全 文 ：菌 物 系 统 1 8( 2): 6 1 8一 1 7 1, 1 9 99
几加 , o sy s et m a
羊肚菌原生质体诱变筛选高生物量高氨基酸含量菌株
刘 士
(江苏徐州师范大学生物系
旺
徐州 2 2 10 0 9 )
梁宗琦 刘爱英
(贵州大学农学院虫生真菌资源研究所 贵 阳 5 5 0 0 2 5)
摘 要 研究影响尖顶羊肚菌 。 盛7cr he l la 。 on i ca eP sr . ) C G AG 9 5 0 6原生质体制备 、 再生因
素基础上 , 首次诱变羊肚菌原生质体 , 进行高生物量高氨基酸含量菌株选育 。 原生质体诱变再
生株 M 。 on i ca C G AG 95 0 6 37生物量 比出发株提高 7 . 3% , 总氨基酸比出发株提高 38 % 。
关键词 羊肚菌 原生质体诱变 高生物量 高氨基酸
中图分类号 Q9 3 3 文献标识码 A 文章编号 10 0 7一 35 1 5 ( 1 99 9 ) 0 2书 1 6 8一0 1 7 1
原生质体诱变育种 , 在一些丝状真菌中 已得到较为成功的应用 (王弘 , 1 990 , 朱宝成 , 1 994 , 杨崇林 ,
199 2)
, 本文在详细研究影响羊肚菌原生质体制备 、 再生因素基础上 , 首次利用诱变原生质体技术 , 进行羊
肚菌的高生物量和高氨基酸含量菌种的选育 。
1 材料与方法
L l 菌种
尖顶羊肚菌 (M 。 on ic’a ) C G A C es 9 5 0 6号 (采集于贵州大学农学院老 图书馆门前 ) 。
L Z 培养基
P l) A 培养基 : 马铃薯 20 09 , 蔗糖 159 , 琼脂 1 59 , 水 10 0 ml , p H 自然 。 摇瓶培养基 : 麦芽汁 50 % , 玉
米粉 1. 5% , 酵母提取物 0 . 5% , 蔗糖 1 . 5% 。 原生质体制备菌丝固体培养基 : P D A 中补加 0 . 1% 的酵母提取
物 。 原生质体再生培养基 : P D A 中加人 .0 3 m ol cK l + .0 3 m of 环己六醇
。
1
.
3 原生质体制备与纯化
改良 M o ir g uc hi 硒 st u iak ( 1 9 85) 的方法 。
1
.
3
.
1 菌丝培养 : 在倒好的培养基平板上放一张无菌的玻璃纸 , 在玻璃纸上接人豆粒大小的菌块 (3一4
块 ) , 25 ℃培养 30 h , 收集菌丝体 。
1
.
3
.
2 菌丝酶解 :取 l m o l / L K C I溶液 o . 6 m一, 磷酸缓冲液 (p哪 . 9 5 ) o 4 m l , 加人 s拼1 0刀o l 0’o 琉基 乙醇 , 将上
述溶液混于小瓶中 。 将玻璃纸上培养 30 hr 或液体培养 2d 的菌丝用小镊子轻轻取下 , 放人菌丝清洗液中
( lm ol L/ K 〔!l :磷酸缓冲液 = 3 : 2) 洗 2 次 , 然后 用灭菌的干滤纸吸去水分 , 酶液用 0 . 2 5协m 的微孔滤膜过
滤除菌 。 称取菌丝 2 50m g 放入 5m l 的酶解液中酶解 , 原生质体产量按下列公式计算 : 原生质体产量 (个
/ m g ) = 原生质体个数 /菌丝重量 。
L 4 原生质体再生
参照 M o ir 只cu ih 肠 ts l l a k i ( 19 8 5 )的方法 。
19 98 一 1一4收原稿 , 19 9 8刃 3一 10 收修改稿 。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1999. 02. 013
2 期 刘士 旺等 : 羊肚菌原生质体诱变筛选高生物量高氨基酸含量菌株 19 6
LS 原生质体诱变
取 1 x1 0“个 / ml 原生质体悬浮液 sm l , 放人 7 . cs m 的培养皿中 , 紫外线照射条件 : 灯管距离培养皿
30 c m
,
30 瓦紫外灯照射 , 照射以后黑布包好 30 im n 以后 , 吸取 .0 2 m l涂布于再生培养基上 , 25 ℃培养 d4 , 进
行致死率测定 。
L 6 菌丝生物量测定方法
二层沙布过滤 , 除去中心 的接种块 , 水冲洗二次 , 60 ℃烘干称量 。
L 7 菌丝核相观察
载玻片培养菌丝 Zd , 出 e e h s t 3 32 55 荧光染色 , o lym p u s s y s te m im e or s e o详 B X 5 0一F 观察 。
1
.
