全 文 ：收稿日期:2013 － 10 － 08;修回日期:2013 － 10 － 22
基金项目:安徽大学研究生学术创新研究项目(01001770 － 10117700101)
作者简介:徐来清，硕士研究生，专业方向为发酵工程，E-mail:xulaiqing. 1989@ 163． com;
通讯作者:张书祥，副教授，硕士生导师，研究方向为发酵工程，E-mail:zhangshux578@ 126． com。
doi∶10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2014. 02. 091
假蜜环菌发酵工艺的优化研究
徐来清，张书祥
(安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥 230601)
摘 要:目前，国内普遍采用亮菌固体发酵工艺生产亮菌制剂。采用小型发酵罐液体深层发酵和液体静置发酵对亮
菌发酵工艺进行优化研究。液体深层发酵采用 28 ℃，200 r /min，通气量 1 ∶ 1 v /v·m，培养 7 d，亮菌干重为 16. 55
g /L，其中菌丝体中多糖含量为 5. 42%，蛋白含量为 1. 75%;液体静置发酵采用 500 mL 三角瓶，28 ℃，150 r /min ，摇
瓶 3 d后静置发酵 14 d，亮菌干重可达 10. 69 g /L，发酵液中多糖含量为 1. 016 g /L，蛋白含量为 0. 320 g /L。对液体
静置发酵进一步研究发现其发酵液中亮菌甲素含量可达 3. 118 mg /L。由此可见，两种发酵方式在保证生物量和活
性成分的前提下，缩短了发酵周期，均优于传统的固体发酵工艺，值得工业生产借鉴。
关键词:亮菌;液体种子;发酵罐;静置发酵
中图分类号:TQ920． 6 文献标识码:B 文章编号:2095 － 1736(2014)02 － 0091 － 04
The optimization of the fermentation technology of Armillariella tabescens
XU Lai-qing，ZHANG Shu-xiang
(School of Life Science，Anhui University，Hefei 230601，China)
Abstract:At present，preparation of Armillariella tabescens was generally carried on with solid state fermentation． The optimization of
fermentation technology of Armillariella tabescens with taking the deep liquid fermentation of fermentor and stationary liquid fermentation
methods was made． The deep liquid fermentation was studied under the condition of 28℃，200 r /min，ventilation of 1 ∶ 1 v /v·m． Af-
ter culturation for 7 days，the biomass of Armillariella tabescens in dry weight was 16. 55 g /L，and the mycelia contained polysaccharide
5. 42%，protein 1. 75%;the stationary liquid fermentation was taken firstly by using 500 mL conical flask to shake for 3 days at 28℃，
150 r /min，and then to stationary culture for 14 days，the biomass of Armillariella tabescens in dry weight could reach to 10. 69 g /L，
and the fermentation broth included polysaccharide 1. 016 g /L，protein 0. 320 g /L．
Keywords:Armillariella tabescens;liquid strain;fermentor;stationary culture
假蜜环菌 ［Armillariella tabescens(Scop． ex Fr．)
