全 文 ：第 30 卷　第 10期　 　中 南 林 业 科 技 大 学 学 报　 　Vol.30　No.10
　2010 年 10 月 Journal of Central South University of Forestry &Technology 　Oct.2010
川桂叶总黄酮清除 DPPH ·自由基作用的研究
李姣娟1 ,周尽花1 ,戴　瑜1 ,黄克瀛2
(中南林业科技大学 a.应用化学研究所;b.材料科学与工程学院 , 湖南 长沙 410004)
摘　要:　用 DPPH·自由基检测法测定了川桂叶总黄酮清除自由基的生物活性。 在波长为 517 nm , 反应时间 45
min 的条件下测定了川桂叶总黄酮 、芦丁和二丁基羟基甲苯(BH T)清除 DPPH 自由基的 EC50值。结果表明 ,川桂
叶总黄酮对 DPPH·自由基具有明显的清除作用 ,川桂叶总黄酮 、芦丁和 BHT 清除 DPPH·自由基的 EC50值分别
为 4.145 mg/ L、9.650 mg/ L、37.91 mg/ L ,清除 DPPH·自由基能力的大小顺序为川桂叶总黄酮>芦丁>BHT 。
关键词:　应用化学;川桂;叶;总黄酮;二苯代苦味肼基自由基
中图分类号:　S792.23;Q949 , 747.5 文献标志码:　A 文章编号:　1673-923X(2010)10-0125-05
Scavenging of DPPH radical by total flavonoids extracted from leaves of
Cinnamomumwilsonii Gamble
L I Jiao-juan1 , ZH OU Jin-hua1 , DAI Yu1 , HUANG Ke-y ing2
(1.Institute o f Applied Chemistry , Central South Univ ersity of Forestr y and Technology , Changsha 410004 ,
Hunan , China;2.Schoo l of M aterial Science and Engineering , Central South Univer sity o f Fo restry and
Technology , Changsha 410004 , H unan , China)
Abstract:The to tal flav onoids we re ex tracted fr om Cinnamomum Wi lsonii Gamble leaves.Their r adical scaveng ing
activities were determined by using DPPH radical scavenging method.EC50 values o f the to ta l flav onoids f rom Cin-
namomum Wilsonii Gamble leave s , Rutin and BH T on DPPH radical scaveng ing we re determined under w aveleng th
of 517 nm and reaction time of 45 min.The re sults show ed that the total flav onoids f rom Cinnamomum Wilsonii
Gamble leaves have mo re significant effec ts on DPPH radical scavenging.EC50 values of the to tal f lavonoids from
Cinnamomum Wilsonii Gamble leaves , Rutin and BH T are 4.145 mg/ L , 9.650 mg/ L and 37.91 mg/ L , respective-
ly.The sequence of radical scavenging ability is the total flavono ids>Rutin>BH T.
