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不同产地猴头菌子实体粗多糖特征及其刺激巨噬细胞产生NO的活性



全 文 :食用菌学报2011.18(4):59~62
收稿日期:2011-11-24原稿;2011-12-01修改稿
基金项目:上海市农委重点攻关项目[编号:沪农科攻字(2008)第8-2号]的部分研究内容
作者简介:吴 迪(1982-),女,2010年毕业于上海海洋大学,硕士,研究实习员,主要从事天然产物的分离纯化与
生物活性研究。
*本文通讯作者 E-mail:yangyan9200@yahoo.com.cn
文章编号:1005-9873(2011)03-0059-04
不同产地猴头菌子实体粗多糖特征
及其刺激巨噬细胞产生NO的活性
吴 迪1,张劲松1,蒋 俊1,2,周 帅1,汪雯翰1,刘艳芳1,冯 娜1,唐庆九1,罗 珍3,杨 焱1*
[1农业部南方食用菌资源利用重点实验室,国家食用菌工程技术研究中心,上海市农业遗传育种重点开放实验室,
上海市农业科学院食用菌研究所,上海201403;2南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095;
3无限极(中国)有限公司,广东广州510000]
摘 要:提取7种不同来源的猴头菌(Hericium erinaceus)子实体粗多糖,对其理化性质和体外免疫活性进行
分析。结果表明:不同产地的猴头菌子实体粗多糖含量和得率差异较大,以来源于黑龙江省牡丹江市海林县
(H1)、林口县(H3)的子实体粗多糖含量、得率较高;各粗多糖提取物分子量分布相似,单糖组成均以葡萄糖为
主,并含有岩藻糖和半乳糖;7种子实体粗多糖提取物均能增强小鼠巨噬细胞株RAW264.7生成NO的量,以
500μg/mL H3提取物活性最高、H1次之。
关键词:猴头菌;粗多糖;一氧化氮释放;巨噬细胞;免疫调节
  猴头菌(Hericium erinaceus)隶属于担子菌
亚门(Basidiomycotina)、红菇目(Russulales)、猴
头菌科(Hericiaceae)、猴头菌属(Hericium)[1],
是著名的食药两用菌。猴头菌具有助消化利五
脏的功能,对慢性胃炎十二指肠溃疡胃溃疡等多
种消化道疾病均有较好疗效,能提高人体免疫能
力[2,3]。多糖是猴头菌属真菌化学组成中研究最
多的成分之一,猴头菌属真菌子实体多糖、菌丝
体多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、抗凝血、降血脂
等功效[4]。
笔者以不同产地的猴头菌子实体为材料进
行粗多糖提取,分析不同产地猴头菌子实体粗多
糖的含量、得率、分子量分布及单糖组成等指标,
并测定其刺激巨噬细胞产生NO的活性,以期筛
选出粗多糖产量高、活性好的猴头菌,为其大规
模生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
  猴头菌(H.erinaceus)子实体分别购自黑龙
江省牡丹江市海林县、林口县(命名为 H1、H3)、
浙江省常山县、江山市(命名为 H2、H7)、福建省
古田县、古田县吉港乡、古田县(命名为 H4、H5、
H6)。
子实体于60℃烘干后用粉碎机粉碎(DJ-
10A,上海淀久重要机械制造有限公司)。
1.2 试剂与细胞株来源
  葡聚糖标准品(分子量分别为12、25、50、80、
150、270、410、670kDa)为Sigma-Aldrich公司产
品;DMEM 培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血
清为Gibco公司产品;青霉素、链霉素为Amersco
公司 产 品;细 菌 脂 多 糖 (lipo-polysaccharide,
LPS)为Sigma公司产品。其它试剂均为国产分
析纯。
RAW264.7 巨 噬 细 胞 株 购 自 于 ATCC
(American Type Culture Colection)。
1.3 方法
1.3.1 猴头菌子实体粗多糖制备
  分别称取20g猴头菌子实体粉末,每个样
品3个重复,按料液比(w/v)1∶15加蒸馏水浸
泡30min,100℃提取2h,提取2次,过滤合并
滤液;按浓缩比为2mL/g将提取液浓缩,待冷
却至低于40℃时用95%乙醇沉淀,乙醇终浓度
为70%,然后将溶液置于4℃,醇沉8h,3320 g
离心30min,收集沉淀,即为猴头菌子实体粗
多糖。
DOI:10.16488/j.cnki.1005-9873.2011.04.022
食 用 菌 学 报 第18卷
1.3.2 指标测定
  粗多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[5],公式
同参考文献[6]。
粗多糖得率=粗提物的量(g)/子实体的重
量(g)×100%
采用高效阴离子交换色谱法测定单糖组成,
具体试剂及测定方法同文献[7];采用高效液相
凝胶渗透色谱法(HPGPC)获得猴头菌粗多糖图
