全 文 ：食用菌学报２０１６．２３（２）：２５～３０
收稿日期：２０１５－０５－１９原稿；２０１５－０８－２１修改稿
基金项目：长春理工大学“大学生创新创业训练计划项目”（２０１２Ｓ４６）资助
作者简介：王　丹（１９９１－），女，中国药科大学药物代谢动力学专业在读硕士。
＊本文通讯作者　Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｙｄ＠ｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．１６４８８／ｊ．ｃｎｋｉ．１００５－９８７３．２０１６．０２．００６
固体基质中羊肚菌菌丝生物量的
ＥＬＩＳＡ双抗体夹心检测法
王　丹１，甄　清２，肖江勇１，马　帅１，王雅文１，王一东１＊
（１长春理工大学生命科学技术学院，吉林长春１３００２２；２吉林大学公共卫生学院，吉林长春１３００２１）
摘　要：为考察羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌａ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）在固体培养基质中菌丝生物量，以液体培养的纯菌丝为标准，用
抗羊肚菌菌丝抗原的鼠源单克隆抗体（Ｃ６Ａ８）及兔源多抗（ＴＭ０２）建立了羊肚菌菌丝生物量的酶联免疫吸附
（ＥＬＩＳＡ）双抗体夹心检测法。该方法检测羊肚菌菌丝生物量的线性范围为２．５８×１０２～６．６×１０４　ｍｇ／Ｌ，线性
回归方程为Ｙ＝０．０９４９　Ｘ－０．０３３８，Ｒ２＝０．９９４３；不同抗原浓度实验反应证明方法具有很好的重现性；这个方
法用于黑脉羊肚菌（Ｍ．ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ）、尖顶羊肚菌（Ｍ．ｃｏｎｉｃａ）、宽圆羊肚菌（Ｍ．ｒｏｔｕｎｄａ）、金针菇
（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、黑木耳（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ　ａｕｒｉｃｕｌａ）、金顶侧耳（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）的反应结果显示
方法对羊肚菌属的供试菌株具有很好的特异性，其它种类的供试菌株不能引发特异的免疫反应。按照方法检
测野生羊肚菌（Ｍ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）子实体周围土样，结果土壤基质中羊肚菌菌丝含量为０．７５ｍｇ／ｇ。
关键词：羊肚菌；ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法；菌丝生物量
羊肚菌（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ）是一种国际知名的珍稀食用菌，它香味独特，含丰富的蛋白质、碳水化合物、多
种维生素及人体必需氨基酸［１－３］，具有抗氧化、抗菌、抗疲劳等营养保健价值，堪称菌中王子［４－５］。目前
羊肚菌还不能实现稳定的人工栽培，价格居高不下，因此实现羊肚菌的人工载培具有巨大的经济价值
和商业前景。培养基质中的食用菌菌丝的生长量是出菇的基本条件［６］，羊肚菌出菇受到诸如菌丝发育
情况、外部条件的刺激等综合因素的影响，在这些影响因素中，菌丝的生长、发育及浓度无疑是关键因
素之一，而对培养基质中羊肚菌菌丝含量的监测方面的研究还未见报道。笔者以纯培养标准羊肚菌菌
丝（５１５８９号菌种）为抗原制备了鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体，以酶标山羊抗鼠免疫球蛋白为抗
抗体，以冷冻干燥的标准羊肚菌菌丝（５１５８９号菌种）质量作为羊肚菌生物量检测计量单位，构建了
ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法羊肚菌菌丝生物量与抗原抗体复合物的底物显色吸光值曲线；将一定量的羊肚菌
标准菌丝与土壤基质混合检测土壤基质对菌丝与抗体反应的影响程度，在此基础上检测了野生羊肚菌
子实体周围土壤中羊肚菌菌丝的生物量，希望为发现野生羊肚菌子实体发生的必要条件和人工栽培羊
肚菌检测基质中菌丝生物量的变化提供检测方法。
１　材料与方法
１．１供试菌株和检测样本
１．１．１供试菌株
　　５１５８９［羊肚菌（Ｍｏｒｅｈｅｌｌａ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）］，５０５３６［黑脉羊肚菌（Ｍ．ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ）］，５０５３７［尖顶羊肚菌
（Ｍ．ｃｏｎｉｃａ）］，５０７５９［宽圆羊肚菌（Ｍ．ｒｏｔｕｎｄａ）］购于北京中国农业微生物菌种保藏中心。