Key words:applied chemistry;Cinnamomum wilsonii Gamble;leave s;total flavono ids;2 , 2-dipheny l-1-pic rylhydra-
zyl radical
　　植物黄酮类化合物具有一定的抗氧化活性 ,是
一类有效的抗氧化剂 ,不仅可以清除人体内的游离
自由基 ,而且能抑制自由基的产生 ,起到预防衰老 、
心血管疾病和癌症等作用 ,因而广泛应用于食品 、
医药保健品和化妆品等行业[ 1] 。植物黄酮类化合
物清除自由基能力的测定方法有很多种[ 2-3] ,其中
二苯代苦味肼基自由基(DPPH ·)检测法是通过
DPPH ·分子中一个稳定的自由基与抗氧化剂提供
的一个电子配对结合 ,使 DPPH ·的特征紫色消
失 ,其褪色程度与抗氧化剂的清除自由基能力呈定
量关系 ,具有稳定性好 、简便易行 、灵敏可靠 、不需
要昂贵的仪器设备等优点[ 4-5] ,因此广泛应用于自
　　收稿日期:2010-06-08
　　基金项目:湖南省教育厅基金资助项目(07C811)
　　作者简介:李姣娟(1965-),女 ,湖南新化人 ,副教授,主要从事天然产物化学与利用方面的研究
DOI :10.14067/j.cnki.1673-923x.2010.10.019
由基清除剂的筛选和研究工作 。
川桂 Cinnamomum wilsonii Gamble 为樟科芳
香植物 ,常绿乔木 ,分布于湖北 、四川 、湖南 、广西 、
广东 、江西和陕西等省(区)[ 6] 。川桂叶中除含有浓
烈芳香气味的挥发油外[ 7-9] ,也含有较高含量的黄
酮类化合物[ 10] 。对川桂叶黄酮的生物活性的研究
鲜有文献报道。笔者采用川桂叶总黄酮进行清除
DPPH·自由基生物活性的试验研究 ,以期为川桂叶
功能产品的开发和提高川桂的经济价值提供理论
依据 。
1　材料与方法
1.1　材　料
川桂叶样品采集于湖南省新化县海拔 800 m
山坡的野生川桂树 ,经洗净 、阴干 、粉碎 、过孔径 0.6
mm 筛 ,用石油醚作溶剂脱脂 ,除去石油醚后贮存于
试剂瓶中 ,置暗处保存备用。
1.2　仪器与试剂
主要仪器:FN101-3A 型电热恒温鼓风干燥
箱(长沙仪器厂);AUY220 型电子分析天平(岛津
(香港)有限公司);FW100型高速万能粉碎机(天津
市泰斯特仪器有限公司);UV-1100 型紫外可见分
光光度计(北京瑞利分析仪器公司);R201C 型旋转
蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司);DZF-6050 型
真空干燥箱(上海精密实验设备有限公司)。
主要试剂:二苯代苦味肼基自由基 (DPPH·),
美国 Sigma Aldrich 公司产品;芦丁 ,生化试剂;二
丁基羟基甲苯(BHT),食品级;无水乙醇 、95 %乙
醇(体积分数)、氯仿 、亚硝酸钠 、硝酸铝和氢氧化钠
均为国产分析纯试剂 。
1.3　实验方法
1.3.1　川桂叶总黄酮的提取
称取一定质量的脱脂川桂叶粉 ,用体积分数 70
%的乙醇作溶剂 ,在水浴温度 80℃、料液比 1∶20
(g :mL)的条件下连续回流提取 2 次 ,每次时间
1.5 h ,合并提取液 。将提取液用旋转蒸发仪浓缩 ,
浓缩液再经 CHC l3 萃取 、醇沉 、过滤后 ,将滤液浓
缩成膏状 ,置于真空干燥箱中干燥 ,得到川桂叶黄
酮测试样品 。利用 NaNO2-Al(NO 3)3-N aOH 显色
法测得样品中总黄酮的含量为 6.469 %。
1.3.2　DPPH·自由基清除率的测定
(1)川桂叶黄酮样品溶液的配制　准确称取川
桂叶黄酮样品 0.2297 g ,置于 50 mL 小烧杯中 ,用
少量 95 %乙醇溶解后 ,定量转移到 50 mL 容量瓶
中 ,用 95 %乙醇稀释至刻度 ,摇匀 ,得到固含物浓
