全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2007年第4期
收稿日期:2007-02-12
基金项目:福建省科技重大专项(2004NZ02-2)资助项目
作者简介:韩牙琴(1980-),女,硕士生,研究方向:观赏植物生物技术
通讯作者:赖钟雄(1966-),男,研究员,博士生导师。研究方向:园艺植物生物技术与遗传资源;E-mail:Laizx01@163.com
随着分子生物学的发展,在转基因材料检测、稀有材料的分子生物学等研究中,微量基因组 DNA提取
的越来越重要。目前微量基因组 DNA提取的样品量在 5~100mg之间。在水稻[1]、拟南芥[2]、芜菁[3]、棉花[4]、西
瓜和水仙[5]等草本植物中已经有一些微量基因组 DNA提取方法的报道。但是,由于木本植物基因组 DNA
提取难度较大,在微量基因组 DNA提取方法上进展不大。一般木本植物[6]提取基因组 DNA提取的样品量
在 500mg以上。在柑桔类中一般所需样品量甚至高达 3~8g[7],目前木本植物提取基因组 DNA的样品量至
少也要 100mg以上,在柑桔上报道的所需样品量较少的有柠檬、酸橙原生质体融合杂种 100mg[8]和柑桔杂
交种 150mg[9],很难满足一些分子生物学研究的需要。因此,建立木本植物微量基因组 DNA提取方法十分
必要。鉴于此,我们以柑桔类的四季桔为材料,探索一种微量、快速的基因组 DNA提取方法,以期为柑桔类
的分子生物学和基因组研究提供更好的技术手段。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为培养 45d左右的四季桔(CitrusmicrocarpaBonge.)珠心胚试管苗。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 DNA的提取步骤如下:① 称取 20mg四季桔试管胚苗置于 1.5ml的 Eppendorf离心管
中,加入适当液氮,用自制的圆尖头玻棒进行组织研磨,磨至粉末状后加入 200μlCTAB缓冲液和 4μl2-巯
四季桔试管苗基因组DNA微量提取方法
韩牙琴 林琳 赖钟雄
(福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州 350002)
摘 要: 本试验以四季桔试管苗为试材,进行基因组DNA微量、快速提取方法的研究。结果表明:采用改良CTAB
法,仅需20mg样品、2.5h就能获得高纯度、高质量的DNA,这是目前木本植物样品量最小的DNA提取方法;提取的DNA
能直接被限制性内切酶BamHⅠ酶切,也能进行PCR扩增,可用于进一步的分子生物学研究。
关键词: 四季桔 试管苗 基因组DNA 微量提取 PCR 酶切
ARapidMethodforTraceGenomicDNAExtractionfrom the
TubePlantletsinCitrusmicrocarpaBonge
HanYaqin LinLin LaiZhongxiong
(InstituteofHorticulturalBiotechnology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002)
Abstract: ArevisedmethodofCTABfortraceandrapidextractionofgenomicDNAfromthetubeplatletswas
developedinCitrusmicrocarpaBonge.Theexperimentalresultsshowedthatthehigh-qualityandhigh-purityDNAwas
obtainedbytherevisedCTAB methodfrom only0.02gsampleforonly2hours,whichwastheminimum ofthe
sampleforgenomicDNAextractioninwoodyplants;andtheextractedDNAcouldbedigestedbyBamHⅠandusedfor
thePCRanalysisforfurtherstudiesonmolecularbiology.
Keywords: CitrusmicrocarpaBonge TubeplantletDNA PCR Enzymaticdigestion
DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2007.04.039
2007年第4期
基乙醇。②混匀后,65℃水浴 30～45min,每 10min取出轻摇混匀一次。③水液至另一离心管,加入等体积氯
仿,轻混匀,4℃,12000r/min离心5min。⑤氯仿重复抽提一次。⑥取上相清液至另一离心管,加 1/10体积
3mol/LNaAc;慢慢地加入 2倍体积无水乙醇,轻混匀,此时可见核酸以纤维状沉淀。⑦低速离心几分钟,倒
掉上清,管壁上的白色沉淀就是 DNA,75%乙醇洗涤 2～3次,自然风干沉淀。⑧风干后,加入 30μlTE缓冲
液溶解,移至 0.5ml离心管中保存备用。⑨取 10μlDNA初提液中,加入 2.5μlRNaseA(10mg/ml),37℃,温浴
30min。加等体积氯仿-异戊醇(24:1)抽提一次,除去 DNA中残留的 RNA。⑩重复步骤⑥～⑦,风干后,加入
10μlTE缓冲液溶解,移至 0.5ml离心管中保存备用。
1.2.2 DNA质量检测 取 5μlDNA初提液,双蒸水稀释至 1ml,1ml双蒸水作参照,紫外分光光度计上测
定其 260nm和 280nm的 OD值,并结合 1.0%琼脂糖凝胶电泳判断 DNA的纯度和质量。