谱,用 GPC软件计算各组分分子量,分析其分
布[8];无菌条件下将1.3.1中获得的粗多糖样品
用PBS配成50、200、500μg/mL的溶液,参照文
献[9]的方法,测定巨噬细胞产生NO的量。
2 结果与分析
2.1 粗多糖含量、得率及单糖组成分析
  猴头菌子实体粗多糖含量、得率见表1,来源于
黑龙江省的H1、H3在粗多糖得率和含量方面均高
于其它地区的样品,这与猴头菌的栽培环境有关。
表1 猴头菌子实体粗多糖含量、得率及单糖组成分析
Table 1 Polysaccharide content of crude extracts from H.erinaceus fruit bodies,and monosaccharide composition
名称
Sample
粗多糖得率
Crude extract yield
(g/100g fruit body)
粗多糖含量
Polysaccharide content
of crude extract(%)
岩藻糖
Fucose
(μmol/L)
半乳糖
Galactose
(μmol/L)
葡萄糖
Glucose
(μmol/L)
H1  3.71  59.82±1.75f 1.80  12.15  38.25
H2  2.62  38.44±1.45d 2.14  16.05  31.42
H3  3.89  59.15±1.20f 1.29  8.11  39.34
H4  1.13  22.62±0.17b 1.86  11.59  35.93
H5  0.81  18.36±0.09a 2.53  13.40  23.33
H6  1.56  32.98±1.83c 1.87  14.89  31.43
H7  2.55  46.69±1.91e 2.05  16.05  33.71
表中数据为3次平均值±SD;小写英文字母表示P<0.05水平的差异显著性
Values shown are the means(n=3)±SD;Different lower case letters represent a significant difference at P0.05
  单糖组成分析发现7种子实体粗多糖提取
物均含有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖,并都以葡萄糖
为主要单糖,其中以H1中的含量最高,各单糖之
间的摩尔比除 H5外,其余6种的摩尔比接近。
鼠李糖,阿拉伯糖,木糖,甘露糖,半乳糖醛酸,葡
萄糖醛酸组分均未检测到。
2.2 粗多糖的分子量分布
  由图1可以看出,7种不同产地的猴头菌粗
多糖的出峰位置基本相同。7种粗多糖提取物均
有一个出现在 20 min 左右的主峰 (分子量
2000kDa)及1个30min左右的小峰(分子量
20kDa)和1个35min的小峰(分子量10kDa),
说明它们含有的组分种类相似;但峰面积的大小
有差异,说明它们的含量不同。H1和 H3分子
量大的部分占整个图谱面积超过60%,而 H7分
子量小的部分达60%以上。
图1 猴头菌子实体粗多糖HPGPC图谱
Fig.1 HPGPC chromatography of crude polysaccharide extracted from seven H.erinaceus fruit body samples
06
第4期 吴 迪,等:不同产地猴头菌子实体粗多糖特征及其刺激巨噬细胞产生NO的活性
2.3 粗多糖刺激巨噬细胞释放NO的量
  由图2可知,与对照相比,7种猴头菌子实
体粗多糖提取物在500μg/mL时均能极显著促
进小鼠巨噬细胞株 RAW264.7产生 NO的量,
其中以 H3活性最好;其次是 H1,其余样品在试
验浓度范围内活性也均高于阴性对照,各样品
对巨噬细胞产生 NO作用存在着较好的浓度依
赖性。
Controls:磷酸盐缓冲液:LPS:细菌脂多糖;
*与对照相比差异显著,**与对照相比差异极显著
Controls:phosphate buffer(negative control);LPS:lipopolysaccharide(positive control);
*Represents a significant difference at P0.05 compared with the negative control,**Represents a significant difference at P0.01 compared
with the negative control
图2 不同产地猴头菌子实体粗多糖对巨噬细胞生成NO的影响
Fig.2 Effect of H.erinaceus crude polysaccharide samples on NO release from RAW264.7cels
3 讨论
  多糖发挥生物学活性通常需要其分子质量
在一定范围内[10],这可能同多糖分子形成的高级
构型有关。BLASCHEK 等[11]研究发现来源相
同、相对分子质量范围不同的多糖,生物活性不
同,而相同来源的多糖其结构具有类似性,由此
可知其分子量大小对于其生物活性至关重要。
