全 文 ：林戎斌，张慧，林陈强，等．ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分子标记技术在姬松茸菌株鉴定上的应用比较 ［Ｊ］．福建农业学报，２０１２，２７ （２）：
１４９－１５２．
ＬＩＮ　Ｒ－Ｂ，ＺＨＡＮＧ　Ｈ，ＬＩＮ　Ｃ－Ｑ，ｅｔ　ａｌ．ＤＮＡ　Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌ ［Ｊ］．
Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，２７ （２）：１４９－１５２．
ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分子标记技术在姬松茸菌株鉴定上的
应用比较
林戎斌，张　慧，林陈强，郑　力，陈济琛
（福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建　福州　３５００１３）
收稿日期：２０１１－１１－０９初稿；２０１２－０２－０１修改稿
作者简介：林戎斌 （１９７１－），男，硕士，副研究员，主要从事食用菌研究 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｏｎｇｂｉｎｌｉｎ２００１＠１６３．ｃｏｍ）
通讯作者：陈济琛 （１９６４－），男，研究员，主要从事农业微生物与食用菌研究 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｊｉｃｈｅｎ２００１＠１６３．ｃｏｍ）
基金项目：福建省科技计划重点项目（２０１０Ｙ１００４、２０１１Ｙ１００４）；福建省财政专项———福建省农业科学院科技创新团队项目（ＳＴＩＦ－Ｙ０１）
摘　要：利用ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ３种分子标记法对１６株姬松茸菌株进行比较分析。结果表明其中８条
ＲＡＰＤ、４条ＩＳＳＲ和２对ＳＲＡＰ引物适合姬松茸菌株鉴定分析，３种标记方法均将１６个菌株分为３大类群，
Ａ００１１＋１和Ａ００１３为１类，Ａ０００９单独为１类，其余菌株为１类。３种分子标记法对姬松茸菌株鉴别的结果存
在着一定差别。ＳＲＡＰ反应的遗传信息较丰富，比ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ检测到更大的遗传差异；ＲＡＰＤ引物扩增到的
多态性条带数较多。
关键词：姬松茸；随机扩增多态性；简单序列重复多态性；相关序列扩增多态性；聚类分析
中图分类号：Ｑ　３４４．１ 文献标识码：Ａ
ＤＮＡ　Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌ
ＬＩＮ　Ｒｏｎｇ－ｂｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｈｕｉ，ＬＩＮ　Ｃｈｅｎ－ｑｉａｎｇ，ＺＨＥＮＧ　Ｌｉ，ＣＨＥＮ　Ｊｉ－ｃｈｅｎ
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｏｉｌ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｉｘｔｅｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＩＳＳＲ，ＲＡＰＤ　ａｎｄ　ＳＲＡＰ．ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　８ＲＡＰＤ　ｐｒｉｍｅｒｓ，４ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　２ＳＲＡＰ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｒｅｅ
ｇｒｏｕｐｓ．Ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅｍ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ　ｏｆ　Ａ００１１＋１ａｎｄ　Ａ００１３，ａｎｏｔｈｅｒ　Ａ０００９，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈｅ　ｒｅｍａｉｎｄｅｒｓ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＳＲＡＰ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｒｉｃｈ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＲＡＰＤ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｌａｒｇｅｓｔ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄｓ　ａｍｏｎｇ　ａｌ　ｍａｒｋｅｒｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌ；ＲＡＰＤ；ＩＳＳＲ；ＳＲＡＰ；ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ
　　姬松茸Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌ又名巴西蘑菇、
柏氏蘑菇、小松菇，属担子菌门，伞菌纲，伞菌
目，蘑菇科，蘑菇属。姬松茸具有浓郁的杏仁香
味，菌盖嫩，菌柄脆，口感极好，味纯鲜香，食用
价值颇高，其营养价值也很高。此外，因含有多种
抗肿瘤活性物质，其干品可提取加工为姬松茸多
