的５ＳｒＲＮＡ基因
与１８Ｓ、５．８Ｓ和２８ＳｒＲＮＡ基因共处于ｒＲＮＡ基因群的
一个重复单位（ｒＤＮＡ）中，并且它们的转录方向是一致
的，５ＳｒＲＮＡ基因５′端距２８ＳｒＲＮＡ基因的３′端０．８ｋｂ。
据此，Ｄｕｃｈｅｓｎｅ　Ｌ等［６］和Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｊ　Ｂ等［７］设计了分别
位于５ＳＤＮＡ和２８ＳｒＤＮＡ的引物５ＳＡ和ＣＮＬ１２，用于
在ＰＣＲ反应中扩增蜜环菌属（Ａｒｍｉｌａｒｉａ）各生物种５Ｓ
ＤＮＡ和２８ＳｒＤＮＡ之间的ＩＧＳ区段。Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｊ　Ｂ
等［７］用这２个引物（５ＳＡ／ＣＮＬ１２）成功地扩增了蜜环菌
属９个生物种２４个分离株的ＩＧＳ区段。Ｈｅｎｒｉｏｎ　Ｂ
等［８］用这一对引物（５ＳＡ／ＣＮＬ１２）成功扩增出ＩＧＳ的真
菌，包括Ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ、Ａｍａｎｉｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ、
Ｔｕｂｅｒ、Ｃｅｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｂｏｌｅｔｕｓ、Ｐａｘｉｌｕｓ和Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ等
多个属。在后来的研究中，也在其它一些真菌中发现了
类似蜜环菌属（Ａｒｍｉｌａｒｉａ）物种的ｒＤＮＡ结构［９－１０］，说明
这种ｒＤＮＡ结构在真菌中具有一定的普遍性。同时，也
表明５ＳＡ和ＣＮＬ１２这对引物组合可准确鉴定、区分蜜
环菌。该研究即采用这对引物组合对所获得的２株蜜
环菌进行鉴定，其鉴定准确性十分可靠。
该研究将传统的形态观察与分子技术相结合，首先
从形态学上确定分离自猪苓菌核和榛蘑子实体的菌株
为蜜环菌。与此同时，应用分子生物学技术，扩增所获
菌株的ｒＤＮＡ－ＩＧＳ区域。通过生物信息学分析，确定这
２株蜜环菌与高卢蜜环菌具有较近的亲缘关系。另外，
购买已获鉴定的蜜环菌菌株作为参照，通过形态观察和
分子技术鉴定，均表明从猪苓菌核和榛蘑子实体中所获
得菌株与参照蜜环菌具有非常高的相似性和同源性。
这进一步证实了鉴定结果的准确性。
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［１０］Ｇａｒｂｅｒ　Ｒ　Ｃ，Ｔｕｒｇｅｏｎ　Ｂ　Ｇ，Ｓｅｌｋｅｒ　Ｅ　Ｕ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ
ＲＮＡ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｎｇｕｓ　Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
１９９８，１４：５７３－５８２．
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｗｏ　ＡｒｍｉｌａｒｉａＢａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＧＳ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ
ＦＥＮＧ　Ｊｉａｎ，ＦＡＮ　Ｊｕｎ－ｇａｎｇ，ＪＩＮ　Ｒｕｏ－ｚｈｏｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｇａｎｇ
（Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　１１００３２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｂｓ　ａｎｄ　ｚｍ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｃｌｅｒｏｔｉａ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　Ｕｍｂｅｌａｔｕｓ　ａｎｄ　ｂｏｄｙ　ｏｆ　Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｍｅｌｅａｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
ａｓ　ｔｅｓｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ．Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ＩＧＳ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｏｆ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｈａｂｉｔａｔｓ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ
ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｓｃｌｅｒｏｔｉａ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　Ｕｍｂｅｌａｔｕｓ　ａｎｄ　ｂｏｄｙ　ｏｆ　Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｍｅｌｅａ，ｔｗｏ　ａｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆｕｎｇｉ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ
Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ．Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｔｈｅ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　Ａｒｍｉｌａｒｉａｓ，ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　５ＳＡ　ａｎｄ　ＣＮＬ１２ａｓ
ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ｒＤＮＡ　ｏｆ　ｔｗｏ　Ａｒｍｉｌａｒｉａｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｂｏｔｈ　ｏｆ　Ａｒｍｉｌａｒｉａｓ　ｗｅｒｅ　Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｇａｌｉｃａ，
ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆｕｎｇｕｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　Ｕｍｂｅｌａｔｕｓ　ｉｎ　Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｒｍｉｌａｒｉａ；ＰＣＲ；ｒＤＮＡ
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