Sing］是层菌纲口蘑科假蜜环菌属真菌，因菌丝体在暗
处发出荧光，故称为亮菌。该菌具有治疗肝炎、胆囊
炎、肿瘤以及放疗、化疗引起的白细胞减少等药效，且
还具有强筋壮骨、疏风活络、明目、利肺、醒酒、益肠胃
等保健功效［1 － 3］。现代研究表明，用乙醇、乙酸乙酯提
取可得到亮菌甲素、亮菌乙素、亮菌丙素，而亮菌甲素
主要用于急慢性肝炎、慢性浅表性胃炎和慢性胆囊炎
急性发作等疾病的对症治疗［3，4］。另据报道，用水提或
碱提法可提取得到亮菌杂多糖 ATM3、AT-HW 和 AT-
AC，而亮菌多糖是假蜜环菌生理生化活性的主要成分
之一，具有抑制小鼠 S180肿瘤的生长，提高机体免疫机
能的功效［5 － 8］。
目前，国内亮菌口服液或胶囊制剂多采用固体发
酵工艺生产，以廉价易得的玉米粉、红薯粉等原料按一
定比例混合配制固体培养基，灭菌接种，然后在室内
避光培养 2 个月左右。这种生产方式优点是发酵程度
深，有利于多种药用有效成分的表达分泌，但明显存在
的问题是生产周期长，污染的概率大，且一旦染菌只能
全部丢掉，浪费大。因此，固体发酵规模小、周期长、产
19
第 31 卷第 3 期
2014 年 6 月
生 物 学 杂 志
JOUＲNAL OF BIOLOGY
Vol． 31 No． 3
Jun，2014

量低的缺点严重制约了企业的产能和效益。
本文在相关文献报道的基础上［9，10］，针对合肥诚
志生物制药有限公司提供的假蜜环菌菌种，在本实验
室前期工作的基础［11］上，进行液体发酵罐深层发酵和
静置发酵两种发酵方式的研究，探究其取代传统固体
发酵方式的可行性，为亮菌口服液的液态发酵生产工
艺提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种
假蜜环菌［Armillariella tabescens(Scop． ex Fr．)
Sing］菌种由合肥诚志生物制药有限公司提供。
1. 1. 2 培养基
1)试管斜面培养基:PDA培养基。
2)液体培养基(g /L) :马铃薯去皮，200;KH2 PO4，
2;MgSO4·7H2O，1。
1. 1. 3 试剂
亮菌甲素对照品(中国药品生物制品检定所) ;甲
醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
1. 1. 4 主要仪器
UV-5200 紫外分光光度计(上海元析仪器有限公
司) ;SX-700 压力蒸汽灭菌锅(TOMY) ;Ｒ-3 旋转蒸发
仪(BUCHI) ;高效液相色谱仪(HITACHI D-2000 se-
ries) ;色谱柱:Agilent TC-C18(2) (4. 6 mm × 250 mm，
5 μm) ;检测器:L-2420;PiloFD 系列中试型冻干机
(SIM) ，GF-1 高速匀浆机(海门市麒麟医用仪器厂) ;
SNB-2 数字粘度计(上海精科) ;BIOFLO-410 型发酵罐
(NBS)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 液体种子的制备［11］
试管菌种经活化，用接种铲挑取试管表面菌丝体
于盛有无菌水的 250 mL 三角瓶中，匀浆机打散，按
10%接种量接种入 250 mL 三角瓶内，28 ℃、150 r /min
振荡培养 4 d。
1. 2. 2 发酵罐液体深层发酵
待三角瓶内形成菌丝球并均匀分散在培养基中
时，将液体种子按 5%接种量接种于 14 L 发酵罐中。
28 ℃，200 r /min，pH值 5. 5，通气量 1 ∶ 1 v /v·m，培养
7 d，放罐。
1. 2. 3 静置发酵
将液体种子按 10%接种量接种于 500 mL 三角瓶
中，先 28 ℃、150 r /min振荡培养 4 d，然后避光静置培
养 2 个星期。用匀浆机将发酵液搅匀，准确测定菌丝
生物量及各活性成分含量。
1. 3 测定方法
1. 3. 1 亮菌干重的测定
取发酵罐的发酵液样品共 9 份，每份 100 mL，4000
r /min离心 20 min，去上清，沉淀用蒸馏水冲洗，重复操
作 2 次收集沉淀，取 9 份中的任意 3 份，80℃烘干至恒
重，电子天平称量菌丝体的干质量。另外 6 份冷冻干
燥制成亮菌菌粉，测定菌粉中多糖和蛋白含量。静置
发酵菌丝体生物量的测定与之相同。
1. 3. 2 多糖含量测定［10，12］
1)热水浸提法提取亮菌粗多糖。发酵罐液体深层
发酵法:称取制得的 1 g 菌粉，加入蒸馏水 300 mL，
80℃下水浴 2. 5 h，不断搅动，防止黏壁。浸提完毕后
冷却至室温，4000 r /min 离心 20 min，收集上清，沉淀