8 氨基酸含量测定
发酵终点的菌丝 , 过滤后无菌水冲洗干净 , 60 ℃烘干磨成干粉 , 以 60 目过筛 。 用美国产 S ys te m 6 3 0 0
氨基酸分析仪酸水解法测定 。 贵州师范大学生化测试中心测试 。
L g 酶的种类及有关药品
纤维素酶 (ce fl ul as e) (中科院上海生化所东风生化技术公司 出品 ) , 溶壁酶 ( ly w al yz m e) (广东省微生
物研究所生产 ) , 蜗牛酶 ( s an il as e) (北京华美生物工程公司提供 ) , 崩溃酶 d( ir se las e) (S ig m a 公 司生产 ) ,
M E s (2一M o印h o l in o e ht an e s d fo 山 e ac i d ) ( s e vr a 公司生产 ) , 琉基乙醇 ( s e vr a 公司生产 ) 。
L 10 溶液的配制
磷酸缓冲液配制 , 参照张龙翔 ( 1984) 的方法配制 p6H 98 ; 盐酸一irs 缓冲液配制 ,参照周东坡 (l 9 9 0)
的方法 ; M E S 缓冲液的配制 , 参照 张鉴铭 ( 19 89) 的方法 。
2 结果与分析
2
.
1 羊肚菌 9 5 0 6 原生质体制备及其纯化
2
.
1
.
1 酶解系统选择 : 实验结果 (表 l) 表明 , l 、 2 、 5 号酶液中原生质体产量较高 , 这几种组合都是复合酶 。
单一的蜗牛酶 、 溶壁酶 、 纤维素酶极少或不产生原生质体 。 2 号酶解液中原生质体产量最高 , 为 2 . 2 x l了
个 / m g , 选取 2 号酶液作为实验的酶解系统 。
表 1 不同组合酶对原生质体产最影响*
Tab l
e l
.
E』. fe e ts o f id fe re n t c om P o n e n t e nz y m e s o n P r o t o P las t y i e ld s
处理 蜗牛酶 溶壁酶 纤维素酶 崩溃酶 原生质体产量 (l x 10 4 )
T re a t s S n ia la s e I y w al lz y m e C e l lul as e l为i s e las e Y i e ]d s
1 4 5 1
.
4
2 4 5 4 2 2
3 5 4 0 3
4 4 4 0 7
5 4 5 2 2
.
0
6 6 少
7 6 极少
8 6 无
* 酶的浓度 : m g m/ l , 原生质体产量 : 个 /m g
E nz y m e e o nc e n t ra it o n : m g /nlI
,
P ro to lP as t y i
e ld s : n um be
rs /m g
2
.
1
.
2 原生质体制备和纯化 : 不同稳定剂及其缓冲液实验结果表明 , 原生质体产量影响比较显著 , 磷酸盐
缓冲系统 .0 6 m of m/ 1 K C I 中形成的原生质体最多 , 培养 20 h 的菌丝在 30 ℃ 。 4 0 r/ m in 条件下酶解 3 . 5h , 然
17 0 菌 物 系 统 18 卷
后用无菌的擦镜纸 2 层过滤 , 滤液于 10 m l 离心管中 I 00 0 r/ m in 离心 8 m in( 显微镜检查上清液无原生质
体 ) , 弃去上清液 , 加人 10 ml 稳定剂一缓冲液 。 血球计数板计数 。 原生质体产量达到 2 . 5 x l了个 /m g 。 原生
质体保存于稳定剂一缓冲液中备用 。
.2 2 原生质体再生
取 8 x 10 6个 / m l原生质体 0 . l m l到 4 . gm l缓冲液中 , 稀释 (2 次 )为 3 . 2 只 1 0 3个 / m l , 吸取 0 2m l涂布到
再生培养基上 , 25 ℃培养 4 d , 再生率仅为 0 . 5 6% 。
.2 3 原生质体诱变
.2 3
.
