全 文 ：食用菌学报C2007. 14(2):15～ 18
收稿日期:2006-11-10 原稿;2007-02-14 修改稿
作者简介:沈　洪(1981 -), 男 ,南京农业大学微生物学真菌遗传与育种专业在读硕士研究生。
*本文通讯作者
文章编号:1005 - 9873(2007)02 - 0015 - 04
云南羊肚菌 rDNA的 ITS序列与亲缘关系分析
沈　洪1 , 2 , 陈明杰1* , 赵永昌3 , 潘迎捷4
(1上海农业科学院食用菌研究所 , 上海市农业遗传育种重点开放实验室 , 上海 201106;
2南京农业大学 ,南京 210095;
3云南省农业科学院生物技术资源研究所 , 昆明 650205;4上海水产大学 , 上海 200090)
摘　要:采用 ITS(Inte rnal T ranscribed Spacer s)序列比对技术分析了根据形态挑选的 14 个羊肚菌子实体(其
中 11 个来自云南 , 3个来自浙江) 。结果表明 ,云南的 11 个羊肚菌子实体(M 1 ～ M 11)可分为 4 个种:高羊肚
菌(Morchella elata),尖顶羊肚菌(Morche lla conica), 粗柄羊肚菌(Morchella crassipes)和大孔(宽肋)羊肚菌
(Morchella costata)。浙江的 3 个羊肚菌子实体(M 12 ～ M 14)经鉴定为未知羊肚菌种。14 个羊肚菌子实体样品
和 GenBank 中黑脉(小顶)羊肚菌 [ Morchella angusticeps(AJ698476)] 、美味羊肚菌 [ Morchella esculenta
(AJ698475)] 以及羊肚菌科常见属钟菌属 Verpa conica(AJ544206)的 ITS 序列聚类 ,以钟菌(AJ544206)作为外类
群, 可分为三大聚类群:高羊肚菌 、大孔(宽肋)羊肚菌和黑脉(小顶)羊肚菌为第 1 类群(Group 1);美味羊肚菌和
尖顶羊肚菌为第 2类群(Group 2);粗柄羊肚菌和浙江的 3个羊肚菌为第 3 类群(Group 3)。
关键词:羊肚菌;Inte rnal T ranscribed Spacer s 序列;相似性
中图分类号:S646. 701　　　　文献标识码:A
　　羊肚菌隶属于子囊菌亚门(A scomycot ina),
盘菌纲(Discomycetes),盘菌目(Pezizales),羊肚
菌科(Morchellaceae),羊肚菌属(Morchel la)。羊
肚菌以其菌盖表面生有许多小凹坑 ,外观极似羊
肚而得名 ,是一种野生名贵食药用菌 ,其风味独
特 ,营养丰富 ,具有一定的保健作用[ 1] 。
中国目前已知的羊肚菌有 8 个种[ 2] , 分别
是:黑脉(小顶)羊肚菌(Morchel la angust iceps
Peck),尖顶羊肚菌(M. conica Fr.),粗柄羊肚菌
(M. crassipes),小羊肚菌(M. del iciosa),开裂羊
肚菌(M. diatans),高羊肚菌(M. elata Fr. ),美
味羊肚菌 [ M. esculenta(L.)Pers. ]和硬羊肚菌
(M. rigida)。其中云南的羊肚菌有 4个种 ,分
别是黑脉(小顶)羊肚菌 ,尖顶羊肚菌 ,高羊肚菌
和美味羊肚菌 [ 3] 。
传统的羊肚菌分类鉴定主要依据羊肚菌子
实体 、菌丝 、子囊 、子囊孢子及侧丝的形态特征 ,
而子实体因不同发育阶段的形态特征不稳定 ,因
此根据羊肚菌子实体的形态分类一直处于意见
分歧当中[ 4-6] 。
近年来 , DNA 序列分析已广泛用于各类真
菌的分类鉴定研究 ,其中 ITS 序列研究应用最为
广泛 。本研究主要应用 rDNA 的 I TS 序列分析
技术对我国云南省迪庆州 、丽江市 ,以及浙江松
阳县等地的野生和半人工栽培的羊肚菌菌株进
行分类鉴定。
1　材料方法
1. 1 供试样品
　　供试羊肚菌样品 M 1 、M2和 M3采自海拔
2700 m的云南迪庆州霞若乡施坝村;M 4 、M5 、
M6 、M7和 M8采自海拔 2580 m 的云南丽江鲁甸
镇羊肚菌保护扩繁基地示范区;M 9 、M10和 M 11采