在相同条件下重复浸提 2 次，合并滤液，旋转蒸发
(65℃)浓缩至原液的 1 /6，得亮菌粗多糖提取液。
液体静置法:取发酵完毕后的发酵液 100 mL代替
1 g菌粉，其余操作与发酵罐液体深层发酵法完全相
同。
2)样品多糖含量测定。葡萄糖标准曲线的制备:
精密量取 0. 1 g /L的葡萄糖标准溶液 0、0. 2、0. 4、0. 6、
0. 8 和 1 mL分别置于洁净的具塞试管中，分别加入蒸
馏水补充至 1 mL，依次加入 6%的苯酚 1 mL，再迅速加
入浓硫酸 5 mL，振荡混匀 10 min，冷却至室温静置 20
min，490 nm处比色，测定吸光值。测的多糖标准曲线
的回归方程为 y = 11. 41x + 0. 003(x 为多糖浓度，y 为
OD值) ，回归率 Ｒ2 = 0. 9993。
样品多糖含量测定:向提取的多糖溶液中加入
95%乙醇，使含醇量达到 80%，4℃静置过夜，4000 r /
min条件下离心 20 min得粗多糖，加入蒸馏水复溶，定
容至 1000 mL。苯酚硫酸法测定吸光值，根据标准曲
线计算发酵液中多糖浓度。
1. 3. 3 蛋白质含量测定［11］
1)考马斯亮蓝 G-250 染液的配置:取 50 mg 考马
斯亮蓝 G-250 溶于 25 mL 95%乙醇中，待完全溶解后
加入 50 mL 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至 500 mL。
2)考马斯亮蓝标准曲线的制备:精密量取 100
mg /L的 BSA标准溶液 0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6 和 0. 8 mL，
分别置于洁净的具塞试管中，分别加入蒸馏水补充至
1 mL，各试管中依次加入 5 mL 考马斯亮蓝 G-250 试
剂，595 nm 处比色，测定吸光值。测的考马斯亮蓝标
准曲线的回归方程为 y = 6. 9463x + 0. 0054(x 为蛋白
浓度，y为 OD值) ，回归率 Ｒ2 = 0. 9997。
3)样品中蛋白质含量测定:称取 1 g菌粉(菌粉用
蒸馏水定容至 100 mL)或 100 mL发酵液，4000 r /min ，
29
第 31 卷第 3 期
2014 年 6 月
生 物 学 杂 志
JOUＲNAL OF BIOLOGY
Vol． 31 No． 3
Jun，2014

4℃离心 20 min，破碎细胞，收集上清，沉淀相同条件重
复浸提 2 次，合并滤液，定容至 1000 mL，595 nm 处比
色，测定吸光值，根据标准曲线计算发酵液中蛋白浓
度。
1. 3. 4 亮菌甲素含量的测定［13，14］
1)标准曲线的制备:精密称取 10 mg 亮菌甲素标
准品置 500 mL容量瓶中，以流动相为甲醇和 0. 1 mol /
L乙酸(50 ∶ 50)溶解定容，超声 20 min后，用流动相梯
度稀释成浓度为 0. 125、0. 25、0. 5、1、2 和 4 mg /L 的系
列对照品溶液。分别进样 16 μL，柱温 30℃，检测波长
为 366 nm，测定峰面积积分值。在上述色谱条件下测
定，测的亮菌甲素标准曲线的回归方程为 y = 112. 57x
+ 2978. 8(x为亮菌甲素浓度，y 为峰面积积分值) ，回
归率 Ｒ2 = 0. 9997。
2)样品中亮菌甲素含量的测定:为了进一步的分
析静置发酵液中药效成分亮菌甲素的含量，称取经匀
浆机打散的静置发酵的发酵液 100 mL，超声 15 min，
4000 r /min ，4℃离心 20 min，收集上清，沉淀相同条件
重复浸提 2 次，合并滤液，定容至 1000 mL，取 50 mL置
分液漏斗中加无水乙醇 10 mL，再加 50 mL无水乙醚提
取，收集有机相，水相继续用 50 mL 无水乙醚提取 2
次，合并乙醚液旋转蒸发蒸干，用流动相溶解定容至
10 mL，进样 16 μL，柱温 30℃，检测波长为 366 nm，测
定峰面积积分值。
2 结果与分析
2. 1 发酵罐深层发酵
经发酵罐 7 d 避光培养，测得此时的发酵液粘度
为 746 mPa·S(测定条件:25. 0℃，1#转子，6 r /min) ，
此时发酵液中菌丝呈白色纤维糊状，发酵液呈棕黄色。
发酵液菌丝干重及菌粉中多糖和蛋白含量见表 1。
表 1 发酵罐发酵液组分
Table 1 The components of fermentation broth of fermentor
发酵组分 样品 1 样品 2 样品 3 平均含量
菌丝体干重(g /L) 16. 50 16. 42 16. 73 16. 55