1.2.3 DNA酶切及电泳 酶切反应液总体积为 50μl,其中 5μl10×SEBufer,5μlBSA,5μgDNA,2.5μl内
切酶 BamHⅠ(20U/μl),补无菌水至 50μl。混匀后置于 37℃酶切 3～5h。酶切产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电
泳,凝胶用溴化乙锭染色后在紫外透射仪上观察并照相。
1.2.4 PCR扩增及电泳 PCR反应液总体积为 25μl,其中含 2.5μl10×PCRBufer,3.0μldNTPs(200μmol/
L),56ng模板 DNA,1.0μl引物,1.0unitTaq酶,17.1μlddH2O。反应程序为:94℃预变性 4min,94℃变性 1min,
38℃退火 90s,72℃延伸 2min,共循环 45轮,最后在 72℃中保温 10min。扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电
泳,凝胶用溴化乙锭染色后在紫外透射仪上观察并照相。
2 结果与分析
2.1 四季桔基因组 DNA微量提取与纯度分析
本试验以 20mg四季桔珠心胚试管苗为材料,进
行基因组 DNA微量提取。经纯化沉淀后的 DNA呈
乳白色,透明胶状物不明显,室温下,加入 TE缓冲
液,数秒内溶解。紫外分光光度计分析结果如表 1。
从表 1可以看出,本方法提的几个样品经纯度测定
A260/A280均达到 1.70~1.85,提取的 DNA的浓度在
500～600ng/μl,表明所提取 DNA质量较好,得率高。
进一步去除 RNA后,DNA样品电泳检测结果见
图 1。从图 1可以看出,点样孔亮几乎无亮度,主带
明显。说明此方法确实能有效降低多糖对 DNA的污
染,RNA去除也完全,获得的 DNA纯度高,质量好。
整个 DNA提取过程,所需时间很短,约 2.5h。
2.2 四季桔基因组 DNA酶切结果分析
本试验用内切酶 BamHⅠ酶切本方法提取的
DNA样品,电泳检测结果见图 2,从图 2可以看出,
DNA样酶切后均能得到一片弥散的泳道。说明本方
法提取的 DNA纯度达到酶切的要求。
2.3 四季桔基因组 DNA的 PCR扩增结果分析
本试验随机选取 19种 sangon公司产的 10-mer引物进行 RAPD分折,以本试验提纯的一个 DNA样品
做为模板。电泳检测结果表明每种引物均能扩增出 3～8条或更多的 DNA片段,通过琼脂糖凝胶电泳可得
以清楚地分离,结果见图 3。RAPD扩增条带清晰;实验操作简单、不需昂贵的仪器设备、用时短(2.5h);产
品纯度高又适合 RAPD分析,效果理想。
表 1 四季桔试管胚苗的 DNA样品纯检测结果
韩牙琴等:四季桔试管苗基因组DNA微量提取方法 111
生物技术通报Biotechnology Buletin 2007年第4期
3 讨论
3.1 四季桔基因组 DNA微量提取的关键技术
本试验以改良的 CTAB法,仅需 0.02g的观赏四季桔试管苗就可获得高纯度的 DNA,且前后所用时间
仅需 2.5h,时间短,所需样品量极少。与天根生化的微量 DNA试剂盒提取方法相比,本方法最大的长处在
于所用药品常规,所耗经费少,但提取效果相当,所耗时间也只相差 30~45min。王三红等[10]认为柑桔类植物
叶片内富含酚类、多糖及单宁类物质,故较一般植物的总 DNA的提取难度大。本试验以试管苗为材料,由
于培养后期,培养基养份己耗尽,四季桔试管苗叶片中没有积累酚类等物质,降低了总 DNA的提取难度,
与巩振辉[3]将植株在暗室放置 2～3d,以期降低叶片中可溶性碳水化合物的含量,从而可提高提取 DNA的
纯度的原理相同。这是本试验的关键技术之一。其次,本试验采用改良的 CTAB法,以 3mol/LNaAc和无水
乙醇来代替异丙醇沉淀 DNA,尽量简化的步骤减少总 DNA的损失获得了足量的柑桔总 DNA,既提高了工
作效率,又降低了试验成本。高质量 DNA是试验结果可靠并具良好重复性的保证,通过质量检验,本试验
所抽提的 DNA质量较高,达到 RAPD分析的要求,并为后来 DNA酶切结果和 PCR扩增效果所证实。
3.2 四季桔基因组 DNA基因组提取方法的应用价值
基因组 DNA的微量提取在 Southernbloting、基因克隆 (染色体步移、启动子结构分析、基因结构分
析)、DNA文库构建、转基因植株检测等分子生物学研究中有重要的应用价值。本试验所用材料少,是目前
报道的柑桔类植物 DNA提取中所用材料最少的一种提取方法。该 快速、微量 DNA提取方法,为柑桔类的
分子生物学和基因组研究提供了更好的技术手段;其样品量也是目前本本植物基因组 DNA提取方法中最
小的,对其他木本植物微量基因组 DNA提取方法的建立有重要参考价值。
参考 文献
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2 杨 双,阮燕晔,樊金娟,等.沈阳农业大学学报,2005,36(1):99～100.
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10 王三红,陈力耕,陈大明.南京农业大学学报,1999,22(3):17～20.


图 3 同一胚苗 19条不同引物的 PCR扩增结果
引物从左到右依次为:DNAmarker,1:S82:S283:S644:S715:S926:
S907:S998:S1479:S15410:S23011:S15512:S23613:S23714:
S23815:S25316:S25517:S26118:S26619:S268
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