1 诱变剂量选择 : 尖顶羊肚菌 C G A -C 9 5 0 6菌株原生质体紫外线照射实验结果表明 , 随着照射时间增
加 , 原生质体存活数量减少 , 照射 2 805 , 存活数为 0 , 致死率达到 10 % 。 取照射 605 作为诱变时间 。
.2 .3 2 诱变株初筛 : 通过五次诱变处理 , 根据长势 , 一共挑取原生质体再生菌株 10 株 , 经过五次转代培
养 , 挑取五株保持良好长势的原生质体诱变再生株 , 在固体培养基 上 25 ℃培养 d2 , 再生株生长旺盛 , 菌落
菌丝向四周扩散速度比出发株快 , 菌落边缘菌丝较出发株粗大而致密 。 菌落直径 、 日长速度测定结果表
明 , 菌株 C ( ; A -C 95 0 6 3 6 、 C G A -C 9 5 0 6 3 7 、 C G A C 一9 5 0 6 5 5生长速度达到 l . Z e m / d , 比对照提高 2 0% , 诱变再
生株的生长速度比对照快 。
.2 .3 3 菌丝核相观察 : 核相观察表明 , 出发株菌丝多核 ( 3一 20 以 _ [ ) , 出发株菌丝酶解制备的原生质体多
数含有一个核 , 也有两个核和两个以 上核的 , 也有无核的 (不能再生 ) , 诱变再生株菌丝多核 ( 3个以上 ) 。
.2 .3 4 诱变株生物量和氨基酸含量测定 : 通过初筛的五株诱变再生株在摇瓶生产培养基上摇瓶培养二
周 , 进行生物量和氨基酸含量的测定 。
出发菌株 C G A C 9 5 0 6及其诱变再生株生物量和氨基酸含量测定实验结果 (见表 2)
表2 五株原生质体诱变再生株的生物量和氨基酸含量 *
T a b l e 2 B i o m as
s a
dn
e o n te n t o f
anu
n o ac i d o f if v e re g e ne r a t l o n i s o late
s fr orn m
u 七王g e n e s l s P or t o P l a s ts
菌株号
I s o la te s
生物量 ( g )
B i o m a s s
总氨基酸 (% )
T 0 1a l a a
必需氨基酸 (% ) 鲜味氨基酸 (% )
l无 l i C 10 U S a a
.…OC,、4n勺2l
C G人C - . 9 5 0 6
C ( ;A C 一 9 5 0 6 2 0
C (〕A C es 9 5 0 6 3 6
C G A C
~
9 5 0 6 3 7
C G A C es 9 5 0 6 5 5
C G A 〔 !一 9 5 0 6 7 2
2 1 2 1
2 1
.
2 4
2 2刃7
2 2 7 6
2 2 3 8
2 1
.
4 0
1 7
.
5 4
7 4
3 6
2 3
4 2
12石4
E S S e n t ia l a
4 4名7
3 5刀6
3 5
一
5 1
3 6
.
8 0
53
.
7 5
36
,
9 0
3 1
.
6 9
4 0
.
10
4 1
.
4 8
3 9石0
4 0 2 6
4 5
.
4 0
* 生物量为三次重复平均值 , 总氨基酸含量 : m g/ 10 g0
B io m as s 一5 t ll r e e re pe ats va e r a g e
,
to tal am i
n o ac id c o n te n t :m g / 10 09
表 3 诱变再生株M co n ic a ( 石月〔牛 9 50 637 优良性状 *
aT b l
e 3 R n e P ID P e r t ie s o f 献 ( 、 o n i e a C〔 ;AG 9 50 6 3 7
菌株 总氨基酸
T o ta l a 是
人体必需氨基酸 生物量
S t限一n s
C G A C 一9 50 6 17
.
5 4
E s s e n it a l a a
7
.
8 4 0
8
.
9 4 4
鲜味氨基酸
l…沈 l l C 10 u S 日a B 一o m韶 S e s
5
.
