全 文 ：腐殖酸对松茸菌丝生长的影响研究
李维国
(吉林师范大学环境工程学院 ,吉林四平　136000)
摘　要　对不同量腐殖酸下松茸的生长状况进行了研究 ,结果表明 ,腐殖酸对松茸纯培养(22 ℃)菌丝具有抑
制作用 ,在浓度为 0 ～ 20 g/ L的范围内这种抑制效应随腐殖酸浓度的增加而增强 , 20 g/ L 时抑制作用最强。
腐殖酸不能替代葡萄糖作碳源 、能源。
关键词　松茸;菌丝;腐殖酸;生长
中图分类号　S646　　　文献标识码　B　　　文章编号　1005-7021(2005)05-0110-03
　　在实验室将腐殖酸量设计不同梯度(处理)对
松茸菌丝进行培养的基础上 ,根据试验结果进行
统计分析 ,明确腐殖酸对松茸菌丝生长的影响 、作
用 ,以及作为碳源 、能源对葡萄糖的替代作用 。从
而对研究松茸的最佳生态条件及营养生理提供理
论依据 。同时对大批量扩繁高质量的适于野外接
种的优良菌种时选择最佳生态条件 、实现大面积
松茸半人工栽培具有重大实践意义 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验地点　东北师范大学城市环境科学
院生态实验室。
1.1.2　试验菌种　选用东北师范大学松茸科研
组在天佛指山筛选的松茸 2号菌种 。
1.1.3　培养基　以改良 MMN 培养基为基础 ,根
据试验各处理的具体要求适当调整腐殖酸用量 。
改良 MMN 培 养 基 配 方 (固 体 培 养 基 、
1 000 mL):去皮土豆 100 g 煮出液 ,葡萄糖 10 g ,
磷酸二氢钾 0.5 g ,磷酸二氢铵 0.25 g ,硫酸镁
0.2 g ,氯化钙 0.1 g ,氯化钠 0.05 g ,麦芽糖 0.05
g ,1%FeCl3 溶液 1.2 mL ,琼脂 20 g 。
1.1.4　试验设备　高压灭菌锅 、恒温培养箱 、净
化工作台 、烧杯 、三角瓶 、培养皿 、试管 、注射器 、酒
精灯 、pH 试纸 、移液管 、天平 、接种工具等。
1.2　方法
1.2.1　试验设计　设计梯度(试验处理)为每
1 000 mL 培养基中加入溶解的腐殖酸 0 g(CK)、
0.1 、1.0 、5.0 、10.0 、15.0 、20.0 g 七个处理 , 0 g
为对照 ,每个处理设 4 次重复。
研究于 2002年 1月 5日开始实施 ,首先进行
200 管松茸一级菌种的扩繁 ,然后于 2月 27日进
行试验 。菌丝培养期间每隔 3 d定时观察 、记录
菌落生长状况 ,测量菌落直径(从 3 个方向测量)。
每个实验结束后进行菌落的彩色摄影 、在显微镜
下测量不同处理的菌丝直径并进行菌丝的显微照
像 。试验数据由计算机处理 ,并进行统计分析 ,作
出柱形图(平面图 、立体图)及趋势面图 ,计算出日
均生长速度(cm/d),日均生长速度 =(菌落直径
-菌种块直径)/培养时间。进行显著性检验 、建
立回归方程 。
1.2.2　200 管一级菌种的扩繁　①称量:培养基
采用改良 MMN 配方 。用天平称取去皮土豆(切
成 1 cm 大小的方块)300 d ,加 3 000 mL 水 ,煮
沸 30 min过滤 ,滤液放入干净的 3 000 mL 烧杯
中 ,然后称取葡萄糖 30 g ,磷酸二氢钾 1.5 g ,磷
酸二氢铵 0.75 g ,硫酸镁 0.6 g ,氯化钠 0.15 g ,
氯化钙 0.3 g ,麦芽糖 0.15 g ,1% FeCl3 溶液 3.6
mL ,琼脂 60 g 放入烧杯中;②熔化:加热并不断
搅拌直至琼脂完全熔化 ,补足加热蒸发所失水分 ,
　收稿日期:2004-02-18
　作者简介:李维国　男 ,硕士,副教授。现从事环境保护及微生物的教学与科研工作。
　项目来源:吉林省科委重点科研项目
110 微生物学杂志　 2005 年 9 月第 25 卷第 5 期　JOURNAL OF MICROBIOLOGY Sept.2005 Vol.25 No.5
用水定容至 3 000 mL;③调 pH 值:用 pH试纸检
验培养基的酸碱度 ,同时用 10%的盐酸和 10%的
氢氧化钠将培养基 pH 调至 6.5;④分装:趁培养
基未凝 ,用注射器抽取培养基装入试管 ,避免沾污
管口。每试管(中号)装 15 mL ,共装 200 管 ,管