金针 菇 （Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、黑 木 耳 （Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ　ａｕｒｉｃｕｌａ）、金 顶 侧 耳 （Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ
ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）栽培菌种，购于吉林农业大学菌物研究所。
１．１．２野生子实体及其土壤基质样本
　　２０１３年５月于吉林市丰满区采集的野生羊肚菌（Ｍ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ）［原东北师范大学赵大明教授鉴
食　用　菌　学　报 第２３卷
定］子实体及子实体正下方３～１０ｃｍ范围采集３～４ｃｍ见方的完整土样，混合均匀后装入无菌纸袋、
放入保温泡沫盒内，４ｈ内存入实验室－２０℃冰箱保存备用。
１．２试剂与主要仪器
　　（１）ＨＲＰ标记山羊抗兔ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）和ＨＲＰ标记山羊抗鼠ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（北京中杉金桥生物技术有
限责任公司）；（２）ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ公司，美国）；（３）鼠抗羊肚菌单克隆抗体，按文献［７－１０］方法由本实验室
制备并保存，以下简称Ｃ６Ａ８单抗；其它试剂均为国产分析纯试剂。
ＨＺＱ－ＱＸ型恒温振荡培养箱和 ＭＤＦ－１９２型低温冰箱为Ｓａｎｙｏ公司产品；二氧化碳培养箱和
ＦＤＵ１１００小型冻干机为ＥＹＥＬＡ公司产品；ＥＬｘ８００ＴＭ酶标仪为美国伯腾仪器有限公司产品。
１．３检测样品、标准样品的制备和处理
１．３．１供试菌株、野生子实体的检测样品制备
　　将４个供试（５１５８９、５０５３６、５０５３７、５０７５９）羊肚菌菌株及金针菇、黑木耳和金顶侧耳菌株分别接种
于含１５０ｍＬ　ＰＤＢ的２５０ｍＬ三角瓶中，１１０ｒ／ｍｉｎ、２２．５℃培养５ｄ，８９０　ｇ离心５ｍｉｎ收集沉淀菌丝，
同样条件适量ＰＢＳ（ｐＨ　７．４磷酸盐缓冲液）洗涤离心，收取纯培养菌丝；分取～２ｇ菌丝于研钵中，加入
适量ＰＢＳ及海沙研磨２０ｍｉｎ，将研磨后的菌丝及海沙混合物收集到１５ｍＬ离心管中，用适量ＰＢＳ冲洗
研钵后一并收集到离心管中，８９０　ｇ、４℃离心５ｍｉｎ，取上清９８００　ｇ、４℃离心３ｍｉｎ，收取上清（约
５ｍＬ），－２０℃冻存备用。
取１．１．２的野生羊肚菌子实体，按上述方法制备待检样品，－２０℃冻存备用。
１．３．２羊肚菌５１５８９菌株的标准样品制备
　　５１５８９菌株按１．３．１的方法收集ＰＢＳ洗涤后的纯培养菌丝，于冻干机中冷冻干燥至恒重，精密称
取０．３１ｇ菌丝，与～３ｇ无菌海砂与少量ＰＢＳ混合研磨２０ｍｉｎ，将研磨后的菌丝及海沙混合物收集到
１５ｍＬ离心管中，２．４ｍＬ　ＰＢＳ冲洗研钵后一并收集到离心管中，８９０　ｇ、４℃离心５ｍｉｎ，取上清，９８００　ｇ、
４℃离心３ｍｉｎ，收取全部上清（约２．３５ｍＬ，菌丝生物量１．３２×１０５　ｍｇ／Ｌ）。该溶液为制备标准曲线的
标准阳性样品，－２０℃冻存备用。
１．３．３土壤基质样本处理
　　精密称取１．１．３冷冻保存的野生羊肚菌发生地土壤样本１．０２ｇ，加入适量ＰＢＳ及约３ｇ海砂研磨
２０ｍｉｎ，将研磨后的菌丝及海沙混合物收集到５ｍＬ离心管中，用适量ＰＢＳ冲洗研钵后一并收集到离
心管中，８８０　ｇ离心５ｍｉｎ，上清液９８００　ｇ离心３ｍｉｎ，最后得上清１．０ｍＬ，该溶液即为土壤基质中菌
丝含量检测样本，４℃保存待检。
１．４兔抗羊肚菌多克隆抗体制备及抗体效价测定
　　以１．３．１中制备的５１５８９号羊肚菌样品溶液为抗原，颈背部皮下多点注射成年新西兰兔，注射总
量为每只每次１ｍＬ，共注射３次，每次间隔１０ｄ，最后一次注射１０ｄ后颈动脉采血，分离血清，分装，
－２０℃冻存备用。制备的兔抗羊肚菌多抗命名为ＴＭ０２。
按文献［１０］中间接ＥＬＩＳＡ法分别用 ＨＲＰ标记山羊抗兔ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）和 ＨＲＰ标记山羊抗鼠ＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）分别测定兔抗羊肚菌多克隆抗体ＴＭ０２和鼠抗羊肚菌单抗Ｃ６Ａ８的效价，判断抗体的活性。
１．５ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法条件优化与标曲构建
１．５．１ＥＬＩＳＡ方法的建立及实验条件优化
　　根据参考文献［１１－１４］的方法和预实验结果，以Ｃ６Ａ８为包被抗体、冻存的羊肚菌标准样品为检测
的阳性抗原、ＴＭ０２为第一抗体、ＨＲＰ标记的山羊抗兔ＩｇＧ为第二抗体，建立检测羊肚菌（５１５８９号）的
