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濒危植物珠子参愈伤组织诱导因素分析



全 文 :北方园艺2016(07):85~88 ·生物技术·
第一作者简介:李利霞(1983-),女,硕士,助理研究员,现主要从事
药用植物资源利用与种子种苗繁育和悬浮细胞培养等研究工
作。E-mail:silktreedream@126.com.
基金项目:贵州省中药现代化科技产业研究开发专项资助项目
(ZY字[2012]3005号);贵阳市科技计划资助项目(2012HK-209-
37)。
收稿日期:2015-07-27
DOI:10.11937/bfyy.201607022
濒危植物珠子参愈伤组织诱导因素分析
李 利 霞,李 婷 婷,朱   虹,孙 长 生,刘 雪 兰,赵 厚 涛
(贵阳药用植物园,贵州 贵阳550002)
  摘 要:以珠子参节、节间和越冬芽萌发后的叶、根为试材,研究了不同消毒方法、外植体、植
物生长调节剂及培养条件等对珠子参愈伤组织诱导的影响,以期获得愈伤组织诱导的最佳方法。
结果表明:最佳消毒方法是75%酒精消毒15s后,越冬芽、节和节间分别加0.2%氯化汞消毒5、
15、15min;节间为愈伤组织诱导最适宜外植体;2,4-D 2.0mg/L+KT 0.1mg/L对节间诱导愈伤
组织效果最好,诱导率为96.67%;以MS为基础培养基添加浓度为5g/L的琼脂较适宜愈伤组织
的诱导;温度25℃、光周期24h/d、光照强度6 200lx的条件有利于愈伤组织的诱导。
关键词:珠子参;组织培养;愈伤组织
中图分类号:S 567.5+3 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2016)07-0085-04
  珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major
(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng)属五加科人参属植物,
为1977年起历版《中华人民共和国药典》收录药材珠子
参的基源植物之一。其根茎有较高的药用价值[1],叶可
作“参叶”使用,具有清热、消炎、镇静及镇痛等功效[2]。
现代研究表明珠子参的主要化学成分为多种皂苷类[3];
药理方面具有抗肿瘤[4]、保护心脑血管系统[5-6]、抗炎镇
痛[7]、抗疲劳等活性[8]。
商品珠子参主要源自野生资源,但其野生资源已难
以满足市场需求。此前对珠子参的研究主要集中在化
学成分、药理活性和资源分布方面,对其组织培养方面
的研究较少。现通过筛选不同的消毒方法、外植体、植
物生长调节剂及培养条件等对珠子参愈伤组织诱导进
行了详细的研究,以期获得优质的珠子参愈伤组织,为
利用植物细胞培养技术生产次生代谢产物和建立高频
率植株再生体系研究提供一定的技术依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试珠子参引自云南省丽江市三朵阁镇高山植
物园。
1.2 试验方法
1.2.1 不同消毒方法的效果比较 将珠子参越冬芽、节
(根茎珠状膨大部位)和节间(节与节之间细长的部分),
用洗洁精浸泡15min,清水冲洗干净。材料置于超净工
作台上用75%酒精和0.2%氯化汞不同的组合处理后,
无菌水冲洗5~6遍。将节间切割成1cm长的小段,节
削去表皮,切成小块,芽剥去芽被,接种到 MS空白培养
基,每个处理30个材料,温度(25±1)℃,暗培养10d后
统计污染率。
1.2.2 不同外植体和植物生长调节剂对珠子参愈伤组
织诱导的影响 将空白培养后的节、节间及越冬芽萌发
形成无菌苗的叶和须根分割后,接种到诱导愈伤组织的
培养基上,每个处理重复30个外植体,温度(25±1)℃、
光照强度约4 000lx、光周期12h/d,培养30d统计诱
导率。
表1 诱导愈伤组织培养基
  Table 1 Calus inducing medium
处理 基础培养基 浓度Concentration/(mg·L-1)
Treatment  Basic medium  2,4-D  KT
CK  MS  0  0
1 MS  1.0  0.1
2 MS  1.0  1.0
3 MS  2.0  0.1
4 MS  2.0  1.0
5 MS  3.0  0.1
6 MS  3.0  1.0
7 MS  1.0  0
8 MS  2.0  0
9 MS  3.0  0
10 MS  4.0  0
11 MS  5.0  0
