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正交试验优选元宝草中总黄酮的提取工艺



全 文 :·论著·
正交试验优选元宝草中总黄酮的提取工艺
龚颖珍1,2,郑承剑2,秦路平2(1.福建中医药大学药学院,福建 福州350108;2.第二军医大学药学院生药学教研室,上海
200433)
[基金项目] 上海市科委中药现代化专项 (2011DZ1970502)
[作者简介] 龚颖 珍,硕 士 研 究 生.Tel:13611886074;E-mail:
gyz0929@163.com
[通讯作者] 秦路平,教授.研究方向:生药活性物质基础及其品质
评价研究.Tel:(021)81871300;E-mail:qinsmmu@126.com
  [摘要] 目的 优选元宝草中总黄酮的提取工艺。方法 在单因素试验的基础上,考察乙醇浓度、料液比、提取温度等
因素对元宝草中总黄酮提取率的影响,并采用L9(3)4 正交试验优选最佳提取条件。结果 影响元宝草中总黄酮提取率的因
素顺序为乙醇浓度>料液比>提取次数>提取温度。元宝草最佳提取工艺条件为70%乙醇,提取温度60℃,乙醇用量20
倍,提取次数3次。该条件下元宝草中总黄酮平均得率为2.38%。结论 本实验设计合理、测定方法可行、实验结果可靠,为
大批量从元宝草中提取总黄酮提供了理论依据。
[关键词] 元宝草;总黄酮;提取工艺;正交试验
[中图分类号] R93   [文献标志码] A   [文章编号] 1006-0111(2015)02-0134-04
[DOI] 10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.011
Extraction process on total falvonoids from Hypericumsampsoni by orthogonal
experiments
GONG Yingzhen1,2,ZHENG Chengjian2,QIN Luping2(1.School of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Med-
icine,Fuzhou 350108,China;2.Department of Pharmacognosy,School of Pharmacy,Second Military Medical University,
Shanghai 200433,China)
[Abstract] Objective To optimize the extraction technology of total falvonoids from Hypericum sampsonii.Methods 
On the basis of single factor test,solid-liquid ratio,ethanol concentration,extraction time,extraction temperature and extrac-
tion times on the extraction rate were studied by taking the content of total falvonoids as indexes.Orthogonal test was conduc-
ted to establish the extraction technology of total falvonoids from Hypericum sampsonii.Results The influence degree of fac-
tors on the extraction rate of total falvonoids was in the order of ethanol concentration,solid-liquid ratio,extraction times,and
temperature.The optimum extraction condition was confirmed as folows:ethanol concentration of 70%,extraction tempera-
ture of 60℃,and extraction times of 3×1.5h,solid to liquid ratio of 120.Under this condition,the average extraction rate
of total falvonoids reached 2.38%.Conclusion The test was reasonable in design and credible in findings,and was easily oper-
ated,which could provide scientific basis for the batch extraction of total flavonoids from Hypericum sampsonii.
[Key words] Hypericum sampsonii;total flavonoids;extracting technology;orthogonal test
  元宝草(Hypericum sampsonii Hance)系藤黄
科金丝桃属多年生草本植物,全草入药,广泛分布于
我国长江流域以南各省区[1]。
  近年来研究结果表明,元宝草黄酮类成分是其
主要的抗抑郁活性成分之一[2]。研究者从元宝草中
分离出很多黄酮类成分,其中以芒果苷为代表的呫
酮类成分较多[3]。本课题组前期还从元宝草中分离
出一些新的呫酮,如 hypericumxanthone A[4]和
sampsone C[5]等,呫酮类化合物经研究表明也具有
抗抑郁活性[6]。文献[7]曾以芦丁为对照品,对元宝