本研究结果表明,7种猴头菌粗多糖分子量分布
类似,但因为分子量大的部分所占比例不同,使
H1和 H3在刺激巨噬细胞产生 NO的量上与其
它样品存在显著差异,但分子量并不是决定活性
的唯一因素,单糖组成和多糖含量同样会影响其
品质与活性,研究中 H7分子量小的部分达60%
以上,但其体外免疫试验活性并不是最低的,这
可能与其较高的粗多糖含量有关,而 H4粗多糖
含量和得率都较低,但其活性并不是最低的,这
种粗多糖含量与免疫活性间不一致的原因可能
在于粗多糖的免疫活性与其组成、构型、分支、构
象、分子量等多种因素相关。
研究结果表明,来源于黑龙江省的 H1和 H3
不论在粗多糖含量、得率还是刺激巨噬细胞产生
NO活性,均高于其它来源的样品,因此,H1和 H3
可考虑作为工业上大规模生产粗多糖的原料。
参考文献
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16
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Partial Characterization of Polysaccharides from
Seven Hericium erinaceus Fruit BodySamples and
Their Effect on Nitric Oxide Release from Macrophages
WU Di 1,ZHANG Jingsong1,JIANG Jun1,2,ZHOU Shuai 1,WANG Wenhan1,
LIU Yanfang1,FENG Na1,TANG Qingjiu1,LUO Zhen3,YANG Yan1*
(1 National Engineering Research Center of Edible Fungi;Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics
and Breeding;Institute of Edible Fungi,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 201403,China;
2 Colege of Life Sciences,Nanjing Agricultural University,Nanjing,Jiangsu 210095,China;
3Infinitus(China)Company Ltd,Guangzhou,Guangdong 510000,China)
Abstract:Crude polysaccharide preparations were prepared by hot(100℃)water extraction and ethanol
precipitation from Hericium erinaceus fruit bodies artificialy cultivated at seven different facilities located in
Fujian,Zhejiang and Heilongjiang Provinces of China.Highest yields of crude extract containing the highest
amounts of polysaccharide were obtained from fruit body samples(H1and H3)grown in Heilongjiang.
HPLC analysis revealed that crude polysaccharide material extracted from the seven fruit body samples had
similar molecular weight distributions,and al contained relatively high amounts of glucose together with
smaler quantities of fucose and galactose.Al the test samples exhibited immunomodulatory activity,assessed
on the basis of nitric oxide production by RAW 264.7macrophages,with highest NO levels recorded when
the cels were exposed to 500μg/mL of material extracted from H3and H1fruit bodies.
Key words:Hericium erinaceus;polysaccharide;nitric oxide production;macrophages;immunoregulation
[本文编辑] 王瑞霞
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