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·生物技术· 北方园艺2016(07):85~88
1.2.3 不同培养条件对珠子参愈伤组织诱导的影响 
选取空白培养10d未污染的节间,转入植物生长调节剂
为2,4-D 2.0mg/L+KT 0.1mg/L的诱导培养基中,研
究不同基础培养基、琼脂浓度和光照强度对愈伤组织诱
导的影响。每个处理接种21瓶,温度(25±1)℃、光周期
12h/d。将节间接入选出的培养基,置于不同温度和光
周期的人工气候箱(光照强度约2 500lx)中培养,研究
不同温度和光周期对珠子参愈伤组织诱导的影响。诱
导率(%)=(形成愈伤组织的外植体数/(接种的外植体
数-污染外植体数))×100,污染率(%)=(污染瓶数/接
种瓶数)×100。
表2 L9(33)正交实验的因素与水平
  Table 2 Factor and level of orthogonal experiment L9(33)
水平
Level
因素Factor
A培养基类型 B琼脂浓度 C光照强度
Medium type  Agar concentration/(g·L-1) Light intensity/lx
1 MS  5  2 400
2  1/2MS  7  4 000
3 B5  9  6 200
1.3 数据分析
试验数据采用Excel和SPSS 16.0软件进行处理分析。
2 结果与分析
2.1 不同的消毒方法的效果
由表3可知,0.2%氯化汞在珠子参外植体消毒过
程中起主要作用,消毒时间越长,消毒效果越好;氯化汞
消毒之前先用75%酒精消毒15s可以稍微改善消毒效
果。3种外植体均采自地下,带有大量泥沙,污染率比较
高,节间由于表面比较光滑,较易消毒,污染率最低为
13.33%,而节的表面粗糙,消毒困难,污染率较高。越冬
芽幼嫩为避免外植体死亡,应选择较短的消毒时间。综
上所述,最佳消毒方法是75%酒精消毒15s后,越冬芽、
节和节间分别加0.2%氯化汞消毒5、15、15min。
表3 不同消毒处理对外植体的影响
  Table 3 Efect of diferent disinfection treatment on explants
外植体
Explant
消毒时间
Disinfection time
75%酒精/s 0.2%HgCl2/min
接种数
Inoculation number
/个
污染率
Contamination rate
/%
越冬芽 0  5  30  40.00
Winter bud  15  5  30  33.33
0  5  30  73.33
0  10  30  36.67
节 0  15  30  26.67
Knob  15  5  30  70.00
15  10  30  33.33
15  15  30  23.33
0  5  30  66.67
0  10  30  26.67
节间 0  15  30  16.67
Internode  15  5  30  50.00
15  10  30  23.33
15  15  30  13.33
2.2 不同外植体和植物生长调节剂对珠子参愈伤组织
诱导的影响
由表4可知,珠子参的不同外植体都不同程度的诱
导出了愈伤组织,诱导率最高达到了90%以上。不同外
植体所需的植物生长调节剂的配比是不同的。因为节
间诱导率最高,且全年都可取材,消毒方便,所以节间是
珠子参愈伤组织诱导的最适宜外植体。
从表4还可以看出,2,4-D在珠子参愈伤组织诱导
过程中起了主要的作用,KT起了辅助促进作用。外植
体在没有添加2,4-D的培养基上会褐化死亡;在只添加
2,4-D的培养基上也可以诱导出愈伤组织,只是诱导率
稍低,愈伤组织长势稍差;在同时添加2,4-D和KT的培
养基上,愈伤组织诱导效果最好。
表4 不同外植体愈伤组织形成情况
  Table 4 Diferent explants calus formation
外植体
Explant
处理
Treatment
接种数
Inoculation number/个
诱导率
Induction rate/%
愈伤组织描述
Calus description
叶片
Leaf
0  30  0.00 死亡
1  30  76.67 块较小、松软、淡绿
2  30  90.00 块较大、松软、淡绿
3  30  83.33 块大、松软、淡绿
4  30  76.67 块较大、松软、淡绿
5  30  76.67 块较大、松软、淡绿
6  30  86.67 块较小、松软、淡绿

Root