草总黄酮的提取工艺进行研究。而多数研究表明芒
果苷在元宝草中含量较高[8,9],笔者认为以芒果苷
作为对照品进行元宝草总黄酮提取工艺考察较为合
理。因此,本实验以芒果苷作为对照品,考察了元宝
草全草中总黄酮的提取工艺。
本实验以总黄酮提取率为考察指标,优选元宝
草中总黄酮的最佳提取工艺条件,进一步明确了元
宝草中总黄酮是否具有抗抑郁活性。
1 材料与仪器
1.1 材料 芒果苷对照品购自上海诗丹德生物技
术公司,批号:05/090507,纯度99%;元宝草全草于
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2012年8月购自安徽亳州,经第二军医大学药学院
生药学教研室秦路平教授鉴定为金丝桃科多年生草
本植物元宝草(Hypericum sampsonii Hance),选
用部位为全草;NaNO2、Al(NO)3、NaOH、乙醇、甲
醇均为分析纯。
1.2 仪器 UV5500紫外分光光度仪,旋转蒸发仪
(RE-52C,上海清浦泸西仪器厂),超声仪(USC-
702,上海波龙电子设备有限公司),粉碎机(DFY-
500,上海鼎广机械有限公司)。
2 方法与结果
2.1 总黄酮含量的测定
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芒果苷对照
品5mg于25ml容量瓶中,甲醇定容,摇匀,配成
0.2mg/ml的对照品溶液。
2.1.2 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液0、
0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.2、1.5ml,分别置于
10ml容量瓶中,分别加入5% NaNO2 溶液0.3ml,
摇匀,放置6min后各加入10% Al(NO3)3 溶液
0.3ml,摇匀,放置6min,再分别加入10% NaOH
溶液4.0ml,再加甲醇至刻度,摇匀,放置15min,在
366nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,浓
度为横坐标,绘制标准曲线,标准回归曲线方程Y=
35.288 X-0.194 1,r=0.999 2。
2.1.3 波长的选择 取芒果苷标准溶液1.0ml,
按标准曲线项下操作,用 UV5500紫外分光光度计
进行测定,芒果苷反应产物在366、316、258nm处
有最大吸收,因316、258nm处干扰大,因此,选择
366nm为测定波长。
2.1.4 供试品溶液的制备 称取5g干燥、粉碎的
元宝草全草,加入70%乙醇50ml回流1.5h,将提
取液抽滤,滤渣在相同条件下提取1次,合并滤液定
容至250ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,稀
释50倍,按标准曲线项下操作,测定吸光度。芒果
苷提取率(%)=(C×N×V/W)×100,式中C为
测定样品溶液中芒果苷的浓度,N 为稀释倍数,V
为最初样品定容体积,W 为样品质量。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度实验 取同一份供试品溶液,按标准
曲线项下操作,重复测定5次,求得RSD=1.4%。
2.2.2 稳定性实验 取同一份供试品溶液,同上操
作,于1、2、3、5、6h测定吸收度,求得RSD=1.2%。
2.2.3 重复性实验 取同一批次元宝草药材样品,
平行制备5份供试品溶液,同上操作,结果RSD=
1.7%。
2.2.4 加样回收率实验 精密量取2ml已测定总
黄酮含量(C=0.199 53mg/ml)的样品液9份,各分
别加入芒果苷对照品溶液(0.2g/ml)1、1、1、2、2、2、3、
3、3ml,同上操作,平均回收率为94.56%,计算
RSD=2.3%。
表1 回收率实验结果(n=9)
样品中总
黄酮含量
(m/mg)
加入芒
果苷量
(m/mg)
测得总
黄酮量
(m/mg)
回收率
(%)
平均回
收率
(%)
RSD
(%)
0.399  0.2  0.571  95.32  94.56  2.3
0.399  0.2  0.581  96.99
0.399  0.2  0.579  96.66
0.399  0.4  0.720  90.11
0.399  0.4  0.758  94.86
0.399  0.4  0.765  95.74
0.399  0.6  0.921  92.19
0.399  0.6  0.937  93.79
0.399  0.6  0.953  95.39
2.3 总黄酮提取工艺单因素试验
2.3.1 乙醇浓度 10倍量、50℃下提取2次,每次
1h,考察30%、40%、60%、80%、95%乙醇浓度,样
品中总黄酮的提取率。结果显示,随着乙醇浓度的
增加,元宝草中总黄酮的提取率先增加后降低,在
80%乙醇浓度时总黄酮提取率达到最大值。
2.3.2 提取时间 10倍量80%乙醇,50℃下提取
2次,考察提取时间0.5、1、1.5、2、2.5h时样品中
总黄酮的提取率。结果表明,随着提取时间的增加,
样品中总黄酮的提取率逐渐增加,当提取时间增加
到1.5h后,总黄酮的提取率趋于平稳。
2.3.3 料液比 80%乙醇在50℃下提取2次,每
次1.5h,考察料液比15,110,115,120,
125时样品中总黄酮的提取率。结果表明,当料液
比为15时,溶剂用量过小,总黄酮提取率较低;当
料液比为115时,总黄酮提取率最高,继续增加料
液比,总黄酮提取率反而降低。
2.3.4 提取温度 10倍量80%乙醇,提取2次,每
次1.5h,考察提取温度40、50、60、70、80℃时样品
中总黄酮的提取率。结果表明,温度70℃时,提取
率最高,当温度升高,提取率趋于平稳。
