全 文 ：［收稿日期］ 20120803(009)
［基金项目］ 全军医学科技“十二五”重大项目(AS11J003)
［第一作者］ 何晓义，硕士研究生，从事中药药理与新产品开发研究，Tel:13817429757，E-mail:hy062412@ 163． com
［通讯作者］ * 葛卫红，教授，博士生导师，从事中药药理与新产品开发，Tel:0571-86633117，E-mail:geweihong@ hotmail． com
木蹄复方体外抗肿瘤作用的实验研究
何晓义1，沈先荣2，刘琼2，蒋定文2，王庆蓉2，葛卫红1*
( 1. 浙江中医药大学 中药体外代谢实验室，杭州 310053;
2. 海军医学研究所 防护医学研究室，上海 200433)
［摘要］ 目的:筛选木蹄复方抗肿瘤活性提取物，初步分析其化学成分并观察其体外抗肿瘤效应。方法:常规水提和醇
提的方法提取复方中水溶和醇溶性组分。MTT法测定木蹄复方水提取物(distilled water extract of compound Fomes fomentarius，
WECF)和木蹄复方乙醇提取物(ethanol extract of compound F． fomentarius，EECF)对体外培养肿瘤细胞 A549，Hela，QGY 生长
的抑制效应。系统预试法分析 WECF 化学组成。流式细胞术检测 WECF 对 A549 细胞凋亡的影响。结果:WECF 对 A549，
Hela，QGY 3 种细胞的 IC50分别为(0. 28 ± 0. 02) ，(0. 40 ± 0. 06) ，(0. 28 ± 0. 05)g·L
－1;EECF对 3 种细胞的 IC50分别为(0. 50 ±
0. 04) ，(0. 50 ± 0. 03) ，(0. 60 ± 0. 06)g·L －1，WECF对肿瘤细胞的生长具有较强的抑制作用。WECF 含有有机酸，氨基酸、多
肽和蛋白质，糖、多糖和苷类，皂苷，内酯、香豆素及其苷类，植物甾醇、三萜成分以及挥发油和油脂，多糖含量为(16. 1 ±
0. 5)%。WECF对 A549，Hela，QGY，DU145，MDA-MB-435S，SGC-7901 6 种细胞的 IC50分别为 0. 29，0. 45，0. 32，0. 32，0. 83，0. 23
g·L －1;WECF 1 g·L －1作用于 A549 24 h后，细胞凋亡率为 22. 0%。结论:WECF具有较强的体外抗肿瘤效果，对多种肿瘤细
胞的生长具有非常明显的抑制作用，并可诱导 A549 细胞凋亡。
［关键词］ 木蹄层孔菌;赤芝;松针层孔菌;复方;抗肿瘤
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)03-0188-04
Antitumor Effect in vitro of Compound Fomes fomentarius
HE Xiao-yi1，SHEN Xian-rong2，LIU Qiong2，JIANG Ding-wen2，WANG Qing-rong2，GE Wei-hong1*
(1. Metabolism Laboratory of Traditional Chinese Medicine，
Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou 310053，China;
2. Department of Radiation Protection Medicine，Navy Medical Research Institute，Shanghai 200433，China)
［Abstract］ Objective:To screen the antitumor extract of compound Fomes fomentarius，detect its
chemical composition preliminarily and evaluate its antitumor activity in vitro． Method:Distilled water or ethanol
was used for extraction of compound F． fomentarius． The MTT assay was used to measure the inhibition effect in