糖、姬松茸胶囊、姬松茸冲剂等系列产品，用于治
疗癌症、糖尿病、神经痛、肝病，降低高血脂，改
善动脉硬化等［１］，是一种珍稀食药两用菌［２］。
国内已有利用分子标记技术对食用菌遗传多样
性进行分析的报道。尚晓冬等［３］利用ＲＡＰＤ分子
标记技术对国内外收集到的１９株杏鲍菇进行指纹
图谱分析；崔鹏等［４］利用ＲＡＰＤ分子标记技术分
析１２个白色金针菇菌株的遗传特性及亲缘关系。
朱坚等［５］研究表明ＳＲＡＰ可应用于金针菇的杂交
育种，指导亲本选择与杂种鉴定。张红玉等［６］发现
ＳＲＡＰ分子标记技术可以用于灵芝原生质体融合子
的鉴定。郭钟尧等［７］，熊芳等［８］、李翠翠等［９］利用
ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分别对金针菇、凤尾菇、真姬菇
菌株进行遗传多样性分析。陈美元等［１０］利用ＩＳＳＲ
和ＳＲＡＰ分子标记技术对蘑菇菌株进行遗传多样
性分析。孙淑静等［１１］利用ＩＳＳＲ和 ＲＡＰＤ分子标
记技术分析了不同来源的１４株银耳芽孢多样性。
本研究利用ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ、ＳＲＡＰ３种分子标记技
术对１６个姬松茸菌株的亲缘关系进行分析比较，
对姬松茸遗传育种工作具有一定的实用价值。
福建农业学报２７（２）：１４９～１５２，２０１２
Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００８－０３８４ （２０１２）０２－１４９－０４
１　材料与方法
１．１　供试菌株
ＡｂＭＬ２、ＡｂＭＤ３、ＡｂＭＬ７、ＡｂＭ９、ＡｂＭＬ１１菌
株由福建省农业科学院土壤肥料研究所保藏，其余
菌株由福建省农林大学菌物研究中心提供 （表１）。
１．２　培养基
试管斜面培养基：马铃薯２００ｇ、葡萄糖２０ｇ、
琼脂２０ｇ、水１　０００ｍＬ。液体ＰＤＡ培养基：马铃
薯２００ｇ、葡萄糖２０ｇ、水１　０００ｍＬ。
１．３　试剂与仪器
脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰ，２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）、
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ·μＬ
－１）；ＰＣＲ引物序列见表
２。ＰＣＲ扩增仪：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ＡＧ２２３３１Ｈａｍｂｕｒｇ；电
泳仪：Ｄ－ＹＹ－１２型电脑三恒多用电泳仪；凝胶成像
系统：ＴＡＮＯＮ－２００８。
１．４　菌丝体培养
将冰箱保种菌种接于试管斜面培养基，转管活
化７～１０ｄ，耙碎，接入２５０ｍＬ三角瓶液体培养基
中，每个菌株各接３瓶，于２５℃摇床上１２０ｒ·ｍｉｎ－１
培养１０ｄ，用４００目铜网过滤，蒸馏水冲洗，滤纸
吸干，保存于－２０℃备用。
１．５　ＤＮＡ提取
取姬松茸菌丝 ０．５ｇ，参照文献 ［１２］的
ＣＴＡＢ法进行ＤＮＡ提取。
１．６　分子标记反应体系及电泳条件
１．６．１　ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增与检测　扩增方法参照文
献 ［１１］的方法进行。
１．６．２　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增与检测　扩增方法参照文
献 ［１３］的方法进行。
１．６．３　ＳＲＡＰ标记扩增与检测　扩增方法参照文
献 ［１４］的方法进行。
１．７　数据分析
利用ＤＰＳ６．０１分析软件体系进行聚类，构建
遗传相关聚类图谱。
表１　供试姬松茸菌株
Ｔａｂｌｅ　１　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ
编号 菌株 来源
１ ＡｂＭＬ２ 福建省农业科学院土壤肥料研究所
２ ＡｂＭＤ３ 福建省农业科学院土壤肥料研究所
３ ＡｂＭＬ７ 福建省农业科学院土壤肥料研究所
４ ＡｂＭ９ 福建省农业科学院土壤肥料研究所
５ ＡｂＭＬ１１ 福建省农业科学院土壤肥料研究所
６ Ａ０００９ 东北食药真菌研究所
７ Ａ００１１＋１ 山东省寿光市食用菌研究所
８ Ａ００１３ 湖北省嘉鱼县环宇食用菌研究所
９ Ａ００１４ 古田县科协为民食用菌场
１０ Ａ００１６ 福建省福州市农业科学所食用菌室
１１ Ａ００１７ 福建省漳州市龙海九湖食用菌研究所
１２ Ａ００１９ 福建省农科院植物保护研究所
１３ Ａ００２２ 福建省农科院植物保护研究所
１４ Ａ００２３ 福建省农科院植物保护研究所
１５ Ａ００３１ 福建省三明真菌研究所
１６ Ａ００３２ 福建省三明真菌研究所
表２　ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ、ＳＲＡＰ引物
Ｔａｂｌｅ　２　ＲＡＰＤ，ＩＳＳＲ　ａｎｄ　ＳＲＡＰ　ｐｒｉｍｅｒｓ
ＲＡＰＤ引物 引物序列 ＩＳＳＲ／ＳＲＡＰ引物 引物序列
Ａ７ ＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧ　 ＩＳＳＲ２ ＢＤＢＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ
Ａ１２ ＴＧＣＧＣＧＡＴＡＧ　 ＩＳＳＲ３ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＷＧ
Ａ１９ ＣＡＡＡＣＧＴＣＧＧ　 ＩＳＳＲ４ ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＳＣ
Ｂ７ ＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧ　 ＩＳＳＲ５ ＶＤＨＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ
Ｃ７ ＧＴＣＣＣＧＡＧＣＡ　 Ｍｅ１ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ
Ｄ８ ＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡ　 Ｍｅ２ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ
Ｓ６２ ＧＴＧＡＧＧＣＧＴＣ　 Ｅｍ１２ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＴＣ
Ｓ２０４７ ＴＧＴＧＣＣＴＧＡＣ　 Ｅｍ１３ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＧＴ
２　结果与分析
２．１　ＳＲＡＰ扩增结果分析
筛选得到２对ＳＲＡＰ引物（ｍｅ２～ｅｍ１２、ｍｅ１～
ｅｍ１３），其在１６株供试菌株上扩增效果较好 （图
１），可扩增出所有供试菌株的ＤＮＡ条带，且条带
清晰、稳定、分布合理、重复性好，总扩增条带数
为２７３条，多态性条带为１０５条，占总条带数的
３８．５％。
０５１ 福建农业学报 第２７卷
２．２　ＲＡＰＤ扩增结果分析
筛选出８条 ＲＡＰＤ 引物共扩增３９６个条带
（图２），多态性条带为２０２条，占总条带数的
５１．０％。
２．３　ＩＳＳＲ扩增结果分析
筛选出４条ＩＳＳＲ引物 （表２）共扩增１６１个
条带 （图３），多态性条带为５６条，占总条带数的
３４．８％。
图１　ＳＲＡＰ引物对ｍｅ１～ｅｍ１３扩增图谱
Ｆｉｇ．１　ＳＲＡＰ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　Ａ．ｂｌａｚｅｉ　ｕｓｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ　ｍｅ１－ｅｍ１３
注：Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ，泳道１～１６见表１，图２、３同。
图２　ＲＡＰＤ－Ａ１９引物扩增图谱
Ｆｉｇ．２　ＲＡＰＤ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　Ａ．ｂｌａｚｅｉ　ｕｓｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ　Ａ１９
图３　ＩＳＳＲ　２引物扩增图谱
Ｆｉｇ．３　ＩＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　Ａ．ｂｌａｚｅｉ　ｕｓｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ　２
１５１第２期 林戎斌等：ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ和ＳＲＡＰ分子标记技术在姬松茸菌株鉴定上的应用比较
２．４　聚类分析
根据１６个菌株的遗传距离进行聚类。ＳＲＡＰ、
ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ标记方法菌株间相似系数分别在
０．４５、０．４０、０．８０时，均将供试的１６个姬松茸菌
株划分为３大类群，Ａ００１１＋１和 Ａ００１３为一类，
Ａ０００９单独为一类，其余菌株为一类。
图４　１６个姬松茸菌株ＩＳＳＲ聚类分析树状图
Ｆｉｇ．４　Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　１６　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ａ．ｂｌａｚｅｉ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＳＲＡＰ，ＲＡＰＤ　ａｎｄ　ＩＳＳＲ
３　讨　论
本研究利用３种分子标记技术ＩＳＳＲ、ＳＲＡＰ、
ＲＡＰＤ对姬松茸栽培菌株进行分析，均将１６个菌
株分成３组，其中ＡｂＭＤ３菌株为ＡｂＭ９单孢分离
获得，遗传相似系数最高［１５］，ＳＲＡＰ标记方法聚类
分析结果与其相一致，ＩＳＳＲ分子标记结果与其有
差异，ＲＡＰＤ方法分析结果介于两者之间；３种分
子标记结果中 Ａ０００９菌株与其他菌株均有较大的
遗传差异，Ａ００１１＋１和Ａ００１３菌株与其他菌株也
有较大的遗传差异，Ａ０００９、Ａ００１１＋１和 Ａ００１３
菌株分别来源于东北食药真菌研究所、山东省寿光
市食用菌研究所和湖北省嘉鱼县环宇食用菌研究
所，可为以后姬松茸杂交选育的亲本选择上提供参
考和依据。
从本试验所采用的３种分子标记法对姬松茸菌
株鉴别的结果可知，它们之间存在着差别。ＳＲＡＰ
标记应用于姬松茸菌株鉴定较ＩＳＳＲ、ＲＡＰＤ检测
到更大的遗传差异。
参考文献：
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性的ＤＮＡ指纹分析［Ｊ］．食用菌学报，２００９，１６（１）：１１－１６．
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出版社，２００２：７４４．
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［１４］应正河，吴小平，谢宝贵，等．香菇ＳＲＡＰ反应体系的优化
［Ｊ］．食用菌学报，２００６，１３ （４）：１－５．
［１５］张慧，江秀红，林新坚，等．离子束选育姬松茸新菌株的鉴
定 ［Ｊ］．食用菌学报，２０１０，１７ （３）：１６－１９．
（责任编辑：柯文辉）
２５１ 福建农业学报 第２７卷