2.3.5 提取次数 10倍量80%乙醇,50℃、每次
1.5h考察提取1次、2次、3次、4次时样品中总黄酮
的提取率。结果表明,提取次数为2次时总黄酮提取
率达到最大值,3次时平衡,随着提取次数增加,提取
率稍有减少。
2.4 正交试验优选总黄酮的提取工艺 在单因素
试验基础上,选择4个影响较显著的因素:乙醇浓
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度、料液比、提取次数、提取温度,以总黄酮的提取率
(%)为考擦指标,按照L9(34)正交试验表进行试
验,确定元宝草中总黄酮的最佳提取工艺。
表2 正交试验因素水平
水平
A因素
乙醇浓度
(%)
B因素
提取温度
(℃)
C因素
料液比
(倍)
D因素
提取次数
(次)
1  70  60  10  1
2  80  70  15  2
3  90  80  20  3
表3 正交试验设计与结果
序号 A  B  C  D 提取率(%)
1  1  1  1  1  2.040
2  1  2  2  2  2.060
3  1  3  3  3  2.197
4  2  1  2  3  2.107
5  2  2  3  1  2.100
6  2  3  1  2  1.983
7  3  1  3  2  2.017
8  3  2  1  3  1.917
9  3  3  2  1  1.900
K1 2.099  2.054  1.98  2.013
K2 2.063  2.026  2.022  2.020
K3 1.944  2.027  2.104  2.073
R  0.155  0.028  0.124  0.060
表4 SPSS方差分析表
方差来源 平方和 自由度 均方 F值
显著性
(P值)
校正模型 0.2141) 8  0.027  9.349  4.82×10-5
截距 111.874  1  111.874 39 076.347  1.73×10-3
乙醇浓度 0.118  2  0.059  20.565  2.24×10-5
提取温度 0.005  2  0.002  0.842  0.447
料液比 0.072  2  0.036  12.590  3.80×10-4
提取次数 0.019  2  0.010  3.400  0.056
误差 0.052  18  0.003
总计 112.140  27
校正的总计 0.266  26
  F0.05(2,2)=19.0,1)R2=0.806(调整R2=0.720)
由表3中极差R值大小显示,各因素作用主次
为:A>C>D>B,即乙醇浓度影响最大,其次是料
液比和提取次数,提取温度影响最小。从表4的方
差分析结果可以看出,乙醇浓度与料液比对总黄酮
的提取率有较大影响(PA=2.24×10-5<0.05,
PC=3.80×10-4<0.05),而提取温度与提取次数
对总黄酮的提取率影响较小(PB=0.447>0.05,
PD=0.056>0.05)。因此,以 A1B1C3D3为最佳提
取工艺,即70%乙醇,提取温度60℃,乙醇用量20
倍,提取次数3次。
2.5 最佳提取工艺验证 按最佳提取工艺条件
A1B1C3D3 组合进行试验,平行提取3次,总黄酮的
提取率分别为2.41%、2.35%、2.38%,提取率均值
为2.38%,且高于正交试验中的最高值,表明该优
化条件稳定有效。
3 讨论
本实验中曾采用超声、乙醇热回流、水进行提
取,相比较而言,超声的提取效果好,但超声不易用
于大批量工业化生产,水对黄酮的溶解度小,故本实
验采用乙醇提取,具有实用性。
元宝草中黄酮类成分较多[3],例如芦丁、2-
hydroxyxanthone、芒果苷、hyperxanthone等。若采
用高效液相色谱法来检测总黄酮成分,因标准品较
多,不易购买,需通过分离化合物得到其他的标准
品,比紫外分析法复杂;且若采用一测多评,因其相
对校正因子有波动,实测值与计算值之间有误差,主
要问题是由于只有内参物用到了对照品,其他待测
成分无对照品,通过液-质联用等辅助才可确认,有
些目标峰还不确定,相比较而言成本高、方法复杂。
最终决定采用 NaNO2-Al(NO)3-NaOH 法来检测
元宝草中的总黄酮。文献[7]元宝草总黄酮的提取
工艺是以芦丁为对照品,在500nm波长处测其吸
收度,由于呫酮类成分占元宝草总黄酮的比例大[3],
以芒果苷作为对照品能更好地检测元宝草中黄酮的
含量,也为元宝草呫酮类成分的含量测定提供参考,
本课题主要考察芒果苷和总黄酮的抗抑郁活性,则
以芒果苷作对照品更有意义。
近年来研究表明,元宝草具有抗抑郁活性[10],
并可分离出较多的呫酮类成分,且现代药理学研究
表明呫酮类成分也具有抗抑郁活性[6],如芒果苷亦
具有良好的抗抑郁作用[11],这些研究结果加强了元
宝草总黄酮具有抗抑郁作用的依据。本课题以芒果
苷作为对照品,通过单因素和正交试验研究各因素
对元宝草中总黄酮提取率的影响,筛选出总黄酮的
最佳提取工艺,为大批量从元宝草中提取总黄酮提
供理论依据,为以后进一步研究黄酮类成分抗抑郁
活性提供参考。
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[收稿日期] 2013-10-17 [修回日期] 2014-03-17
[本文编辑] 李睿旻
(上接第105页)
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[收稿日期] 2013-11-18 [修回日期] 2014-04-09
[本文编辑] 陈 静
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药学实践杂志 2015年3月25日第33卷第2期
Journal of Pharmaceutical Practice,Vol.33,No.2,March 25,2015