自海拔 2350 m 的云南丽江鲁甸镇东海村;M12 、
M13和 M14采自海拔 205 m 的浙江松阳县西屏镇
桥头村。14个羊肚菌样品的子实体形态见图 1
(封三)。
1. 2 子实体 DNA提取
　　DNA 提取方法同 LETS 法[ 7] ,略加修改 。
采用苯酚∶氯仿(1∶1),氯仿 ∶异戊醇(24∶1)
抽提样品 , DNA 经无水乙醇沉淀和 70%乙醇洗
涤后 ,用 50μL TE 缓冲液[ 10 mM Tris-HCl(pH
食　用　菌　学　报 第 14 卷
7. 5)and 1 mM EDTA ] , 加 1 μL RNA 酶溶解
DNA ,37 ℃温浴 1 h去除 RNA 。
1. 3 ITS区扩增
　　采用真菌核糖体基因间隔区通用引物 I TS1
和 I TS4进行扩增 。 ITS1 :5’-TCCG T AGGTG
AACCT GCGG-3’ 和 I TS4 :5’-TCCTC CGCT T
AT TGA TATGC-3’ 由上海赛百盛(SBS)公司合
成。扩增反应条件为:25 μL 反应体系中含
16. 5 μL双蒸水 , 2. 5 μL 10×PCR反应缓冲液 ,
2μL M gCl2 ( 25 mmol /μL ), 0. 3 μL dNTP
(10 mmol /μL), 0. 5 μL ITS1 (25 pmol /μL ),
0. 5 μL ITS4(25 pmol /μL),0. 2 μL Taq DNA聚
合酶(5 U /μL)以及 50 ng 模板 DNA 。扩增反应
在BIO-RAD公司的 PCR仪 PTC-200上进行 ,扩
增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min ,
61 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸1 min ,共 35个循环;
最后 72 ℃延伸 10 min 结束反应。PCR扩增产
物采用琼脂糖凝胶电泳检测 ,取 5 μL 的 PCR产
物 ,用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测 、分离扩增产
物;EB染色 ,于 Pharmacia VDS 凝胶成像系统
下拍照记录电泳结果 。
1. 4 ITS扩增产物的序列测定
　　PCR扩增产物经 DNA 凝胶回收试剂盒(上
海 Axygen公司)回收纯化后 ,将扩增产物连接到
PGEM-T Easy Vecto r(美国 Promga 公司)载体
上转化大肠杆菌 ,转化子委托上海英俊生物公司
测序 ,测得其全序列 ,通过 DNAStar 软件包中的
Editseq处理 ,得到 I TS片段序列信息。
1. 5 ITS序列分析
　　通过 BLAS Tn搜索 ,将测得序列与GenBank
中已知羊肚菌的序列进行比对 ,找出最大相似性
的种类 ,以此判断所采集的羊肚菌样品的种类 ,
或鉴定其是否为新发现的种类 。
2　结果与分析
2. 1 羊肚菌属的 ITS片段的长度和序列变异分析
　　WIPF 等对羊肚菌属的 ITS 多态性进行了
研究 , 发现美味羊肚菌和尖顶羊肚菌的 ITS 长度
分别在 740 ～ 750 bp 和 1150 ～ 1220 bp 之间[ 8] 。
而本试验所采集的 14 个羊肚菌子实体样品中 ,
有 10个样品的 ITS 序列在 737 bp 左右 ,有 4个
样品的 I TS序列在 1226 bp左右(图 2),与WIPF
报道的结果基本相符 。
　　通过 BLASTn 搜索和 DNAStar 软件包中的
MegAlign处理结果发现 ,在 14个羊肚菌子实体样
品的 ITS序列中 , M1 、M2 、M6 、M8和 M11与高羊肚
菌(AJ698477)序列的相似性最大 ,一致度为98. 2%
～ 99. 7%;序列间分化为 0. 3%～ 1. 6%(表 1)。
图 2　PCR 扩增得到的 ITS片段的电泳检测图
Fig. 2　Agarose gel electrophoresis of amplified ITS fragments