度为 4.594 g/L 的川桂叶黄酮样品溶液 。吸取该
溶液5.0 mL 放入50 mL 容量瓶中 ,用95 %乙醇稀
释至刻度 ,摇匀 ,得到固含物浓度为 0.4594 g/ L 的
川桂叶黄酮样品溶液 。
(2)BHT 溶液的配制 　准确称取 BH T
0.252 5 g ,置于 50 mL 小烧杯中 ,用少量 95 %乙醇
溶解后 ,定量转移到 50 mL 容量瓶中 ,用 95 %乙醇
稀释至刻度 ,摇匀 ,得到 5.050 g/ L BHT 溶液。吸
取该溶液 5.0 mL 放入50 mL 容量瓶中 ,用95 %乙
醇稀释至刻度 ,摇匀 ,得到 0.5050 g/ L BHT 溶液。
(3)芦丁溶液的配制　准确称取芦丁 0.101 8
g ,置于 50 mL小烧杯中 ,用少量 95 %乙醇溶解 ,定
量转移到 200 mL 容量瓶中 ,用 95 %乙醇稀释至刻
度 ,摇匀 ,得到 0.509 0 g/ L 芦丁溶液。吸取该溶液
10.0 mL 放入 50 mL 容量瓶中 ,用 95 %乙醇稀释
至刻度 ,摇匀 ,得到 0.101 8 g/ L 芦丁溶液。
(4)DPPH·贮备液的配制　准确称取 DPPH·
试剂 0.256 0 g ,置于50 mL 小烧杯中 ,用少量95 %
乙醇溶解后 , 定量转移到 1 000 mL 容量瓶中 ,用
95 %乙醇稀释至刻度 , 摇匀 , 得到 0.256 0 g/L
DPPH·贮备液 ,冷藏于冰箱中 ,备用 。
(5)DPPH·自由基清除率的测定　将 DPPH·
贮备液稀释至 25.60 mg/ L。吸取 10份 5.0 mL 浓
度为 25.60 mg/L 的 DPPH·溶液 ,分别加入 0.1 、
0.2 、0.3 、0.4 、0.5 、0.6 、0.7 、0.8 、0.9 和1.0 mL
固含物浓度为 0.459 4 g/L 的川桂叶黄酮样品溶
液 ,用 95 %乙醇补充至总体积为 6.0 mL ,混匀并
放置一定时间后 ,以 95 %乙醇为参比 ,用 1 cm 比
色皿于 517 nm 处测定吸光度 ,记为 A1;相等体积
的川桂叶黄酮样品溶液用 95 %乙醇稀释 ,使溶液
总体积为 6.0 mL ,相同条件下测定吸光度 , 记为
A2 ;取 5.0 mL 25.60 mg/L DPPH·溶液与1.0 mL
95 %乙醇混合 ,相同条件下测定吸光度 ,记为 A0 。
按式(1)计算 DPPH·清除率Y :
Y = 1-A1 -A2
A0
×100%。 (1)
126 李姣娟 ,等:川桂叶总黄酮清除 DPPH·自由基作用的研究　 　第 8 期
按照同样的方法 , 在 5.0 mL 浓度为 25.60
mg/L 的 DPPH ·溶液中加入一系列不同体积的
0.101 8 g/L 的芦丁溶液和0.505 0 g/L 的BH T 溶
液 ,分别测定芦丁和 BHT 对 DPPH·的清除率 。
2　结果与讨论
2.1　DPPH·吸收光谱曲线与测定波长的选择
DPPH·是一种很稳定的含氮自由基 ,在乙醇溶
液中呈典型的紫色 ,当其与自由基清除剂作用时 ,
生成无色产物 ,使溶液的典型紫色变浅 ,吸光度降
低。将 DPPH·乙醇溶液和分别加有少量川桂叶黄
酮样品 、芦丁 、BH T 的 DPPH·乙醇溶液在 280 nm
～ 680 nm 波长范围内进行扫描测定 ,结果如图 1
所示 。
　　1.DPPH·乙醇溶液;2.DPPH·乙醇溶液 +黄酮样品;
3.DPPH·乙醇溶液 + BH T;4.DPPH·乙醇溶液 +芦丁
图 1　DPPH·的吸收光谱曲线
Fig.1　Curves of DPPH·absorption spectra
从图 1 可知 , DPPH·乙醇溶液在 327 nm 和
517 nm波长处的吸光度都有极大值 ,具有强吸收
峰 ,加入少量川桂叶黄酮样品 、芦丁和BHT 后 ,DP-
PH·与它们发生作用 ,使这 2 个峰的吸光度都降