56
C G z、 C 一9 50 6 3 7 2 4 2 3
17刃3
9万9 4 2 2 , 7 6
菌株 l * * 9 一 94
* : 氨基酸含量 : m g / 10 0 9 。、 m l n o ac id e o n et n t :m g / 10 0 9 )
* * :
M
e s c u le n 似 8 7 0 2 5 , :
2 期 刘士旺等 : 羊肚菌原生质体诱变筛选高生物量高氨基酸含量菌株 17 1
实验结果 (表 2) 表明 :诱变再生株 M . o cn ia cC (; AG 5 90 63 7生物量达到 2 . 7 6 9, 比出发株提高 7 . 3% ,
总氨基酸含量为 24 . 23 m g / 1 0 0 9 , 人体必需氨基酸占总氨基酸 36 . 80 % , 鲜味氨基酸占总氨基酸 39 . 60 % 。
.2 .3 5 原生质体诱变再生株 C ( ;A G 9 50 63 7优良性状 : 原生质体诱变再生株 C G z、 C 一9 5 0 6 37优良性状和出
发株及相关菌株 比较结果如下 :
掀 co in ,’a C G AG 9 5 0 6 3 7与出发株相 比 , 总氨基酸提高 38 % , 人体必需氨基酸提高 1.4 08 % , 决定鲜味
的氨基酸提高 90 % , 生物量提高 7 , 3% 。 掀 co in 二 C G A-C 950 6 37与菌株 1 相比 , 总氨基酸提高 42 % , 决定
鲜味的氨基酸提高 1 5 6% 。
3 讨 论
羊肚菌原生质体对紫外线敏感 , 可以采取大剂量接种方法弥补较低的再生率 。 诱变后的黑暗处理不
可缺少 , 防止紫外线诱变的光复活效应 。 越来越多 的实验表明 , 低剂量的诱变 出现正向突变频率较大 。
诱变再生株优良性状的稳定性 , 需要多次传代培养才能确定 。 以菌丝长势作为诱变再生株初筛条件 , 挑
选长势好的再生株 , 传代培养旺盛的菌株 , 确定稳定的突变株 , 以生物量和氨基酸含量为最终筛选指标 ,
可以获得稳定的高产高鲜氨基酸 的突变体 。
参 考 文 献
龙正海 , 梁培春 , 秦京等 , 19 95 。 羊肚菌氨基酸含量变化 以及脂酶同工酶研究 。 真菌学报 , 14 (4) : 2 63 一 2 68
张龙翔 , 张庭芳 , 李令媛 , 19 8 1 。 生化实验方法和技术 。 北京 : 高等教育出版社 , 3 72 一 3 73
张鉴铭 , 郑玉萍 , 陈梅英等 , 19 89 。 尖顶羊肚菌原生质体分离及再生。 云南植物研究 , 1 1 (4) : 449 一 4 52
周东坡 , 平文祥 , 19 9 0 。 微生物原生质体融合 黑龙江 : 黑龙江科学技术 出版社 , 18 一 2 37
M o n g u c h i M
,
K o te g a w a S
,
19 85
.
P re Pa ar it o n a n d re g e ne ar it o n o f P r o t o P las ts ofr m m y
c e lia o f M o cr h e l la
.
A g n e
B i o l C he m
,
4 9 (9 ) : 2 7 9 1一 2 7 9 3 .
M U T A G E N E S I S A N D S C R E E N 】N G O F 1 l l G H B I O M A S S A N D I l l G H
A M IN O A C I D C O N T E N T S T R A I N S F R O M 泪吟R C H E L L月 〔)口脚了〔月
P R O T O P L A S T S
L I U S h i一Wan g
(D eP a r加 e n r 。 / b i o l o舒 ,
L IA N G
Xu
z h o u eT a e h e r s nU i
v e r s i妙, Xu hz o u , 2 2 10 0 9 )
Z o n g 一Q i
(山为o r a 仍尽 ,)j nE (t, m o g e n o u 、 哟 e o l o好 , G u `: h o u
L I U 儿一Y in g
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v e r s i今 七 r i c u l zu r a l oC l l e g e , G u 沙 a n g , 5 5 0 0 2 5 )
A B S T R A C T S o m e h i g h b i o m a s s an d h i g h am i
n o ac i d c o n te n t m u 飞a l l t s t r a l n s w e re
i s o l a te d fr o m 几五, r ` · h e ll a c o n i c a C G A -C 9 5 O6 P or to P las t etr a et d by U
.
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bi o m a s s a n d c o n et n t o f am i
n o a e id s o f 几盛, r e h e l la c o n i e aC G A C一 9 5 0 6 3 7
, o n e o f t ll e
m u at n t s talr
n s , W c er i n c er a s e d 7
·
3% a n d 3 8% er s P e e it v e l y as c om P
a er d w iht ht e
o ir g i n al s湘 i n .
K E Y W O R D S 八盛 , r e h e l l a c o n i e a , P or ot P l a s tS , M l l agt e n e s i s
,
H g h b iom as
s , iH g h
a m i n ( ) a e id C o n et n t