双抗体夹心法，具体操作如下：
（１）酶标板抗体包被：用ｐＨ　９．６的０．０５ｍｏｌ／Ｌ碳酸盐缓冲液稀释Ｃ６Ａ８（原液蛋白浓度为４．６３１
×１０４　ｍｇ／Ｌ）至蛋白浓度为２００ｍｇ／Ｌ，每孔加０．１ｍＬ，４℃过夜后甩去包被液；用含有０．０５％吐温２０
的磷酸盐缓冲液（以下简称ＰＢＳ－Ｔ）洗涤５次，３ｍｉｎ／次，甩干；
（２）加阳性标准样品：阴性对照加入０．１ｍＬ的ＰＢＳ－Ｔ，其余加１％浓度的１．３．２的羊肚菌５１５８９标
准样品０．１ｍＬ，３７℃孵育１ｈ，ＰＢＳ－Ｔ洗涤５次，方法同上；
６２
第２期 王　丹，等：固体基质中羊肚菌菌丝生物量的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心检测法
（３）加第一抗体：每孔各加稀释至蛋白浓度５００ｍｇ／Ｌ的ＴＭ０２（原液蛋白浓度为１．０２６×１０５　ｍｇ／Ｌ）
０．１ｍＬ，３７℃孵育４５ｍｉｎ，ＰＢＳ－Ｔ洗涤５次，方法同上；
（４）加第二抗体：每孔各加１∶５０００稀释的 ＨＲＰ标记的山羊抗兔ＩｇＧ　０．１ｍＬ，３７℃温育４５ｍｉｎ，
洗涤５次，方法同上；
（５）加底物显色、终止反应及检测：在各孔中加入新配制的ＴＭＢ底物显色液（１０ｍｇ的ＴＭＢ溶于
５ｍＬ的ＤＭＳＯ，使用前取１００ｕＬ＋１０ｍＬ底物缓冲液＋１５ｕＬ浓度不少于３０％的 Ｈ２Ｏ２）０．１ｍＬ，
３７℃避光，显色１５ｍｉｎ；再加入２ｍｏｌ／Ｌ的 Ｈ２ＳＯ４溶液０．０５ｍＬ终止反应。用酶标仪检测各孔
４５０ｎｍ处ＯＤ值，实验设４个重复。
１．５．２ＥＬＩＳＡ方法的条件优化
　　保持１．５．１中其它条件不变，先将用于包被的Ｃ６Ａ８由原液分别稀释２５、５０、１００、……２５６００×（其
蛋白浓度分别为１８５０、９２５、４６２ｍｇ／Ｌ……１．８１ｍｇ／Ｌ）后包被酶标板，筛选出最大ＯＤ值对应的最小浓
度的最佳稀释倍数；采用同样方法筛选适当的第一抗体ＴＭ０２和二抗最佳稀释倍数，每个处理设置４
个重复。
１．５．３标准曲线
　　根据１．５．２的优化结果，分别加入稀释２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６和５１２倍的１．３．２中５１５８９菌株
的标准样品，以ＰＢＳ－Ｔ为阴性对照，检测不同样品浓度的ＯＤ值；以ＯＤ值为纵坐标，相应浓度样品换
算成的菌丝生物量对数值为横坐标［１５］，获得５１５８９号菌株菌丝生物量与ＯＤ值对应的标准曲线，实验
设４个重复；用Ｅｘｃｅｌ软件对数据处理进行回归分析，得到线性回归方程及回归系数。
１．５．４检测方法的定量下限、线性范围、重现性及特异性
　　上述步骤建立ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法的标准曲线后，根据实验结果确定定量下限、线性范围等
指标。
选择３个浓度的羊肚菌标准品做检样，每个检样检测３次，对得到的ＯＤ值计算相对标准差，考察
方法的重现性。
用此法对１．３．１中其它供试菌株的菌丝样品和野生羊肚菌子实体样品进行检测，考察方法的特
异性。
１．６土壤基质对检测结果的影响和样品实测
１．６．１土壤基质对检测的影响
　　按照预实验中１６０℃条件会使样品中羊肚菌菌丝中抗原失活的结果，取部分１．１．３中羊肚菌子实
体周围的土壤样本，１６０℃１ｈ烘干加热破坏抗原。
精密称取上述抗原失活土壤样品１．００ｇ，与１．３．２中冻干至恒重的５１５８９号菌株标准菌丝０．２０ｇ
与３ｇ海砂混匀，按１．３．１中方法研磨离心，得到土壤与标准菌丝的混合样品；同样方法获得抗原失活
土壤样品作为检测实验的阴性对照。
将上述两组样品按１．５．３的工作条件直接检测，对照标准曲线方程计算得到土菌混合样品的菌丝
生物量检测值，比较实际加入标准菌丝量，计算检测方法的回收率，分析土壤基质对本方法的影响，实
验设４个重复。
１．６．２野生羊肚菌子实体基质土壤样本的检测
　　取１．３．３的土壤样本，按１．５．２优化方法检测出样品ＯＤ值，经标准曲线方程及方法的回收率计
算得出野生羊肚菌周边土壤中的羊肚菌菌丝生物量，实验设４个重复。
２　结果与分析
２．１抗羊肚菌多抗及单抗效价的测定
　　间接ＥＬＩＳＡ法测得，抗羊肚菌多抗、单抗的效价分别为１∶２．０５×１０４和１∶２．５６×１０３，表明该两种
抗体活性较好，能满足本实验的要求。
７２
食　用　菌　学　报 第２３卷
Ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ（０．３１ｇ）ｗａｓ　ｇｒｏｕｎｄ　ｉｎ　ａ　ｍｏｒｔａｒ　ａｎｄ
ｐｅｓｔｌｅ　ｗｉｔｈ　ｓｅａ　ｓａｎｄ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ），
ｐＨ　７．４，ｍａｋｉｎｇ　ｕｐ　ｔｏ　２．４ｍＬ　ｗｉｔｈ　ＰＢＳ、ａｎｄ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ　ｔｈｅ
ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ（８９０　ｇ，５ｍｉｎ，４℃）ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｃｏａｒｓｅ　ｓｏｌｉｄｓ．
Ｔｈｅ　 ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　 ｆｒａｃｔｉｏｎ　 ｏｂｔａｉｎｅｄ　 ａｆｔｅｒ　 ｆｕｒｔｈｅｒ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ（９８００　ｇ，３ｍｉｎ，４℃）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇ
ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ
图１　ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法检测羊肚菌菌丝曲线
Ｆｉｇ．１　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｆｏｒ　Ｍ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ５１５８９
ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｕｓｉｎｇ　ＥＬＩＳＡ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ｍｅｔｈｏｄ
２．２ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法优化与标准曲线
２．２．１优化的结果
　　实验包被的Ｃ６Ａ８单抗在稀释浓度２５６００×
～１６００×时 ＯＤ值呈递增、８００×时平稳之后呈
下降状态，故选择 Ｃ６Ａ８稀释８００×（蛋白浓度
５７．８８ｍｇ／Ｌ）；同样方法确定ＴＭ０２稀释２００×
（蛋白浓度为５１３ｍｇ／Ｌ），二抗（ＨＲＰ标记羊抗
兔）稀释１００００×。
２．２．２标准曲线
　　以５１５８９号羊肚菌标准菌丝样品的浓度为
横坐标，ＯＤ值为纵坐标作图，建立ＥＬＩＳＡ双抗
体夹心法标准曲线。当标准样品菌丝浓度为
２．５８×１０２～６．６×１０４　ｍｇ／Ｌ之间时，菌丝浓度对
数值与其 ＯＤ值呈良好的线性关系，见图１。对
此进行线性回归分析，线性回归方程为 Ｙ＝
０．０９４９　Ｘ－０．０３３８，Ｒ２＝０．９９４３（图２）。
图２　ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法检测羊肚菌菌丝标准曲线
Ｆｉｇ．２　Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ　ｐｌｏｔ　ｏｆ　ｄａｔａ　ｓｈｏｗｎ　ｉｎ　Ｆｉｇｕｒｅ　１
２．２．３方法的定量下限和检测范围
　　在２．５８×１０２～６．６×１０４　ｍｇ／Ｌ菌丝浓度范
围内，样品浓度与ＯＤ值呈现良好的线性关系，方
法的检测下限为２．５８×１０２　ｍｇ／Ｌ。
２．２．４方法的重现性
　　在检测线性范围内，选择３个浓度（５２８０、
２６４０和１３２０ｍｇ／Ｌ）样品，每个浓度重复测三次，
检测到３个浓度的样品的相对标准差分别为
１．６８％、１．３１％和４．２９％，故该方法具有较好的
重现性。
２．２．５方法的特异性
　　采用方法对供试的４个羊肚菌菌丝、野生羊
肚菌子实体的菌柄和菌盖、另外的黑木耳、金针
菇、金顶侧耳菌丝样品进行检测，结果见表１。检测结果表明此方法对羊肚菌属的几个样品具有良好的
特异性。
表１　ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法的特异性检测
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＥＬＩＳＡ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ｍｅｔｈｏｄ
样品
Ｓａｍｐｌｅ
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７
８
菌柄
Ｓｔｉｐｅ
菌盖
Ｐｉｌｅｕｓ
阴性对照
Ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ
ＯＤ４５０ １．７２　 １．３４　 ０．８４　 １．１６　 ０．１６　 ０．１９　 ０．３　 ０．５６　 ０．６６　 ０．２７
Ｐ／Ｎ　 ６．４（＋）４．９（＋）３．１（＋）４．３（＋）０．６（－）０．７（－）１．１（－）２．１（＋）２．４（＋） １（－）
１～４号样品分别是５１５８９、５０５３６、５０５３７和５０７５９的菌丝体，５号为黑木耳菌丝体样品，６号为金针菇菌丝体样品，７号为金顶侧耳菌丝
体样品，８号为野生羊肚菌子实体样品；Ｐ／Ｎ≧２．１为阳性反应，反之为阴性，分别用＋和－代表