低 ,而且 517 nm 波长处的吸光度降低较显著。为
了提高测定结果的灵敏度和准确度 ,根据“吸收最
大 、干扰最小”的原则 ,选择 517 nm 作为测定波长。
2.2　DPPH·溶液的稳定性能及反应时间的确定
为了了解 DPPH·溶液在抗氧化剂作用下的稳
定性能 ,确定川桂叶黄酮 、芦丁和 BH T 对 DPPH·
的清除速率和反应时间 ,吸取 3 份 5.0 mL 浓度为
25.60 mg/L 的 DPPH·乙醇溶液 , 分别加入 0.5
mL 川桂叶黄酮样品溶液 、芦丁溶液和 BHT 溶液 ,
摇匀 ,于 517 nm 波长处每隔3 min ～ 5 min测定溶
液的吸光度 ,观察溶液吸光度随时间的变化规律 ,
直到吸光度基本稳定 。测定结果如图 2所示 。
图 2　DPPH·的吸光度随时间的变化曲线
Fig.2　Change curves of DPPH·absorbance with time
从图 2可知 , DPPH·溶液在抗氧化剂的作用
下 ,吸光度的下降趋势随着时间的增加而逐渐趋于
平缓 ,最后达到基本稳定 ,而且不同抗氧化剂对自
由基的清除速率和清除效果也不相同。川桂叶黄
酮样品 、芦丁和 BHT 与 DPPH·反应 ,达到吸光度
基本稳定的时间分别为 21 、35和45 min ,显然川桂
叶黄酮样品与 DPPH·反应达平衡的时间最短 ,清
除速率最快 ,芦丁对 DPPH·的清除速率次之 ,BH T
的清除速率最慢 。因此在测定川桂叶黄酮样品 、芦
丁和 BHT 对 DPPH·的清除率时 ,选取与 DPPH·
反应的时间为 45 min 。
2.3　DPPH·溶液吸光度与浓度的关系曲线
在 10个 10 mL 容量瓶中 ,用吸量管分别加入
25.60 mg/ L DPPH·标准溶液 1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、
5.0 、6.0 、7.0 、8.0 、9.0和 10.0 mL ,分别用 95 %乙
醇稀释 、定容 ,摇匀 ,以 95 %乙醇为参比 ,用 1 cm
比色皿 ,在 517 nm 波长处测定各溶液的吸光度。
以 DPPH·溶液的质量浓度(ρ)为横坐标 ,吸光度
(A)为纵坐标绘制吸光度与浓度的关系曲线 ,如图
3所示。
从图 3 可知 ,在 2.560 mg/L ～ 25.60 mg/L
范围内 ,DPPH·溶液的质量浓度与溶液的吸光度之
127第 30 卷　　　　 　中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
间呈现良好的线性关系 ,说明 DPPH·溶液的吸光
度在一定范围内可以表示溶液中 DPPH·浓度的大
小。其线性方程为:A =0.0016 + 0.0263ρ, R =
0.999 9 。
2.4　几种抗氧化剂的 DPPH·清除率曲线及清除
能力评价
　　根据 1.3.2节中的 DPPH·自由基清除率的测
定方法 ,分别测定川桂叶黄酮样品 、芦丁和 BHT 对
DPPH·的清除率 。以清除率对抗氧化剂溶液的加
入量作图 ,得到川桂叶黄酮样品 、芦丁和 BH T 三种
不同抗氧化剂的清除率曲线 ,如图 4所示 。
从图 4可知 ,川桂叶黄酮样品 、芦丁和 BHT 对
DPPH·均具有明显的清除效果 ,而且随着这三种抗
氧化剂加入量的增大 ,清除率也随之增大 ,但增大
的趋势在抗氧化剂的加入量达到一定值后趋于平
缓。同时在抗氧化剂的加入量较低时 ,DPPH·的清
除率Y 与各种抗氧化剂的加入量 X 之间呈近似线
性关系 ,各线性方程如表 1所示。
图 3　DPPH·溶液的吸光度与质量浓度的关系曲线
Fig.3　Curves of DPPH·absorbance and mass concentra-
tion
　
图 4　抗氧化剂的清除率曲线
Fig.4　Curves of scavenging rate of antioxidants
