全 文 ：　[ 收稿日期] 2000-11-15　　[ 修回日期] 2001-06-29
＊[ 基金项目] 吉林省科委资助项目(No.942301)
[ 文章编号] 　1000-4718(2002)03-0292-03
萝摩甙抗自由基损伤作用的实验研究＊
侯忠赤1 , 　王健春2 , 　康劲松1 , 　刘　潇1 , 　郭中钰1 , 　祝世功1 , 3
(吉林大学 1病理生理教研室 , 2机能实验室 ,吉林 长春 130021;3北京大学医学部生理与病理生理学系 ,北京 100083)
　　[ 摘　要] 　目的:探讨萝摩甙对自由基所致脑损伤的神经元保护作用及机制。方法:复制脑缺血模型及 H2O2
诱导神经元损伤模型 ,分别测定大鼠脑组织 、培养神经元中的丙二醛(MDA)含量以及培养神经元中的乳酸脱氢酶
(LDH)漏出率 、DNA 断裂率和羟自由基清除率 , 观察萝摩甙对损伤神经元的保护作用。结果:萝摩甙可明显降低脑缺
血造成的MDA 的升高 ,亦可明显降低 H2O2对神经元造成的 LDH 漏出率 、DNA断裂率增加和丙二醛含量的升高 , 而
且随着萝摩甙浓度的升高羟自由基清除率明显升高。结论:萝摩甙可通过清除自由基来保护神经元。
[ 关键词] 　局部缺血;神经元;乳酸脱氢酶;丙二醛;过氧化氢;萝摩甙
　　[ 中图分类号] 　R743.3　　　[文献标识码] 　A
　　自由基损伤学说在缺血缺氧性脑血管疾病的发
病机制中占有很重要的地位。该学说认为:体内自
由基的产生和清除处于动态平衡 ,任何原因造成自
由基的产生增加和/或清除减少均可导致体内自由
基的增多 ,它可通过脂质过氧化造成细胞膜的损伤 ,
进而导致细胞的损害 。近来有文献报道萝摩科植物
白首乌具有抗自由基作用[ 1] ,而萝摩是否具有此作
用未见报道。本研究室从野生萝摩中提取其有效成
分-萝摩甙(Asclepiadaceae ,Asc),从整体及细胞水平
观察其抗自由基损伤的作用 ,为防治脑血管疾病提
供一种新药。
材　料　和　方　法
1　试剂与仪器
萝摩甙由本校有机化学教研室研制 , DMEM 、
HEPES 为 Gibco 公司产品 ,其余均为国产分析纯。超
净工作台(YZ-875苏州净化设备厂)、恒温震荡孵育
器(江苏常州国华仪器厂)、细胞培养板(丹麦NESON
公司产品)、MICO175三洋二氧化碳培养箱(日本三
洋公司产品)、SZD-Z 倒置生物显微镜(重庆光学仪
器厂产品)、722型分光光度计 、离心机 。
2　动物分组及全脑缺血模型的复制
将Wistar大鼠随机分为 5组:假手术组 、单纯缺
血组 、萝摩甙(10 mg/kg)+缺血组 、萝摩甙(50 mg/
kg)+缺血组 、萝摩甙(100 mg/kg)+缺血组 。加萝摩
甙的各组每日腹腔注射给药 1次 ,连续 1 周。假手
术组和单纯缺血组动物注射等剂量的生理盐水。
大鼠全脑缺血模型采用 Pulsinelli等建立的四血
管结扎法[ 2] 。腹腔注射 10%水合氯醛(3.5 mL/kg)
麻醉大鼠后 ,在大脑定位仪上用电凝器烧灼封闭双
侧椎动脉 ,使其完全永久闭合。然后将大鼠仰卧位
固定于鼠台上 ,分离双侧颈总动脉并穿线备用 。次
日 ,进行脑缺血实验 。缺血30min ,处死动物 ,迅速取
脑置于液氮。以大鼠眼球苍白 、翻正反射消失及脑
电图呈一直线作为大鼠全脑缺血的判定指标 。
3　皮层神经元原代培养及药物处理
参照康劲松等[ 3] 的方法 。取出生 24h 内的
Wistar大鼠乳鼠 ,断头处死。无菌条件下取大脑皮
层 ,剥离血管和软脑膜。将脑组织剪碎 ,置于 0.25%
胰蛋白酶中消化 ,37 ℃孵育 10 min ,加入10%小牛血
清中止胰酶消化 。500 r/min离心 5 min ,弃上清。加
入培养液反复吹打 ,200目尼龙网过滤后计数。调细
胞浓度为 2×109 cells/L 分别接种于铺鼠尾胶的 96
孔板(每孔 200μL)和培养瓶中(每瓶 10 mL)。在 37
℃,体积分数为 5%的 CO2 孵箱中培养 48 h ,全量换
液 ,将培养液更换为 10%小牛血清 ,并加入 10 mg/L
阿糖胞苷以抑制胶质细胞的增殖。24 h 后半量换液
使阿糖胞苷浓度保持 5 mg/L 以维持对胶质细胞的
抑制。此后每 2 d 换液 1 次 。培养基成分:DMEM
(80%)、HEPES(10 mmol/L)、小牛血清(20%)、
NaHCO3 0.44mol/L 、青霉素 105 U/L 、链霉素 105 U/L 、
胰岛素 100 U/L。
　　皮层神经元培养至 6 d 时 ,全量换液 ,Asc 预处
理组细胞先加入含终浓度为 50 mg/L、100 mg/L 、200
mg/L萝摩甙的 DMEM培养液 , 每孔 200 μL ,每瓶 10
mL。孵育 24 h , 用无血清培养液漂洗两遍 。加入
H2O2 500μmol/L作用 10 min ,然后漂洗 2次 ,加入无