vitro of distilled water extract of compound F． fomentarius (WECF) and ethanol extract of compound F．
fomentarius (EECF)． The system pre-test method was used to detect the chemical composition preliminarily．
Apoptosis of A549 was tested by flow cytometry． Result:The 50% inhibition concentration (IC50)of WECF to
A549，Hela and QGY were (0. 28 ± 0. 02) ，(0. 40 ± 0. 06) ，(0. 28 ± 0. 05)g·L －1 respectively，and to EECF，
the IC50 were (0. 50 ± 0. 04) ，(0. 50 ± 0. 03) ，(0. 60 ± 0. 06)g·L
－1 respectively． There were organic acid，
amino acid，peptides and proteins，sugar，polysaccharide and nucleoside，saponins，lactone，coumarone and
nucleoside，plant sterol and terpene composition，volatile oil and grease in WECF． The polysaccharide content of
WECF was (16. 1 ± 0. 5)% ． The IC50 of WECF to A549，Hela，QGY，DU145，MDA-MB-435S and SGC-7901
were 0. 29，0. 45，0. 32，0. 32，0. 83，0. 23 g·L －1 ． 22. 0% of totle cells apoptosis after A549 treating with WECF
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第 19 卷第 3 期
2013 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 3
Feb．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.03.064
at 1 g·L －1 for 24 h． Conclusion:WECF showed higher antitumor activity in vitro compared with EECF and has
significant inhibitory effect to a variety of tumor cells，further investigation revealed that WECF exerted an antitumor
activity via apoptosis-induced cell death and maybe developed as a new antitumor medicine．
［Key words］ Fomes fomentarius;Ganoderma lucidum;Phellinus igniarius;compound;antitumor
抗肿瘤作用是药用真菌重要的功效之一［1］，其
中木蹄层孔菌又名火绒层孔菌，为多孔菌科、层孔菌
属药用真菌，具有显著的抗肿瘤作用，可用于治疗各
种肿瘤，如食管癌、胃癌、子宫癌等［2］，其抗肿瘤机
制主要为细胞毒作用［3］。松针层孔菌又名松木层
孔菌，为多孔菌科、层孔菌属药用真菌，其抗肿瘤机
制主要是防止肿瘤复发和转移［4］。赤芝为多孔菌
科、灵芝属药用真菌［5］，其抗肿瘤主要机制是提高
机体免疫功能［6］。本研究首次把具有不同抑瘤作
用机制的 3 个药用真菌组成复方，期望通过木蹄层
孔菌对肿瘤细胞的杀伤祛邪作用，赤芝提高机体免
疫力的扶正作用，以及松针层孔菌防止肿瘤复发和
转移的作用，达到对肿瘤有效的防治作用。本文通
过水提和醇提工艺研究，确定抗肿瘤活性部位提取
工艺，并对其体外抗肿瘤作用进行初步研究。
1 材料
1. 1 细胞系 人肺腺癌细胞 A549、人肝癌细胞
QGY、人宫颈癌细胞 Hela、人前列腺癌细胞 DU145、