Ｓａｍｐｌｅｓ１ｔｏ　４：ｍｙｃｅｌｉａ　ｏｆ　Ｍ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ　５１５８９，Ｍ．ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ　５０５３６，Ｍ．ｃｏｎｉｃａ　５０５３７，Ｍ．ｒｏｔｕｎｄａ　５０７５９，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｓａｍｐｌｅｓ
５ｔｏ　７：ｍｙｃｅｌｉａ　ｏｆ　Ｆ．ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ、Ａ．ａｕｒｉｃｕｌａ　ａｎｄ　Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｓａｍｐｌｅ　８：ｓｔｉｐｅ　ａｎｄ　ｐｉｌｅｕｓ　ｏｆ　Ｍ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ　ｆｒｕｉｔ
ｂｏｄｙ．Ｐ／Ｎ　ｖａｌｕｅｓ≧２．１ｓｃｏｒｅｄ　ａｓ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｕｌｔ（＋）．ＰＢＳ　ｒｅｐｌａｃｅｄ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
８２
第２期 王　丹，等：固体基质中羊肚菌菌丝生物量的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心检测法
２．３野生羊肚菌子实体基质土壤中菌丝生物量样品实测
２．３．１土壤基质对检测的影响
　　将含有０．２０ｇ冻干标准品的模拟样品１０×稀释作为检样加入酶标孔测定。标准曲线方程为Ｙ＝
０．１８０３　Ｘ＋０．０６３４，Ｒ２＝０．９８２１，实验设６个重复，测得的模拟样本ＯＤ值为：０．７０４±０．００９，方法的测
定值为：０．１５３±０．０２０ｇ，计算得该法的回收率为７６．５％。
２．３．２野生羊肚菌子实体基质土壤样本的检测
　　用已建立的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法检测野生羊肚菌子实体土壤基质检测样本，将样本原液作为检
样加入酶标孔测定，测定检样的 ＯＤ值为０．３００±０．００９（ｎ＝４），标准曲线方程为 Ｙ＝０．０７２８　Ｘ＋
０．０９８５，Ｒ２＝０．９８６１，在回收率为７６．５％的情况下，计算得每克土壤基质中羊肚菌菌丝含量为０．７５０±
０．０１５ｍｇ／ｇ。
３　讨论
　　方法以羊肚菌５１５８９号菌丝制备的单克隆抗体（Ｃ６Ａ８）具有特异性，对羊肚菌属的５０５３６、５０５３７、
５０７５９三个菌株均表现出较好的检测阳性，对木耳、金针菇、金顶侧耳等食用菌菌丝样品的检测为阴性，
不过Ｃ６Ａ８单抗是否可以检测羊肚菌属所有菌种还需要进一步的实验验证。在用此方法进行定量检
测时发现，Ｃ６Ａ８单抗对同样质量的不同种羊肚菌菌丝样品和子实体的菌柄、菌盖的反应强度是不同
的，可否利用Ｃ６Ａ８单抗对应抗原在不同种属的差异来鉴别不同的羊肚菌菌种，也有待于进一步的研
究验证。
在检测土壤模拟样本中的菌丝含量时，模拟样本检测的回收率约在７６．５％，而没有土壤参与反应
的样本检测回收率接近１００％，说明土壤基质中可能含有与抗羊肚菌菌丝抗体非特异性吸附的成分。
笔者对１３年采集的野生羊肚菌子实体发生地的土壤样本进行检测，样本中羊肚菌菌丝含量为０．７５±
０．０１５ｍｇ／ｇ；个人认为这个数据不具备统计学意义，不能代表土壤基质中菌丝含量与出菇量之间的关
系，如果可以预知出菇地点，对土壤中羊肚菌菌丝生物量的消长和子实体发生、生长、成熟的过程进行
监控可能会得到更有意思的结果。
致谢：２０１３年５月在吉林省吉林市丰满区采集到的羊肚菌子实体样本得到了原东北师范大学生物
系教授赵大明先生的确认，在此向赵先生表示衷心的感谢。
参考文献
［１］龙正海．羊肚菌的研究及应用开发前景［Ｊ］．中国生化药物杂志，１９９７，１８（３）：１６０－１６１．
［２］权美平，张丽芳．羊肚菌生物学特征及价值的研究进展［Ｊ］．北方园艺，２０１２，３６（１８）：１７８－１８０．
［３］ＸＵ　Ｈ，ＳＵＮ　ＬＰ，ＳＨＩ　ＹＺ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ
ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｂｉｏｍａｓｓ　ｂｙ　Ｍｏｒｃｈｅｌａ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ　Ａｓ５１６２０［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　Ｊ，２００８，３９（１）：６６－７３．
［４］ＨＥＬＥＮＯ　ＳＡ，ＳＴＯＪＫＯＶＩ　Ｃ
′ Ｄ，ＢＡＲＲＯＳ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ
ａｎｄ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｍｏｒｃｈｅｌａ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ，（Ｌ．）Ｐｅｒｓ．ｆｒｏｍ　Ｐｏｒｔｕｇａｌ　ａｎｄ　Ｓｅｒｂｉａ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓ　Ｉｎｔ，
２０１３，５１（１）：２３６－２４３．
［５］ ＭＥＮＧ　ＦＹ，ＺＨＯＵ　Ｂ，ＬＩＮ　ＲＳ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ
ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｂｙ　Ｍｏｒｃｈｅｌａ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ　ＳＯ－０１［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，１０１（１０１）：４５６４－４５６９．
［６］ＶＡＲＧＡ　ＨＤＬ，ＧＵＥＤＡ　Ｂ，ＭＡＲＴＩＮＥＺ－ＰＥＮＡ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｒａｄｉｃａｌ　ｓｏｉｌ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ａｎｄ
ｅｃｔｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｓ　ｏｆ　Ｂｏｌｅｔｕｓ　ｅｄｕｌｉｓ　ｉｎ　ａ　Ｓｃｏｔｓ　ｐｉｎｅ　ｆｏｒｅｓｔ　ｗｉｔｈ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｐｏｒｏｃａｒｐ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ，２０１２，
２２（１）：５９－６８．
［７］田雪，刘建，孙桦楠，等．以羊肚菌茵丝为抗原的不同免疫程序对Ｂａｌｂ／ｃ鼠抗体水平的影响［Ｊ］．长春理工大学学报
（自然科学版），２０１２，３５（１）：１５６－１６０．
［８］马帅，陈华林，王雅文，等．免疫酶染色法对羊肚菌菌丝特异性靶位的初步定为与分析［Ｊ］．菌物研究，２０１４，１２（６）：
１１５－１１８．
［９］王一东，刘建．一株抗羊肚菌单克隆抗体及其制备方法［Ｐ］．中国，２００９１０２１８１５２．８．２０１０－０６－０９．
９２
食　用　菌　学　报 第２３卷
［１０］徐志凯．实用单克隆抗体技术［Ｍ］．西安：陕西科学技术出版社，１９９２：４２－４６．
［１１］高存福，秦建华，赵月兰，等．牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测方法的建立［Ｊ］．中国兽医科技，２００５，３５
（８）：６２０－６２２．
［１２］穆晞惠，童朝阳，郝兰群，等．双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测相思子毒素［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００７，２３（８）：
７６３－７６６．
［１３］ＡＮＵＲＡＣＰＲＥＥＤＡ　Ｐ，ＣＨＡＷＥＮＧＫＩＲＴＩＫＵＬ　Ｒ，ＴＩＮＩＫＵＬ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｆａｓｃｉｏｌａ　ｇｉｇａｎｔｉｃａ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｕｓｉｎｇ　ａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｂ３ｐｒｏｔｅａｓｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ
Ｔｒｏｐ，２０１３，１２７（１）：３８－４５．
［１４］ＹＯＮＥＤＡ　Ａ，ＫＵＲＯＫＡＷＡ　Ｔ．Ａ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ（１→３）－β－Ｄ－ｇｌｕｃａｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｂｌｏｏｄ［Ｊ］．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，３６５（ｓ１－２）：１５８－１６５．
［１５］ＢＯＲＲＯＭＥＯ　Ｖ，ＢＥＲＲＩＮＩ　Ａ，ＧＲＡＮＤＩ　ＦＤ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ
ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｉｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐｌａｓｍａ［Ｊ］．Ｄｏｍｅｓｔ　Ａｎｉｍ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１４，