0  30  0.00 死亡
1  30  60.00 块较大、松软、白色
2  30  66.67 块较大、松软、白色
3  30  66.67 块较大、松软、白色
4  30  86.67 块较大、松软、白色
5  30  90.00 块较大、松软、白色
6  30  86.67 块较大、松软、白色
节间
Internode
0  30  0.00 死亡
1  30  83.33 块较大、松软、黄白色
2  30  80.00 块较大、松软、黄白色
3  30  96.67 块大、松软、黄白色
4  30  80.00 块较大、松软、黄白色
5  30  83.33 块较大、松软、黄白色
6  30  90.00 块较大、松软、黄白色
7  30  83.33 块较大、松软、黄白色
8  30  90.00 块较大、松软、黄白色
9  30  93.33 块较大、松软、黄白色

Knob
0  30  0.00 死亡
1  30  76.67 块较小、松软、黄白色
2  30  83.33 块较小、松软、黄白色
3  30  70.00 块较小、松软、黄白色
4  30  66.67 块较小、松软、黄白色
5  30  93.33 块较大、松软、黄白色
6  30  83.33 块较小、松软、黄白色
7  30  90.00 块较大、质硬、黄白色
8  30  73.33 块较大、松软、黄白色
9  30  76.67 块较大、松软、黄白色
10  30  83.33 块较大、松软、黄白色
11  30  80.00 块较大、松软、黄白色
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北方园艺2016(07):85~88 ·生物技术·
注:a.越冬芽萌发生成的珠子参无菌幼苗;b.叶片;c.根;d.节;e、f.节间。
Note:a.The overwintering buds germinated plants of Panax japonicus var.major;b.Leaf;c.Root;d.Knob;e,f.Internode.
图1 珠子参不同外植体诱导出的愈伤组织
Fig.1 Calus induced from diferent explants of Panax japonicus var.major
2.3 不同培养条件对珠子参愈伤组织诱导的影响
由表5可知,培养基类型、琼脂浓度和光照强度对
珠子参愈伤组织诱导均有影响,但仅仅简单比较百分率
不能准确确定影响珠子参愈伤组织诱导的各因素的主
次顺序。表6结果表明,C的极差最大,A次之,B最小。
因此,参试的3个因素对珠子参愈伤组织诱导的主次关
系为C>A>B,即光照强度>培养基类型>琼脂浓度。
分析3个因素各水平间差异的显著性,由表7可知,3
个因素的F值均小于F0.05,说明差异不显著,因三者
的自由度相同,由F值确定其主次关系为C>A>B。
根据表6中各因素的平均值可以看出,培养基类型A1
水平为最好,琼脂浓度B1水平为最好,光照强度C3水
平为最好。所以3个因素的理论最佳组合是A1B1C3,
即MS+5g/L琼脂浓度+6 200lx光照强度。
表5 珠子参诱导愈伤的L9(33)实验结果
  Table 5 The results of calus induction of Panax japonicus var.
majorin orthogonal test L9(33)
试验号
Test No.
因素
Factor
A  B  C
接种数
Inoculated
number/个
出愈时间
Calus formation
time/d
诱导率
Induction
rate/%
综合表现
Comprehensive
performance
1  1  1  1  21  6  80.00 ++++
2  1  2  2  21  8  70.00 ++++
3  1  3  3  21  11  85.00 ++++
4  2  1  3  21  6  78.95 ++++
5  2  2  1  21  6  66.67 ++
6  2  3  2  21  9  66.67 ++
7  3  1  2  21  9  70.59 ++
8  3  2  3  21  9  78.95 +
9  3  3  1  21  7  38.46 +
  注:“+”越多表示生长情况越好,下同。
Note:The more‘+’indicate the better of the growth situation,the same
below. 