菌粉中多糖(%) 5. 83 5. 15 5. 27 5. 42
菌粉中蛋白(%) 1. 75 1. 96 1. 55 1. 75
由表 1 可知，通过发酵罐液体深层发酵方式所获
得的亮菌生物量平均能达到 16. 55 g /L，且周期短。但
缺点是发酵液颜色不深，发酵程度低，无法像固体发酵
那样菌丝体表层分泌大量棕褐色液体，这可能是由于
液体发酵环境无法为亮菌次级代谢产胞外棕褐色浆液
创造适宜的环境。
2. 2 静置培养发酵
静置发酵 2 周后，发酵液表面形成约 5 mm厚的菌
丝层，且菌丝分泌大量棕褐色液体，发酵液中菌索向下
延伸粗壮且多分支布满整个三角瓶，三角瓶中发酵液
呈胶质半固体形态。称取经匀浆机打散的发酵液 100
mL，4000 r /min 条件下离心 20 min ，沉淀 80℃烘干至
恒重。发酵液组分各项指标见表 2。
表 2 静置培养发酵液组分
Table 2 The components of fermentation broth of static culture
发酵组分 样品 1 样品 2 样品 3 平均值
样品菌丝体干重(g /L) 7. 54 11. 27 13. 26 10. 69
样品多糖含量(g /L) 0. 813 1. 108 1. 128 1. 016
样品蛋白质含量(g /L) 0. 217 0. 342 0. 402 0. 320
样品亮菌甲素含量(mg /L) / 2. 784 3. 451 3. 118
通过表 2 可知，发酵液中多糖含量为 9. 5%，蛋白
质含量为 3. 0%。对比表 1 和表 2，虽然静置发酵得到
的亮菌生物量不及发酵罐液体深层发酵，但其发酵程
度深，培养基利用率高，发酵液中多糖和蛋白含量明显
优于液体深层发酵的发酵结果，同时也优于传统的固
体发酵［11］。
为了进一步的探究静置发酵生产工艺能否取代传
统的亮菌固体发酵生产工艺，本实验室采用 HPLC 法
检测静置发酵液中亮菌甲素的含量(见图 1 和图 2) ，
结果发现发酵液中亮菌甲素含量平均为 3. 118 mg /L。
图 1 亮菌甲素对照品 HPLC色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of armillarisin A reference substance
图 2 样品 HPLC色谱图
Fig 2 HPLC chromatograms of sample
由图 1 和图 2 可以看出，亮菌甲素对照品和供试
品中亮菌甲素的保留时间均在 6. 91 min 左右，峰形较
好。亮菌甲素属于香豆素类衍生物，具有亲脂性，易溶
于乙醚，因此采用乙醚提取纯化，结果显示纯化后的样
39
第 31 卷第 3 期
2014 年 6 月
生 物 学 杂 志
JOUＲNAL OF BIOLOGY
Vol． 31 No． 3
Jun，2014

品中杂质含量较少且对待测物峰无影响［4，14］。
3 小结与讨论
1)通过 14 L发酵罐进行液体深层发酵，发现尽管
能够实现可观的菌丝生物量和较短的发酵周期，但发
酵液颜色不是很深，发酵程度低，发酵液制得的菌粉中
多糖和蛋白含量均较低，无法形成像固体发酵菌丝体
分泌大量棕褐色液体和粗壮多分枝菌索的现象，而能
否大量分泌棕褐色液体是合肥诚志生物制药有限公司
在应用传统的固体发酵工艺生产亮菌口服液制剂中衡
量亮菌发酵质量的一项重要指标，因此本文所采用的
发酵罐液体深层发酵工艺尚需进一步加以研究和探
讨。
2)采用液体静置发酵的方法，观察发现所有三角
瓶都能分泌大量棕褐色液体和形成粗壮多分支的菌
索。该方法大大缩短了发酵周期，且发酵液质量高，杂
质少，提取浓缩简单易行，亮菌多糖等活性成分指标均
优于传统的固体发酵。
综合以上两种发酵方法，液体静置发酵法结合了
传统固体发酵程度深和液体发酵周期短的双重优点，
且在多项技术指标及发酵成本方面均有优越性。此
外，静置发酵法操作简便，无需专门设备，是亮菌制剂
工业生产工艺改进与创新的首选。
参考文献:
［1］卯晓岚．中国大型真菌［M］． 郑州:河南科学技术出版社，2000，
187．
［2］凌庆枝，袁怀波，王妮娜，等．亮菌固态和液体发酵多糖及其醒酒
作用研究［J］．食品科学，2008，29(5) :324 － 326．
［3］沈业寿，马金宝． 亮菌研究的现状与展望［J］． 安徽大学学报，
2007，31(1) :82 － 86．
［4］王 岩．香豆素类利胆药物亮菌甲素的药代动力学研究［D］．长
春，吉林大学，2008．
［5］Nagai K，Tanaka J，Kiho T，et al． Synthesis and antitumor activities