人乳腺癌细胞 MDA-MB-435S 和人胃癌细胞 SGC-
7901 购自中国科学院上海生命科学研究院。
1. 2 药物与试剂 药材木蹄层孔菌、松针层孔菌和
赤芝购自北京同仁堂，经海军医学研究所沈先荣研
究员分别鉴定为多孔菌科、层孔菌属药用真菌木蹄
层孔菌 Fomes fomentarius(L． ex． Fr．)Kickx． 和松针
层孔菌 Phellinus igniarius (L． ex． Fr．)Quel． 以及赤
芝 Ganoderma lucidum (Leyss． ex． Fr)Karst． 的干燥
子实体，按质量比 4∶ 2∶ 1组成复方。RPMI 1640 干粉
培养基(Gibco 公司，581283) ;小牛血清(浙江天杭
生物科技有限公司，100701) ;噻唑蓝(MTT) (Sigma
公司，MKBB1495) ;碘化丙啶 (PI，Sigma 公司，
P4170) ;其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学
试剂有限公司。
1. 3 仪器 CO2 恒温培养箱和酶标仪(Thermo 公
司) ;流式细胞仪(BD公司)。
2 方法
2. 1 木蹄复方提取物制备
2. 1. 1 水提取物 按比例称取 105 g 复方药材，粉
碎，加水，100 ℃加热回流提取 3 次，每次 2 h，料液
比分别为 1∶ 20，1∶ 15 和 1∶ 10，过滤，合并滤液，4 ℃
静置 24 h，9 000 r·min －1离心 30 min，上清液减压浓
缩约 15 倍体积，真空干燥，即得 WECF。
2. 1. 2 乙醇提取物 按比例称取 105 g 复方药材，
粉碎，加 95%乙醇，85 ℃水浴回流提取 3 次，每次
1. 5 h，料液比分别为 1∶ 15，1∶ 10 和 1∶ 5，过滤，合并
滤液，9 000 r·min －1离心 30 min，上清液减压浓缩约
15 倍体积，真空干燥，即得 EECF。
2. 2 木蹄复方提取物抑制肿瘤细胞生长的测定
采用 MTT 法［7］，以对数生长期细胞 A549，Hela 和
QGY为实验对象，将消化计数的单细胞悬液 190 μL
接种于 96 孔培养板中，每孔 3 000 个细胞，待细胞
贴壁后加 10 μL不同浓度的提取物，对照组分别加
等量的提取物溶解介质，继续培养 48 h。轻轻倒掉
培养液，每孔加 150 μL PBS 洗涤 1 次，然后加 100
μL 0. 5 g·L －1的 MTT溶液，继续培养 4 h 后弃去上
清，加 150 μL DMSO，振荡 10 min，在酶标仪 570 nm
波长处读取吸光度(A)。
2. 3 WECF化学组成及多糖含量测定
2. 3. 1 系统预试法分析 WECF 化学组成［8-9］ 试
管预试法:向盛有供试液的试管中加入相关试剂，根
据颜色、沉淀、荧光等反应现象判断某化学成分的存
在;圆形滤纸层析法:用毛细点样管吸取供试液在圆
形滤纸上点样，待干后使乙醇从中心展开，待乙醇挥
发后，喷以不同显色剂。根据出现的颜色、斑点或产
生的荧光等现象判断某化学成分的存在。
2. 3. 2 WECF多糖含量测定 采用硫酸蒽酮法［4］。
2. 4 WECF抑制肿瘤细胞生长的测定 以对数生
长期细胞 A549，Hela，QGY，DU145，MDA-MB-435S
和 SGC-7901 为实验对象，细胞处理及检测方法
同 2. 2。
2. 5 流式细胞术检测细胞凋亡情况［10］ 取对数生
长期细胞 A549，将消化计数的单细胞悬液 1. 9 mL
接种于 6 孔板中，每孔 1. 5 × 105 个细胞。待细胞贴
壁后加入不同浓度的 WECF，对照组加等量的无血
清的 RPMI1640 培养基，培养 24 h 后收集上清液，细
胞用预冷的 PBS 洗 2 次，用胰酶消化打匀后收集细
胞，预冷的 PBS 洗 2 次，细胞用含 2%小牛血清的
PBS悬浮，加 PI 染料，冰上避光作用 5 min，用流式
细胞仪检测细胞凋亡情况。
·981·
何晓义，等:木蹄复方体外抗肿瘤作用的实验研究
2. 6 统计学处理 实验结果以 珋x ± s 表示，经 SPSS
17. 0 统计软件处理并进行 t 检验和单因素方差分
析，以 P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
3 结果
3. 1 木蹄复方提取物制备 105 g 复方药材采用水
提和醇提的方法，提取物分别称重得 6. 92 g 和