血清的 DMEM , 37℃孵育 24 h ,测定 LDH 漏出率 、
MDA含量及 DNA 断裂率。
·292· 中国病理生理杂志　Chinese Journal of Pathophysiology　2002 , 18(3):292-294
4　观察指标及测定
参照Koh等[ 4]的方法测定 LDH 漏出率 ,漏出率
=上清中 LDH/(上清中 LDH +冻融后 LDH)。参照
Illera等[ 5]的方法进行片段化 DNA 定量检测 。MDA
含量采用 TBA法[ 6]测定 。羟自由基清除率采用金鸣
等[ 7]的方法测定 。
5　统计学处理
　　采用ANOVA和 t检验进行统计学处理 ,结果以
x ±s表示。
结　　果
1　萝摩甙对缺血脑组织脂质过氧化的影响
从表 1可以看出:缺血组动物脑组织中MDA 含
量明显高于假手术组(P <0.01),而分别用小 、中 、大
剂量萝摩甙预防组动物脑组织中 MDA 含量均明显
低于假手术组(P <0.05 , P <0.05 , P <0.01),其中
以大剂量组的效果最好。
表 1　萝摩甙对脑组织中MDA含量的影响
Tab 1　The effect of Asc on content of MDA in brain( x±s.n=6)
Group MDA(g/ L)
Sham 　　　507.64±76.45
Ischemia 662.21±74.85##
Asc(10 mg/kg)+ischemia 580.33±35.62＊
Asc(50 mg/kg)+ischemia 549.24±72.97＊
Asc(100 mg/kg)+ischemia 483.06±58.63＊＊
　＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs ischemia;##P <0.01 vs sham.
2　萝摩甙对 H2O2 损害神经元的影响
结果表明:单独加入 H2O2 时 LDH漏出率明显高
于对照组(P <0.01),而同时无论加入萝摩甙(壳)或
萝摩甙(籽)时 LDH 漏出率均明显低于单独加入
H2O2组(P<0.01 , P <0.05),两者均以大剂量效果
较好(见表 2)。
表 2　萝摩甙对 H2O2 损伤的神经元的影响
Tab 2　The effect of Asc on neuron injuried by H2O2( x±s)
Group
Transudatory rate of LDH(%)
n Seed n Shell
Control 8 　　38.27±1.76 6　　37.81±1.61
H2O2 8 46.34±2.00## 7 47.55±2.87##
Asc50+H2O2 8 43.82±2.30＊ 8 41.38±4.39＊＊
Asc100+H2O2 8 41.93±1.23＊ 6 42.29±4.74＊
Asc200+H2O2 8 39.32±1.58＊＊ 7 42.13±3.79＊
　＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs H2O2;##P<0.01 vs control.
3　萝摩甙对 H2O2 损伤的神经元MDA含量及 DNA
的影响
　　表 3显示:单独加入 H2O2 时 MDA 含量及 DNA
断裂率明显高于对照组(P <0.01);而同时加入萝摩
甙(100 mg/L)时MDA 含量及 DNA 断裂率则显著低
于单独加入 H2O2组(P<0.01 , P<0.05)。
表 3　萝摩甙对 H2O2 损伤的神经元MDA及 DNA的影响
Tab 3　The effect of Asc on MDA and breaking rate of DNA induced
by H2O2( x±s.n=6)
MDA
(μmol/ g protein)
Break rate
of DNA(%)
Control 　　69.66±15.73 　　32.89±8.56
H2O2 133.66±33.81## 50.65±3.61##
Asc100 71.00±10.35 34.20±7.98
Asc100+H2O2 79.12±14.08＊＊ 42.47±5.70＊
　＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs H2O2;##P<0.01 vs control.
4　萝摩甙对 Fenton反应生成的·OH的清除作用
实验结果表明:随着萝摩甙浓度的增加 , ·OH
的清除率逐渐增加。当萝摩甙的浓度分别为 1 g/L 、
2 g/L、 4 g/L、8 g/L 时 ,其清除率分别为 27.52%、
38.46%、 49.16%、52.49%(见图 1)。
Fig 1　Effect of Asc on clearance rate of·OH.