表 1　5 个羊肚菌样品与高羊肚菌(AJ698477)之间的一致度与分化度1)
Table 1　Identity and divergence values for rDNA ITS sequences from samples M1 ,M2 ,M6 , M11 and
Morchella e lata (AJ698477)
样品 Sample AJ698477 M 1 M 2 M 6 M 8 M 11
AJ698477 99. 7 98. 2 99. 7 99. 7 99. 7
M 1 　 0. 3 98. 2 100. 0 99. 7 99. 7
M 2 　 1. 6 1. 6 98. 4 98. 6 98. 2
M 6 　 0. 3 0. 0 1. 6 99. 7 99. 7
M 8 　 0. 3 0. 3 1. 4 0. 3 99. 7
M 11 　 0. 3 0. 3 1. 6 0. 3 0. 3
　　1)下三角为序列间分化度 , 上三角为一致度(%)
　　Diverg ence and identity values(%)of rDNA ITS sequences are show n in the lower and upper triang les , respectively
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第 2 期 沈　洪 ,等:云南羊肚菌 rDNA 的 ITS 序列与亲缘关系分析
　　M 3 、M4与大孔(宽肋)羊肚菌(DQ257334)
的相似性最大 , 一致度分别达到 99. 6%和
99. 9%;序列间分化度分别为 0. 3%和 0. 1%。
M5 、M7 、M10与尖顶羊肚菌(AJ544198)的相
似性最大 ,一致度达到 100%、 99. 9%和 99. 9%
以上;序列间分化度为 0%、 0. 1%和 0. 1%。
M9 、M12 、M13 、M14与粗柄羊肚菌(A J623265)
的相似性较大。其中 M9与其序列完全相同 ,
M12 、M13和 M14采自于浙江同一地点 ,他们之间
的相似度在99%以上 ,与粗柄羊肚菌(AJ623265)
序列的一致度分别为 88. 3%、 88. 2%和 88. 2%;
序列间分化度分别达到 10. 4%、10. 5%和10. 5%,
存在较大的差异 。
5. 8S rDNA 两侧的 ITS-1 和 ITS-2 的界限
根据已知羊肚菌属的 rDNA 序列确定。比对的
结果表明 ,所采的 14个羊肚菌子实体样品中 ,已
知的有 4 个种———高羊肚菌 、尖顶羊肚菌 、大孔
(宽肋)羊肚菌和粗柄羊肚菌。除高羊肚菌(M2)
ITS区的长度为 740 bp , ITS-1区有 3个插入碱基
外 ,其余高羊肚菌(M1 、M6 、M8和 M11)整个 ITS 区
的长度为 737 bp , ITS-1的长度为 214 bp , ITS-2的
长度为 279 bp ,5. 8S 的序列长度为 155 bp ,28S 的
序列长度为 57 bp , 碱基变异集中在 ITS-1 和
ITS-2。
M9 、M 12 、M13和 M 14整个 ITS 区的长度为
1226 bp , ITS-1的长度为608 bp , I TS-2的长度为
371 bp ,5. 8S 的序列长度为 155 bp , 28S 的序列
长度为 57 bp 。M 9为粗柄羊肚菌 , M12 、M 13 、M14
与粗柄羊肚菌(AJ623265)序列之间存在很大的
差异 ,即使是很保守的 5. 8S 区也存在很大的差
别 ,155 bp的 5. 8S 中 ,有 51个位点不一样。
由此可看出 ,羊肚菌的 ITS 片段长度主要为
737 bp和1226 bp左右 ,在长度上具较好的保守性。
从GenBank中选取本次未采集到的羊肚菌属
的黑脉(小顶)羊肚菌(AJ698476)和美味羊肚菌
(AJ698475)的 ITS序列一起进行分析 ,结果见表 2。
表 2　三个羊肚菌样品与黑脉(小顶)羊肚菌(AJ698476)和美味羊肚菌(AJ698475)ITS序列间的一致度与分化度1)