5. 99 g，提取率为水提法 6. 59%，醇提法 5. 70%。
3. 2 木蹄复方抗肿瘤提取物筛选 WECF 对
A549，Hela，QGY 3 种细胞的 IC50分别为(0. 28 ±
0. 02) ，(0. 40 ± 0. 06) ，(0. 28 ± 0. 05)g·L －1;EECF
对 3 种细胞的 IC50分别为(0. 50 ± 0. 04) ，(0. 50 ±
0. 03) ，(0. 60 ± 0. 06)g·L －1，结果表明 WECF 具有
较强的体外抗肿瘤效果。
表 2 水提物对多种肿瘤细胞生长的抑制作用(珋x ± s，n = 3)
药物终质量浓度 / g·L －1
A570 nm
A549 Hela QGY DU145 MDA-MB-435S SGC-7901
0 0. 68 ± 0. 06 0. 63 ± 0. 02 0. 50 ± 0. 04 0. 76 ± 0. 04 0. 55 ± 0. 01 0. 87 ± 0. 03
0. 125 0. 59 ± 0. 021) 0. 58 ± 0. 031) 0. 47 ± 0. 04 0. 78 ± 0. 02 0. 59 ± 0. 03 0. 70 ± 0. 022)
0. 25 0. 35 ± 0. 042) 0. 48 ± 0. 032) 0. 27 ± 0. 062) 0. 69 ± 0. 04 0. 57 ± 0. 03 0. 43 ± 0. 022)
0. 5 0. 11 ± 0. 012) 0. 30 ± 0. 032) 0. 09 ± 0. 012) 0. 50 ± 0. 022) 0. 57 ± 0. 04 0. 12 ± 0. 002)
1 0. 10 ± 0. 002) 0. 10 ± 0. 032) 0. 08 ± 0. 002) 0. 20 ± 0. 022) 0. 18 ± 0. 062) 0. 12 ± 0. 002)
DDP(0. 02) 0. 11 ± 0. 012) 0. 10 ± 0. 022) 0. 10 ± 0. 002) 0. 11 ± 0. 002) 0. 14 ± 0. 022) 0. 14 ± 0. 002)
注:与对照组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01。
3. 3 WECF化学组成及多糖含量
3. 3. 1 WECF化学组成 系统预试法检测 WECF
化学成分结果如表 1 所示，WECF中含有有机酸，氨
基酸、多肽和蛋白质，糖、多糖和苷类，皂苷，内酯、香
豆素及其苷类，植物甾醇、三萜成分以及挥发油和油
脂。可能含有酚性成分，黄酮及其苷类以及蒽醌及
其苷类。
表 1 WECF化学组成系统预试
项目 A(试管法) B(圆形滤纸法)
酚性成分 － －
有机酸 + +
鞣质 － －
生物碱 + －
氨基酸、多肽和蛋白质 + －
糖、多糖和苷类 + +
皂苷 + +
黄酮及其苷类 － +
内酯、香豆素及其苷类 + +
植物甾醇、三萜成分 + +
蒽醌及其苷类 － +
挥发油、油脂 + +
注:“ +”代表阳性反应;“ －”代表阴性反应。
3. 3. 2 WECF 多糖含量 木蹄复方水提取工艺确
定后，提取 3 批样品，硫酸蒽酮法测定其多糖含量，3
批样品多糖含量为(16. 1 ± 0. 5)%，均在 15. 6%
以上。
3. 4 流式细胞术分析 WECF 对细胞凋亡的影响
本研究选取其中一株抑瘤率较高的肿瘤细胞 A549
作为研究对象，检测了 WECF 对其凋亡和周期的影
响。结果显示:WECF 1 g·L －1作用于 A549 24 h后，
细胞出现明显的凋亡(图 1) ，而其对周期抑制并不
明显(结果未呈现) ，这提示 WECF可能主要通过促
进肿瘤细胞凋亡来发挥其抑瘤效果。
3. 5 WECF 对多种肿瘤细胞生长的抑制作
用 WECF对 A549，Hela，QGY，DU145，MDA-MB-
435S，SGC-7901 6 种肿瘤细胞的生长均具有显著的
抑制作用，并有明显的剂量依赖关系。对 A549，
Hela和 SGC-7901 细胞的抑制作用较强，在质量浓
度 0. 125 g·L －1时就有显著抑制作用(P ＜ 0. 05，P ＜
0. 01) ;对 MDA-MB-435S 细胞抑制作用较弱，在 1
g·L －1时才表现为非常显著的抑制作用(P ＜ 0. 01)。
WECF对 6 种肿瘤细胞的 IC50分别为 0. 29，0. 45，
0. 32，0. 32，0. 83，0. 23 g·L －1，结果提示 WECF 在体