口塞以棉塞 ,以过滤空气避免杂菌进入;⑤灭菌:
将装好的试管每 7 只为 1 捆 ,用牛皮纸 、绳在塞
口处扎紧 ,放入高压灭菌锅内 ,排尽空气后在 0.5
kg/cm2压力 、112 ℃下灭菌 30 min;⑥摆斜面:灭
菌后趁培养基未凝将试管倾斜一定角度(管口处
垫上物品)制成斜面 。在保持培养基与棉塞一定
距离(2 cm 以上)的情况下 ,斜面应尽可能大些;
⑦接种:在无菌净化工作台上(SW-CJ-1FD 净化
工作台)用酒精灯严格按无菌操作规程迅速将菌
块(大小约 0.3×0.3cm)放置于斜面中央;⑧培
养:接种后的试管倾斜放入恒温培养箱 ,斜面向
下 ,控制恒温 22 ℃。培养期间每天定时观察(用
放大镜)并记录菌丝生长状况 。经 13 d菌丝长满
斜面 ,菌落洁白 ,菌苔较厚 ,长势较好。
由于净化工作台和恒温培养箱都预先用甲醛
加高锰酸钾熏蒸消毒过 ,因此污染少 ,污染率不超
过 1%。
1.2.3　试验的操作步骤　①腐殖酸溶解试验:试
验前首先进行了腐殖酸溶解试验 。称 10 g
NaOH 放入 500 mL 三角瓶中 ,加入 180 mL 水 ,
振荡使之完全溶解后加入 10 g 腐殖酸 ,充分振荡
使之溶解 ,静置 16 h 后再次振荡 ,待腐殖酸全部
溶解后 ,徐徐滴加 36%的盐酸调 pH 至 6.5 ,然后
进行 12 、48 、96 h 的观察 、测定 ,观察溶液中腐殖
酸是否析出或沉淀 , 测定溶液 pH 值是否变化。
结果并未发现有腐殖酸析出或沉淀 。pH 值也未
变化 ,仍为 6.5 ,表明生成了稳定的络合物 。加水
定容至 200 mL , 备用;②配制培养基:按配
1 000 mL 改良 MMN 培养基的配方量分别称取
各组分放入 1 500 mL 烧杯中 ,但为了探索腐殖
酸对葡萄糖的替代作用 ,其中未加入葡萄糖 。加
水定容至 500 mL。加热至琼脂完全熔化为止 ,补
充蒸发所失的水分(土豆汁的制备同前述)。取
250 mL干净三角瓶 7 个 ,向每瓶中加入 50 mL
上述培养基 ,并依次向其中加入 0.2 、2 、10 、20 、
30 、40 mL 上述的腐殖酸溶液 ,剩下的一个三角瓶
不加腐殖酸作对照 ,贴上标签依次标注腐 0.1 、腐
1.0 、腐 5.0 、腐 10.0 、腐 15.0 、腐 20.0 、腐 0。然
后每个三角瓶均用水定容至 100 mL ,水浴加热并
摇动使腐殖酸完全溶解到培养基中 。用 10%
NaOH 、10%HCl将各瓶 pH 值皆调至 6.5 ,塞上
棉塞 ,用牛皮纸包好 ,放入灭菌锅。剩余培养基妥
善保管 、备用;③灭菌:培养基在 0.5 kg/cm2 压
力 、112 ℃下灭菌 30 min ,同时在另一个灭菌锅
中将 35 个干净的培养皿及注射器 112 ℃灭菌
30 min。起动净化工作台(台内已用酒精棉全部
擦试),中量鼓风 ,开启紫外灯至少灭菌 30 min ,
关闭紫外灯后再开启日光灯;④倒平皿:将灭菌后
的培养皿从高压灭菌锅中取出立即放入净化工作
台 ,然后再从另一灭菌锅中依次取出盛培养基的
三角瓶 ,充分振荡后 ,用灭菌的注射器从三角瓶中
每次抽取 20 mL 放入培养皿(Ф10 cm),每瓶放 4
皿(4 次重复),剩余培养基弃之。每皿按三角瓶
的标签(处理号)贴上记录处理号和重复号的标
签;⑤接种:待皿中培养基完全凝固 ,在净化工作
台上用酒精灯严格按无菌操作规程进行接种 。接
种时应尽可能选用生长状态相同的菌种 。为保证
接种量的一致性 ,采用特制的接种工具切割成同
样大小的菌块(2 mm ×2 mm),然后逐一接入培
养皿的中央。另外 ,为减小处理间的误差 ,接种时
以包含 7 个处理的 7 个培养皿为一组顺序进行
分组接种 ,并要绝对防止接种的菌块在培养基表
面滚动;⑥培养:接种的培养皿仍按组倒置于培养
箱内培养 ,控制恒温 22 ℃;⑦观察 、测量:从培养
的第 2 d开始逐日测量菌落直径 ,并用放大镜观
察长势 ,作好详细记录 。因为菌丝的粗细直接反
映菌丝的长势 ,因此还要在显微镜下测量各处理
菌丝的直径。实验结束后对菌落进行彩色摄影 ,
对菌丝进行显微照像 。
2　结果与讨论
　　见表 1 、表 2(彩色统计图及彩色照片略)。
腐殖酸试验的结果均呈现腐殖酸对松茸菌丝
