全 文 ：第 39卷　第 3期 厦门大学学报 (自然科学版 ) Vo l. 39　 No. 3
　 2000年 5月 Journal o f Xiamen Univ ersi ty ( Natural Science) May 2000　
文章编号: 0438-0479( 2000) 03-0386-06
氮离子注入对甜菊幼苗生长发育
和 细胞 核 的 影 响
收稿日期: 1999-11-22
基金项目: 国家自然科学基金重大资助项目 ( 19890300)
作者简介: 沈明山 ( 1948- ) ,男 ,副教授 .
沈明山 , 徐金森 , 丁　亮 , 蒋先志 , 陈　亮 , 陈睦传
(厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 , 福建 厦门　 361005)
摘要: 对低能氮离子注入甜菊种子引起的生长发育、细胞核和染色体形态结构的影响进行研究 .结
果表明 ,能量为 75 KeV、剂量为 1014 /cm2的氮离子束注入甜菊种子后 ,种子萌发率下降 ;幼苗期生
长迟缓 ;细胞分裂指数下降 ,异常细胞核和染色体畸变增加 ,细胞核膜凹凸不平 ,核仁解聚 ,部分核质
凝集并被凹陷的核膜包被成颗粒化小区 ,进而形成微核 ,细胞核的形态建成和细胞分裂受到一定的
干扰 .推测这些现象与幼苗期处理种子的早期生长发育迟缓有关 .
关键词　甜菊 ;氮离子注入 ;细胞核 ;染色体
中图分类号　Q 2. 243 文献标识码: A　　　　　　　　　　　　　　　
甜菊 ( Stevia rebaudiana Bertoni )是重要的糖料作物 .其叶片所含八种甜菊糖苷具有广泛
的用途 [1 ] .我国自 70年代后期从日本引种、栽培、加工以来 ,至今已成为世界上最大的甜菊糖
生产和出口大国 .但目前国内种植的甜菊品种老化、混杂、退化严重 ,因此培育抗逆、高产、优
质、高糖苷含量的新品种 ,就成为关键性的研究课题 [1, 2 ] .
利用辐射处理作物种子以得到人们期望的有益变异已有较长的历史 .早在 1927年美国遗
传学家 Muller用 X射线辐射诱发了果蝇的基因突变 .近年来 , Yang和 Tobias[3 ]将玉米种子
放在 Apo llo-Soynz航天飞机上运行 9. 1 d,接受 1 GeV· cm2· g- 1的辐射 ,种植后发现许多叶
片出现黄色条纹 ;同时他们用加速器将 C+ 、 Ne+ 、 Ar+ 、N+ 和 Fe+ 加速到 225～ 500 M eV处理
玉米种子出现相同条纹表型 ,且植株明显矮化 . CoX [4 ]用 20～ 470 KeV·μm- 1的 4He离子等处
理哺乳动物培养细胞 ,可以引起细胞的突变与失活 .在中国将低能离子 ( 30～ 180 KeV )注人
生物体诱变育种技术已引起科技工作者的关注 ,并取得明显的经济效益 ,其中突出的有蔡得田
等人 [ 5]的高频无融合生殖水稻和温敏型黄化水稻 ,棉花、家蚕、大豆、蕃茄、林木等也获得一批
有推广价值的新品系 [6, 7 ] ,杨剑波、余增亮 [ 8]应用低能离子束介导法获得水稻转基因植株 ,又扩
展了低能离子育种的新途径 . 对甜菊的生物学效应初步研究已见舒世珍等人的报道 [9, 10 ] .本
课题采用氮离子束注甜菊种子 ,观察植株生长发育及细胞核的变化 ,试图为阐明诱变机理提供
新的论据 ,为培育甜菊新品种探索新的途径 .
1　材料与方法
1. 1　材　料
经能量 75 KeV、剂量 1014 /cm2的氮离子注入后的纯系丰收二号甜菊种子及其对照 .
1. 2　方　法
1)种子萌发与甜菊栽培观察　将经过低能氮离子注入后的甜菊种子及其对照组分别置于
培养皿内的 4层湿滤纸上 . 25℃恒温培养箱中发芽 ,至第 5 d统计发芽率 .另每组各取 100粒
种子点播于灭菌过的营养土中 ,每样重复点播 3组 ,置防虫光照室内培养 ,观察其萌发率和幼
苗生长发育状况 .