４８Ｃ（１）：１４５－１５７．
Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ　Ｍｙｃｅｌｉａｌ
Ｂｉｏｍａｓｓ　ｉｎ　Ｓｏｉｌ　Ｕｓｉｎｇａ　Ｄｏｕｂｌｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ
ＥＬＩＳＡ　Ｓａｎｄｗｉｃｈ
ＷＡＮＧ　Ｄａｎ１，ＺＨＥＮ　Ｑｉｎｇ２，ＸＩＡＯ　Ｊｉａｎｇｙｏｎｇ１，ＭＡ　Ｓｈｕａｉ　１，ＷＡＮＧ　Ｙａｗｅｎ１，ＷＡＮＧ　Ｙｉｄｏｎｇ１＊
（１Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ　１３００２２，Ｃｈｉｎａ；２Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ　１３００２１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）ｓａｎｄｗｉｃｈ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ
Ｍｏｒｃｈｅｌａ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ　ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｂｉｏｍａｓｓ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｉｓ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ａ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ＞０．９９）
ｗａｓ　ｆｉｒｓｔ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｍ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ，ｓｔｒａｉｎ　５１５８９，ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃ６Ａ８）ａｎｄ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＴＭ０２）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　２．５８×１０２　ｍｇ／Ｌ　ｔｏ
６．６×１０４　ｍｇ／Ｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｈｉｇｈ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ（ｓｔｒｏｎｇ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ
ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｏｎｌｙ　ｗｉｔｈ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ａｎｄ　ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｍ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ　５１５８９ａｎｄ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｏｔｈｅｒ　Ｍｏｒｃｈｅｌａ
ｓｐｅｃｉｅｓ）．Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ，ｓｏｉｌ　ｔａｋｅｎ　ｆｒｏｍ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ　ｂｅｌｏｗ　ａ　ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｙ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｃｏｎｔａｉｎ　０．７５ｍｇ／ｇ
ｍｙｃｅｌｉｕｍ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｒｃｈｅｌａ；ＥＬＩＳＡ　ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ｍｅｔｈｏｄ；ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｂｉｏｍａｓｓ
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