图1　萝摩甙对羟自由基的清除作用
讨　　论
机体在代谢过程中可产生·OH 等氧自由基 ,而
中间代谢产物 H2O2 亦有很强的氧化作用 。正常生
理条件下体内自由基的产生和清除处于生理性低水
平的平衡状态 ,对人体是必需的 、有利的[ 8] 。而某些
病理情况下如脑缺血时 ,则会出现自由基代谢失衡 ,
致使氧自由基增多 ,导致脂质过氧化作用增强 ,进而
诱发一系列的损伤过程[ 9] 。为寻求一种有效治疗缺
血性脑疾患的新药 ,本研究室从野生萝摩中提取其
有效成分-萝摩甙来观察其对神经元过氧化损伤的
影响。
本实验首先通过脑缺血模型证实了萝摩甙确实
可以减轻脑组织的脂质过氧化作用 ,从而对缺血脑
具有一定的保护作用 。为了进一步阐明萝摩甙的作
用机制 ,我们又作了神经细胞培养 。观察到培养的
皮层神经细胞经过 H2O2 作用后 , LDH 漏出率 、DNA
断裂率以及 MDA 含量均明显升高 ,说明 H2O2 释放
出的氧自由基不但能够引起神经细胞发生脂质过氧
·293·
化 ,造成细胞膜的损害 ,使 LDH 漏出率增高 ,同时也
可造成DNA的损伤。而同时加入萝摩甙后 , LDH 漏
出率 、DNA 断裂率以及 MDA 含量均明显减低 ,进一
步说明萝摩甙具有抗氧自由基作用。此外我们又根
据Fenton反应原理 ,利用 H2O2与 Fe2+反应产生大量
羟自由基来观察萝摩甙对羟自由基有无直接的清除
作用 。结果表明:萝摩甙能够较为明显地直接清除
羟自由基 ,且随着萝摩甙浓度的增高 ,清除率亦明显
增加 。那么萝摩甙是否可通过提高某些保护酶的活
性来清除自由基而进一步发挥其保护神经元的作用
将有待于我们进一步的研究。
[ 参　考　文　献]
[ 1] 　宋俊梅 , 丁霄霖.白首乌中 C21 甾甙及甾甙元清除羟
自由基的功能[ J] .无锡轻工大学学报 , 1998 , 17(2)43-
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[ 2] 　Pulsinelli WA , Buchan AM.The four-vessel occlusion rat
model:method for complete occlusion of vertebral arteries and
control of collateral circulation[ J] .Stroke , 1988 , 19(7):913
-914.
[ 3] 　康劲松 , 祝世功 , Griffin WST , 等.IL-1β 对培养大鼠胆
碱能神经元的影响及机制探讨[ J] .中国病理生理杂
志 , 2000 , 16(7):619-622.
[ 4] 　Koh JY , Choi DW.Quantitative determination of glutamate
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[ 5] 　 Illera VA , Perandones CE , Stunz LL , et al.Apoptosis in
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[ 7] 　金　鸣 ,蔡亚新 , 李金容 ,等.邻二氮菲-Fe2+氧化法检
测H2O2/Fe2+产生的羟自由基[ J] .生物化学与生物物
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[ 8] 　 Halliwell B , Gulleridge JMC.Antioxidants of human
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[ 9] 　Won MH , Kang T , Park S , et al.The alterations of N-
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DNA damage in the CA1 area at the early time after ischemia
-reperfusion insult[ J] .Neurosci Lett , 2001 , 301(2):139-
142.
Study on the protection of Asclepiadaceae against free radical injury
HOU Zhong-chi1 ,WANG Jian-chun2 , KANG Jin-song1 ,
LIU Xiao
1 , GUO Zhong-yu1 , ZHU Shi-gong1 , 3
(1Department of Pathophysiology , 2Combined Function Laboratory , J ilin University , Changchun 130021 , China;
3Department of Physiology and Pathophysiology , Peking University Health Sciences Center , Beijing 100083 , China)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:To study the protection and mechanism of Asclepiadaceae against the damage of neuron by
free radical.METHODS:The model of ischemia and damaged neuron induced by H2O2 was made respectively.The
protection of Asclepiadaceae was observed with the measurement of contents of MDA in brain and cultured neuron ,
transudatory rate of LDH , breaking rate of DNA and clearance rate of ·OH in cultured neuron.RESULTS:
Asclepiadaceae decreased the raising of MDA in brain induced by ischemia.The raising of transudatory rate of LDH ,
breaking rate of DNA and content of MDA inducing by H2O2 in cultured neuron were also observed.The clearance rate of
·OH in cultured neuron increased as the contents of Asclepiadaceae raised.CONCLUSION:The mechanism of
Asclepiadaceae protecting the neuron is related to its ability to clean up free radical.
　　[ KEY WORDS] 　 Ischemia;Neurons;Lactate dehydrogenase;Malondialdehyde;Hydrogen peroxide;
Asclepiadaceae
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