2)细胞核和染色体的观察　种子置于 25℃光照培养箱内浸种发芽 ,待根长 2 cm左右、切
下根尖、放入小培养箱皿 ,用卡诺固定液固定 2 h,蒸馏水洗去固定液 , 60℃ 1 mol /L HCI水
解 , Schif f试剂染色 , 10%的偏重亚硫酸钠漂洗液漂洗 ,置于预冷的载玻片上 ,滴加一滴 45%冰
醋酸 ,压片、镜检、照相 .观察根尖细胞分裂、异形核和染色体畸变的类型 .以间期细胞统计核异
形 (包括微核、核出芽等 )细胞率 .以中、后、末期细胞统计染色体畸变频率 .
3) 4 d龄幼叶细胞核的超微结构观察　经消毒过的种子置 4层湿滤纸上于 25℃光照培养
箱内萌发 .第 4 d的幼叶切成 1× 2 mm2的长条状 ,立即投入预冷的 2. 5%戊二醛液中固定 5
h,经磷酸盐缓冲液洗涤 4次后转入 2% OsO4液中后固定 2 h,漂洗后经乙醇系列脱水 ,环氧树
脂 Epon812包埋 , LKB-880Ⅲ 型超薄切片机切片 ,醋酸双氧铀和柠檬酸铅复染 ,于 JEM -
100CXⅡ型电镜观察照相 .
2　结　果
2. 1　氮离子注入对甜菊种子萌发的影响
如表 1所示 ,经能量 75 KeV、剂量 1014 /cm2氮离子注入后 ,甜菊种子发芽率从 92%下降
至 83% , 4叶龄株数下降 6. 2% ,表明该注入剂量能量对种子的萌发和幼苗的生长发育起一定
的抑制作用 .
表 1　 N+ 注入甜菊种子后对其幼苗生长的影响
Tab. 1　 Effects of N+ implanta tion on the developm ent and g rowth o f Stevia rebaudiana seedlings
组　别 湿滤纸上萌 发 率
灭菌营养土栽培
萌发率 4叶龄比*
实验组 83± 2 78± 5 0. 70± 0. 10
对照组 92± 3 90± 4 0. 80± 0. 15
差异显著性 显　著 显　 著 显 　著
　　　　　　* 12 d测定数据 , 4叶龄株数 /总成苗数 ( 4叶龄株数+ 小于 4叶龄株数 )
·387·第 3期　　　　　　　沈明山等: 氮离子注入对甜菊幼苗生长发育和细胞核的影响　　　　　　　　　　
2. 2　氮离子注入甜菊种子对细胞核和染色体的影响
氮离子注入对根尖细胞分裂表现出抑制效应 .在细胞分裂间期间可明显地观察到细胞核
异常现象 ,在类型上有单微核、双微核、多微核 ,双核 ,核耳和核出芽 (图 1- 6) ,核异常率显著
于对照 (表 2) .
表 2　氮离子注入对根尖细胞分裂和细胞核的影响*
Tab. 2　 Effects of N+ im plantation on the div ision and cell nucleus of roo t tip cells
组别 对照组根尖细胞组 1 组 2 组 3 平均
实验组根尖细胞
组 1 组 2 组 3 平均
差　异
显著性
观察细胞总数 /个 9817 10005 9918 9913± 94 9875 9984 9937 9932± 55 不显著
细胞分裂指数 /(% ) 5. 79 6. 23 5. 54 5. 85± 0. 34 3. 92 4. 70 4. 37 4. 33± 0. 39 显著
核异常细胞率 /(% ) 0. 24 0. 28 0. 25 0. 26± 0. 02 1. 43 1. 06 1. 32 1. 27± 0. 19 极显著
　　* 每组统计 10株苗
氮离子注入甜菊种子后 ,可诱发根尖细胞的染色体畸变 .在供试条件下诱发的染色体畸变
频率显著高于对照 (表 3) .畸变类型表现为落后染色体、染色体桥、游离染色体和断片等 (图 7
～ 9) .其中落后染色体频率较高 .
表 3　氮离子注入对根尖细胞染色体的影响*
Tab. 3　 Effects of N+ implanta tion on the ch romosome o f ro ot tip cells
组别 对照组根尖细胞组 1 组 2 组 3 平均
N+ 注入后根尖细胞
组 1 组 2 组 3 平均
差　异
显著性
细胞观察总数 /个 1000 968 990 986± 16 1000 940 1024 988± 43 不显著
落后染色体 /(% ) 0. 39 0. 46 0. 40 0. 42± 0. 04 2. 84 1. 97 1. 85 2. 22± 0. 39 极显著
染色体桥 /(% ) 0. 02 0. 01 0. 03 0. 02± 0. 01 1. 56 1. 03 1. 34 1. 31± 0. 27 极显著
总畸变频率* /(% ) 0. 48 0. 53 0. 49 0. 50± 0. 03 4. 76 4. 29 4. 60 4. 55± 0. 24 极显著
　　* 包括落后染色体、染色体桥、断片、游离染色体等
2. 3　氮离子注入对 4 d龄幼叶细胞核超微结构的影响
电镜观察结果表明 ,部分细胞核变化明显 ,表现为核仁解聚扩散 ,电子密度下降 ,双层膜凹
凸不平 (图 10) ;部分核质凝聚 ,并被凹陷的核膜包被成颗粒化小区 ,进而形成微核 (图 11) , 此
结果表明细胞核的形态建成和细胞分裂受到一定的干扰 .大部分细胞核未见异常现象 ,双层膜
平滑完整 ,核质分布均一 ,核仁可见 (图 12) ,与非注入组细胞核相似 (图 13) .