  表6 珠子参愈伤组织诱导的直观分析
  Table 6 Audio-visual analysis for calus induction rate of
Panaxjaponicusvar.major
因素和
Total of the factors
A  B  C
平均值
Average value
A  B  C
K1  235.00 229.54 185.13  x1  78.33 76.51 61.71
K2  212.28 215.61 207.26  x2  70.76 71.87 69.09
K3  188.00 190.13 242.89  x3  62.67 63.38 80.96
R  47.00  39.41  57.77  R′ 15.67 13.14 19.26
  表7 珠子参愈伤组织诱导率方差分析
  Table 7 Variance analysis for calus induction rate of
Panaxjaponicusvar.major
因素
Factor
偏差平方和
Variance
自由度
Degree of freedom
F值
Fvalue
F0.05(2,2)
培养基类型 Medium type  368.305  2  1.234  19.00
琼脂浓度Agar concentration  266.295  2  0.892
灯管数Fluorescent lamp number  566.369  2  1.898
误差Error  298.424  2
  由表8可知,30℃时节间出愈时间晚,只有个别可以
产生愈伤组织,诱导率仅为14.29%;20℃时诱导率较高,
  表8 不同温度、光周期对节间诱导
愈伤组织的影响
  Table 8 Efect of diferent temperature and photoperiod on
calus induction of internode
处理
Treatment
温度
Temperature
/℃
光周期
Photoperiod
/(h·d-1)
出愈时间
Calus formation
time/d
诱导率
Induction rate
/%
综合表现
Comprehensive
performance
1  20  0  14  90.48 ++
2  20  12  15  85.71 ++
3  20  24  15  95.24 +++
4  25  0  15  90.48 +++
5  25  12  15  85.71 ++++
6  25  24  15  100.00 ++++
7  30  0  0.00
8  30  12  0.00
9  30  24  24  14.29 +
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但产生的愈伤组织的质量一般、生长缓慢,25℃时诱导
率和愈伤组织质量俱佳,故珠子参愈伤组织诱导的最佳
温度为25℃。光周期为24h/d时,诱导率为100.00%,且
诱导出的愈伤组织的质量最好。
3 讨论
珠子参是少数民族传统用药,疗效确切,近年来药
理研究证明珠子参具有广泛的药理活性。目前,珠子参
资源难以满足需求,开展组织培养研究是今后维持珠子
参商品供应和进行深入研究的有效途径。
该研究以珠子参的叶、根、节和节间为外植体诱导
愈伤组织,几种外植体都比较容易诱导出愈伤组织,节
间取材消毒方便且诱导率最高达96.67%,所以节间更
适合作为外植体诱导愈伤组织。外植体的获取方式对
愈伤组织的诱导有很大影响。张昱[9]以叶为外植体没
有诱导出愈伤组织;柴瑞娟等[10]以叶为外植体,诱导率
也仅有6.7%;该试验以叶为外植体,诱导率达到了
90%。该试验通过从越冬芽萌发生成的无菌植株上获
取叶片,避免了消毒过程对叶片的损伤,且叶片幼嫩,所
以叶片保持了较高的再生能力。该试验首次以根为外
植体诱导出了愈伤组织,诱导率也达到了90%。
该试验结果表明,2,4-D在珠子参愈伤组织诱导过
程中起了主要的作用,KT起了辅助促进作用。不同的
外植体需要2,4-D和KT的浓度略有不同;柴瑞娟等[10]
使用的愈伤组织诱导培养基为 MS+2,4-D 2.0mg/L+
6-BA 0.2mg/L;张昱[9]优选出的培养基为 MS+2,4-D
2.0mg/L+KT 1.0mg/L+6-BA 2.0mg/L+NAA
1.0mg/L。可见2,4-D在珠子参愈伤组织诱导过程中是
必不可少的,其它激素的不同可能与试验材料不同有关。
该试验对适合珠子参愈伤组织诱导的培养条件和
培养基类型进行了比较详细的研究,结果表明,以MS为
基础培养基添加浓度为5g/L的琼脂,在温度为25℃、
光周期为24h/d、光照强度为6 200lx的条件下培养有
利于愈伤组织的诱导。
参考文献
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Different Factors on Calus Induction of Panax japonicus var.major
LI Lixia,LI Tingting,ZHU Hong,SUN Changsheng,LIU Xuelan,ZHAO Houtao
(Guiyang Medicinal Botanical Garden,Guiyang,Guizhou 550002)
Abstract:Taking knobs,internode and leaves,roots of winter buds of Panax japonicus var.majoras experiment material,
the efects of diferent disinfection method,explants,plant growth regulator and culture conditions on calus induction
were studied to find the best method of calus induction.The results showed that the better disinfection treatment was 15
seconds with 75%C2H5OH,then 5minutes with 0.2% HgCl2for winter bud,but 15minutes for knobs and internode.
The internode was the best explant for calus induction.The induction rate 96.67% was the highest with 2,4-D
2.0mg/L+KT 0.1mg/L for internode.The MS medium with agar 5g/L was suitable for induction of calus.Condition
of the temperature 25℃,the photoperiod of 24h/d and the light intensity of 6 200lx was beneficial for calus induction.
Keywords:Panax japonicus var.major;tissue culture;calus
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