生长的抑制效应 ,与对照比较 ,其差异达到极显著
水平。从试验结果可以看出 ,随着腐殖酸量的增
加对菌丝生长的抑制加强 ,与对照相比菌丝生长
速度越来越慢 ,菌落变小且不规则 ,当腐殖酸量增
加到 20 g/L 时 ,菌丝的生长极慢 ,生长末期几乎
处于停滞状态 ,且菌落萎缩 、不规则 、菌苔薄 、菌丝
1115 期　　　　　　　　　　　　　李维国:腐殖酸对松茸菌丝生长的影响研究　　　　　
短 、紧贴培养基 ,菌落上始终未表现出正常的白
色 ,而是类似腐殖酸的黑褐色 。
显微镜下观察测量的菌丝直径同样随腐殖酸
量的增加而变细 ,也呈现抑制效应。腐殖酸量增
加到 20 g/L 时 ,其抑制效应最大 ,菌丝最细 ,且畸
型菌丝大量出现 ,生长势最弱 。
腐殖酸的这种抑制效应与自然界土壤中松茸
喜瘠薄 、嫌肥沃的特征是吻合的。肥沃土中含有
大量由枯枝落叶转化而成的腐殖质 ,而腐殖质中
的主要成分就是腐殖酸。过厚的腐殖质层使土中
松茸菌丝受到严重抑制 ,因此 ,松茸地实施清除腐
殖层的作业是非常必要的 ,本实验恰恰验证了此
项作业的科学性 。然而腐殖酸抑制松茸生长的机
理还有待进一步研究 。
因为腐殖酸对松茸菌丝生长具有抑制作用 ,
所以根本谈不上腐殖酸替代葡萄糖作碳源。实验
结果也充分证实了这一点 。
表 1　各处理生长量(菌落直径 , 4 次重复平均)
处理/(g·L -1)
生长量/ cm
0(CK) 0.1 1.0 5.0 10.0 15.0 20.0
2月 28日 接种 接种 接种 接种 接种 接种 接种
3月 2日 0.875 0.867 0.887 0.888 0.763 0.663 0.425
3月 5日 1.563 1.540 1.538 1.475 1.338 0.988 0.567
3月 8日 2.313 2.217 2.225 2.088 1.675 1.417 0.733
3月 11日 3.025 2.717 2.810 2.650 2.175 1.583 0.950
3月 14日 3.725 3.615 3.300 3.225 2.500 2.075 1.033
3月 17日 4.313 4.05 3.95 3.633 2.963 2.333 1.133
平均日生长 0.227 0.213 0.207 0.189 0.152 0.117 0.050
量/ cm·d-1
差异显著性 CK 显著 显著 显著 极显著极显著极显著
(与对照比较)
回归方程 Y=0.222 62-0.007 89X(0≤X≤20)
(X:腐殖酸浓度 ,
Y:日均生长量)
表 2　生长势(菌丝直径 , 5 次重复平均)
处理/(g·L -1) 0 0.1 1.0 5.0 10.0 15.0 20.0
菌丝直径/μm 4.456 0 4.194 8 3.987 0 3.695 8 3.672 8 3.006 8 2.969 0
3　结论
3.1　腐殖酸对松茸纯培养(22 ℃)菌丝具有抑制
作用 ,在浓度为 0 ～ 20 g/ L 的范围内这种抑制效
应随腐殖酸浓度的增加而增强 , 20 g/L 时抑制作
用最强。腐殖酸浓度影响松菌丝日均生长量的回
归方程:y =0.222 62-0.007 89x(0≤x ≤20 ,单
位:cm)。由于腐殖酸对松茸菌丝生长的抑制作
用 ,故腐殖酸不能替代葡萄糖作碳源 、能源。
3.2　根据本项试验及本人所进行其他研究 ,建议
提出适用于菌剂生产的 MMN 培养基新配方(固
体培养基 ,1 000 mL):磷酸二氢钾 0.5 g ,磷酸二
氢铵 0.5 g , 1% FeCl3 溶液 1.2 mL ,硫酸锰 0.2
g ,葡萄糖 25 g ,麦芽糖 0.05 g ,维生素B1 0.1 mg ,
硫酸镁 0.2 g ,氯化钙 0.05 g ,氯化钠 0.03 g ,吲
哚乙酸 1.0 mg ,琼脂 20 ～ 30 g(注:取消原有的腐
殖酸成分)。
致谢　本研究得到了东北师范大学盛连喜教授 、刘晶玲
副教授 、王振堂教授 、吕耀坤高级工程师 、张喜臣老师以
及吉林农业大学商学院韩星焕院长 、吉林大学罗灿博士
的热情关心和大力帮助 ,特此表示衷心感谢!
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