3　讨　论
低能离子注入植物种子的细胞生物学效应研究只见程备久等人 [6 ]光学显微镜观察结果的
报道 ,但无法掌握超微结构变化的特点 .本研究从光学显微镜和电子显微镜水平对受 75 KeV、
·388·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　 2000年
10
14
/cm
2的氮离子注入的甜菊种子幼苗根尖细胞和叶片细胞进行观察发现 ,根尖细胞分裂指
数减少 ,异常核比例增加 ,核膜凹陷不平、核质分区化、核仁解聚 ,落后染色体比例提高 ,染色体
桥出现等现象 . 表明该剂量、能量的氮离子处理甜菊干种子干扰、抑制了该种子从萌动后至幼
苗期细胞核的正常生理活动功能 .显然这应该是种子萌发率减少和萌动速度减缓 ,生长发育迟
缓的重要原因 .
尽管低能离子注入能使生物大分子 DN A产生碱基变异 [11 ] ,但至今为止 ,它与体内 DNA
发生哪些作用了解甚少 .核质的颗粒化和微核的出现意味着低能离子能引起体内 DNA的断
裂 .本研究组曾采用 Williams等人 [12, 13 ] RAPD技术分析了该处理组合 ,发现了 8条 DNA多态
性片断 ;可初步推断:氮离子注入可以诱导 DNA的点突变、插加和缺失 [14 ] .本研究发现处理种
子细胞核所发生的众多现象应该与低能离子注入种子细胞核内的 DNA的变化有关 .由于
DNA的这些变化 ,将影响处理种子生长发育早期细胞核的形态、结构 ,染色体的结构与功能 ,
细胞的分裂与细胞的周期 ,甚至有可能引起部分细胞凋亡 .
随着低能离子注入诱变效应和诱变机理研究的深入 ,对于选育抗逆、高产、优质和高糖苷
含量的甜菊新品种将有十分重要的意义 .今后 ,需要进一步开展离子注入诱变引起的细胞学和
分子生物学变化研究 ,以寻找育种的有效注入离子种类、能量、剂量及电荷数 .
致谢: 中国农科院舒世珍研究员、北京师范大学陆挺教授为本研究提供了种子和离子注入材料 ,在此表示
感谢!
参考文献:
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Effect of Ni trog en Ion Implantation on the Grow th and Cell
Nucleus of Stev ia rebaudiana seedling
SHEN Ming-shan, XU Jin-sen, DING Liang,
JIANG Xian-zhi, CHEN Liang , CHEN Mu-chuan.
( The Key Lab of The Ministry of Education fo r Cell biol. and Tumo r
Cel l Engin. , Xiamen Univ. , Xiamen 361005　 China)
Abstract: The ef fect of nit rog en ion implantation on the development and g row th ,
morpho logical changes of cell nucleus and ch romosome o f seeds o f Stev ia rebaudiana Bertoni
w ere Studied. The result show ed that the implanta tion of ni t ro gen ions at 100 KeV× 1014
cm
- 1
inhibi ted signi ficant ly the germinating rate and g row th speed of seeds, leading to a
decrease in division index of roo t tip cel ls, and increase in abnorma l cell nuclei , micronuclei
and chromosomes.
Key words: stev ia rebaudiana; ni t rogen ion implanta tion; cell nucleus; chromosome
·390·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　 2000年
图版说明
图 1～ 13,氮离子注入对甜菊细胞核的影响
1.正常核 ; 2.双微核 ; 3.多微核 ; 4.双核 ; 5.核耳 ; 6.核出芽 ; 7.染色体桥 ; 8.染色体桥+ 落后染色体 ; 9.染
色体桥+ 落后染色体 ; 10.处理组异常细胞核 ,示核仁解聚 ,核膜变形× 20 000; 11.处理组异常细胞核 ,示核
基质分区化 ,微核生成× 20 000; 12.对照组正常细胞核× 14 000; 13.处理组正常细胞核× 10 000
·391·第 3期　　　　　　　沈明山等: 氮离子注入对甜菊幼苗生长发育和细胞核的影响