of mitomycin C (1 － 3)-beta-D-glucan conjugate［J］． Chem Pharm
Bull(Tokyo) ，1992，40(4) :986 － 989．
［6］赵戈清，罗 霞，刘高阳，等． 亮菌多糖对 S180 荷瘤小鼠免疫功
能的研究［J］．免疫学杂志，2006，22(3) :146 － 148．
［7］Kiho T． Polysaccharides in fungi． XXIX． structural features of two
antitumor polysaccharides from the fruiting bodies of Armillariella ta-
bescens［J］． Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1992，40(8) :
2212 － 2214．
［8］高 婷，白家峰，罗 霞，等．亮菌粗多糖对小鼠免疫功能的影响
［J］．四川大学学报，2005，42(2) :395 － 398．
［9］敖宗华，符慧子，邹锡良． 大规模液体深层发酵生产亮菌菌丝体
菌粉及其多糖工艺［P］． CN:1596585，2005 － 03 － 23．
［10］敖宗华，陆震鸣，孙军恩，等． 亮菌菌粉和亮菌糖浆品质分析比
较［J］．生物技术通报，2008，4:188 － 190．
［11］宋 淼，王 清，张书祥．假蜜环菌液体种子培养条件的优化及
其应用研究［J］．生物学杂志，2012，29(5) :64 – 67．
［12］董丽辉，范三微，黄贝贝．亮菌液体发酵多糖提取工艺研究［J］．
食品工业，2012，33(10) :4 － 6．
［13］黄赵刚，李绍平，张 平，等． 高效液相色谱法测定亮菌糖浆中
亮菌甲素的含量［J］．药物分析杂志，2003，23(3) :229 － 231．
［14］任惠霞，张 平，程 刚，等． 高效液相色谱法测定亮菌水提液
中亮菌甲素的含量［J］．安徽医药，2012，16(6) :759 － 760．
(上接 112 页)
教育引导学生勇于创新创造，进一步营造尊重创
新、注重创新的良好氛围，加强创新创业教育和训练。
采取导师责任制，让学生自由选择导师，加入感兴趣的
科研课题组，鼓励学生参加挑战杯、创业大赛等各种竞
赛。建立完善的实验室管理制度，对于贵重或易损坏
的实验仪器，安排专人看管，做好实验记录，一定程度
的开放实验室，使实验资源得到更充分、更合理的利
用。
6 结语
通过对生物工程专业实验的教学改革，实验教学
质量大大提升，学生更主动、积极地参与到实验当中，
学生的整体素质普遍提高，培养了学生的创新能力，使
学生具备了独立思考，提出问题，分析问题和解决问题
的能力，提高了学生在就业市场的核心竞争力，这会对
日后学生走出校园，走向社会发挥自身才能奠定了坚
实的基础。当然，在教学改革过程中也遇到了一些问
题和挑战，这就需要我们在进一步探索中完善。
参考文献:
［1］李江华，房 峻，郑飞云，等． 生物工程综合实验教学创新体系
的构建［J］． 实验室研究与探索，2009，28(4) :222 － 224．
［2］荚 荣，尹若春． 生物技术复合应用型人才培养模式的探索与
实践［J］． 生物学杂志，2013，30(1) :103 － 105．
［3］王亚林． 中国生物技术发展的历史、现状及未来［J］． 武汉工业
学院学报，2001(3) :49 － 52．
［4］段德君，梁运祥，陈守文，等． 生物工程实验教学体系改革与实
践［J］． 实验室研究与探索，2011，30(7) :111 － 114．
［5］夏金兰． 生物工程与技术创新人才培养模式的探索与实践［J］．
高等教育研究学报，2009，32(4) :62 － 63．
［6］阳太林． 以学生创新能力的培养为中心改革高校实验教学［J］．
实验技术与管理，2005，22(10) :34 － 38．
［7］赵建华． 实验课程体系建设的系统思考［J］． 高教探索，2005
(3) :58 － 59．
［8］王国强，傅承新． 研究型大学创新实验教学体系的构建［J］． 高
等工程教育研究，2006(1) :125 － 128．
［9］留岚兰． 实验课程设置与创新型人才培养［J］． 实验技术与管
理，2007，24(1) :36 － 38．
［10］戢 峻，户业丽，张佑红． 多媒体技术在工科特色的生物工程
实验教学中的应用［J］． 软件导刊，2011，10(1) :190 － 191．
49
第 31 卷第 3 期
2014 年 6 月
生 物 学 杂 志
JOUＲNAL OF BIOLOGY
Vol． 31 No． 3
Jun，2014