外具有较强的抗肿瘤作用。见表 2。
图 1 WECF对细胞凋亡的影响
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第 19 卷第 3 期
2013 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 3
Feb．，2013
4 讨论
近十几年来药用真菌的抗肿瘤活性越来越多的
被人们关注，对灵芝的抗肿瘤作用研究较多，对木蹄
层孔菌和松针层孔菌的研究相对较少且主要集中在
单味药方面，本研究首次把木蹄层孔菌、松针层孔菌
和赤芝组成复方进行抗肿瘤作用的研究。通过对复
方进行常规水提和醇提，发现 WECF 较 EECF 具有
非常显著的体外抗肿瘤效果，对多种肿瘤细胞的生
长都有不同程度的抑制作用。
细胞的凋亡同肿瘤有着密切的关系，促进细胞
凋亡是抗肿瘤药物抑瘤作用机制之一。很多中药提
取物可促进肿瘤细胞凋亡，青蒿琥酯和山绿茶提取
物可使细胞形成 G1 期阻滞，促进肿瘤细胞凋亡，从
而抑制肿瘤细胞增殖［11-12］。本研究发现 WECF 在
高浓度(1 g·L －1)时和对照组比可明显促进肿瘤细
胞凋亡，提示其可能是通过促进细胞凋亡来实现抑
瘤作用的，但 WECF 对周期抑制并不明显，对其促
进肿瘤细胞凋亡和抑瘤作用机制有待进一步研究。
中药及其复方是一个复杂的体系，化学成分复
杂，一般是由多个不能单独起治疗作用的弱小成分
共同起作用。多糖和三萜类是药用真菌抗肿瘤作用
的主要活性成分，已知多糖是水溶性提取物中最主
要的活性成分，本研究检测了 WECF 中多糖的含
量。本研究通过体外抑瘤试验在细胞水平上初步筛
选出复方具有抗肿瘤作用的提取物，为进一步研究
和抗肿瘤新药的研发提供了基础。但 WECF 成分
复杂，应进一步分离纯化以期得到抗肿瘤活性更好
的组分和明确其药理作用的物质基础，还应进行体
内抗肿瘤作用的研究。
［参考文献］
［1］ 王谦，贾震． 药食用真菌的药理作用研究进展［J］．医
学研究与教育，2010，27(5) :67．
［2］ 卯晓岚，蒋长坪，欧珠次忘．西藏大型经济真菌［M］．
北京:北京科学技术出版社，1993:464．
［3］ 赵继鼎．中国真菌志(第三卷) ［M］． 北京:科学出版
社，1998:124．
［4］ 黄年来．中国大型真菌原色图鉴［M］． 北京:中国农
业出版社，1998:73．
［5］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典．一部［S］．北
京:中国医药科技出版社，2010:174．
［6］ 林志斌．灵芝的抗肿瘤作用机制［J］．基础医学与临
床，2000，20(5) :391．
［7］ Wei Yan-lin，Lei X U，Liang Yun，et al． Berbamine
exhibits potent antitumor effects on imatinib-resistant
CML cells in vitro and in vivo［J］． Acta Pharmacologica
Sinica，2009，30(4) :451．
［8］ 中国医学科学院药物研究所． 中草药有效成分的研
究(第一分册)提取、分离、鉴定和含量测定［M］． 北
京:人民卫生出版社，1972:11．
［9］ 杨义芳，孔德云．中药提取分离新技术［M］．北京:化
学工业出版社生物·医药出版分社，2010，26．
［10］ Zhen Yong-zhan，Lin Ya-jun，Li Yi，et al． Lidamycin
shows highly potent cytotoxic to myeloma cells and
inhibits tumor growth in mice［J］． Acta Pharmacologica
Sinica，2009，30:1025．
［11］ 黄伟炜，刘宁，牛红军． 青蒿琥酯对人结肠癌细胞
HCT-8 细胞凋亡和细胞周期的影响［J］．中国实验方
剂学杂志，2012，18(11) :225．
［12］ 李洪亮，徐仙赟，孙立波，等．山绿茶中 Ilexgenin A 对
HepG2 肿瘤细胞抑制作用的研究［J］．中国实验方剂
学杂志，2012，18(15) :238．
［责任编辑 聂淑琴］
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何晓义，等:木蹄复方体外抗肿瘤作用的实验研究