Table 2　Identity and divergence values for rDNA ITS sequences from M1 ,M3 , M5 ,
M. angusticeps(AJ698476) and M. esculenta(AJ698475)
样品 Sample M 1 M 3 M 5 AJ698476 AJ698475
M 1 98. 5 94. 6 99. 5 94. 4
M 3 1. 5 95. 0 98. 2 94. 7
M 5 5. 4 4. 9 93. 9 96. 3
AJ698476 0. 5 1. 8 5. 7 94. 2
AJ698475 4. 8 4. 7 3. 6 5. 1
　1)下三角为序列间分化度 , 上三角为一致度(%)
　Dive rgence and identity v alues(%) o f rDNA ITS sequences are show n in the low er and upper triang les , respectiv ely
　　1)分枝上的数值是 1000次重复记算的仿真值(%)
Numbers on the branches are boo tstrap values from 1000 replicates(%)
图 3　羊肚菌的聚类分析树状图1)
Fig. 3　Dendrogram based on ITS sequence analysis of Morchella
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食　用　菌　学　报 第 14 卷
2. 2 ITS序列的聚类分析
　　采用 Clustal X(1. 81)对序列进行自动排
列 ,以羊肚菌科常见属钟菌属的 Verpa conica
(AJ544206)作为外类群 ,根据 UPGMA 法找
出最大简约树 ,并以自展(boo tst rap)分析法
进行检验 ,共循环 1000 次 ,建立基于 ITS 序
列的聚类分析树状图 ,结果将供试菌株分成
三大聚类群。
从图 3 可 以看 出 , 以 Verpa conica
(AJ544206)作为外类群 ,采集的 14个羊肚菌
子实体样品与 GenBank中的黑脉(小顶)羊肚
菌(AJ698476)和美味羊肚菌(AJ698475),可
分为三大聚类群。BUN TARD 等认为 ,黑脉
(小顶)羊肚菌 、尖顶羊肚菌与高羊肚菌也可
能属于同一生物学种的早 、中 、晚三个系统演
化阶段[ 9] 。从表 2和图 3 都可以看出 ,黑脉
(小顶)羊肚菌 、高羊肚菌和尖顶羊肚菌 ,由于
其序列间高度的一致性 ,遗传关系非常接近。
3　讨论
　　通过 ITS 序列的分析发现 ,羊肚菌属不
同种的 ITS 序列差别较小 ,一般只有几个碱
基不同;聚类树比较表明 ,几个种之间甚至出
现相互交叉;形态上有时也很难将有些种区
分清楚 ,可能是羊肚菌某些种之间的差异确
实很小 ,或者说羊肚菌属各个种的分类并不
规范 ,存在很大的缺陷 , 需要做更系统的分
类 ,最终规范对羊肚菌资源的命名 。
浙江的羊肚菌样品 M12 、M 13和 M 14可能
是一个尚未被报道的新种 , 与其它羊肚菌的
ITS序列差异主要发生在 5. 8S 区 ,是否地域
差别所造成 、或者说本身就存在这一差异 ,还
需要作进一步深入地研究 , 这对于丰富目前
已知的羊肚菌资源库 ,了解我国存在的羊肚
菌种类具有很大的意义。
对传统的羊肚菌种的形态分类确实存在
一定的争议。随着分子生物学技术的应用和
发展 , rDNA ITS 的 PCR-RFLPs 分析 、IGS
分析[ 10] 和 rDNA ITS 序列测定[ 8] 等方法的应
用 ,为羊肚菌属系统学研究提供了新的思路
和新的平台。将传统的生态学 、形态学等方
法与分子生物学研究方法的相结合 ,最终规
范对羊肚菌资源的命名 ,具有很大的帮助 。
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[本文编辑] 　宋凤菊
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