表 1　清除率与抗氧化剂加入量的线性关系及抗氧化剂的 EC50值
Table 1　The linearity of scavenging rate and antioxidant adding amounts , and EC50 value of antioxidants
试样 线性方程 R 线性范围/mL EC50/(mg· L-1)
川桂叶黄酮样品 Y =4.624 17 + 54.218 33X 0.999 46 0.1 ～ 0.9 4.145(以总黄酮计)
芦丁 Y = 1.995 71 + 84.396 43X 0.999 68 0.1 ～ 0.7 9.650
BH T Y = 6.569 + 96.43X 0.999 35 0.1 ～ 0.5 37.91
　　为了评价抗氧化剂的自由基清除能力 ,常选择
自由基清除率达到 50 %时抗氧化剂的浓度(EC50)
作为评价指标。EC50值越小 ,表示抗氧化剂清除自
由基的能力越强 ,反之 , EC50值越大 ,表示抗氧化剂
清除自由基的能力越弱 。根据清除率与抗氧化剂
加入量之间的线性关系以及溶液浓度与体积之间
的换算关系 ,计算出川桂叶黄酮样品 、芦丁和 BH T
的 EC50值如表 1所示。
从 EC50值可知 ,当川桂叶黄酮样品 、芦丁和
BH T 对 DPPH·的清除率达到 50 %时 ,川桂叶总
黄酮的浓度最小 ,说明川桂叶总黄酮对 DPPH·的
清除能力最强 ,三种抗氧化剂清除 DPPH·能力的
大小顺序为:川桂叶总黄酮>芦丁>BHT ,可见川
桂叶总黄酮是一种很好的自由基清除剂 。
3　结　论
(1)DPPH·自由基检测法可以用于测定川桂
叶总黄酮 、芦丁和 BH T 对自由基的清除能力 ,测定
条件为:测定波长 517 nm ,清除反应时间 45 min。
(下转至第 132页)
128 李姣娟 ,等:川桂叶总黄酮清除 DPPH·自由基作用的研究　 　第 8 期
性模型;其次 ,考察了各点缺货量和系统缺货量的
概率特征 。然而 ,对物流网络的可靠性与供需点数
量 、连接弧数量 、供应点能力的量化分析 ,有待进一
步的研究 。
参考文献:
[ 1] 　郑　兵.国外物流服务质量研究述评[ J] .管理学报 , 2007.5:
373-378.
[ 2] 　周正嵩.基于动态模糊理论的物流服务质量综合评价[ J] .价
值工程 , 2007 , 5:373-378.
[ 3] 　田　宇.论物流服务质量管理—兼与王之泰教授商榷[ J] .物
流科技 , 2001 , 12(24):3-8.
[ 4] 　谢　政 , 李建平.网络算法与复杂性理论[ M] .长沙:国防科
技大学出版社 , 1995.
[ 5] 　梁雄健 , 孙青华.通信网可靠性管理[ M ] .北京:北京邮电大
学出版社 , 2004.
[ 6] 　Jordan W C , Graves S C.Principles on the Benef it s of Manu-
f acturing Proces s Flexibili ty [ J] .Management S cien ce , 1995,
41(4).
[ 7] 　Bassamb oo A S , Chopra , Daskin M.Flexibi li ty and Fragili ty in
S upply Chain Netw ork Design[ J] .Wo rking Paper , 2008.
[ 8] 　魏宗舒.概率论与数理统计教程[ M] .北京:高等教育出版
社 , 1983:118-133.
[本文编校:邱德勇]
(上接第 128页)
　　(2)川桂叶总黄酮 、芦丁和 BHT 对 DPPH·均
具有一定的清除作用 ,而且在一定范围内 ,对 DP-
PH·的清除率与抗氧化剂的加入量呈近似线性关
系。川桂叶总黄酮 、芦丁和 BH T 三种抗氧化剂的
EC50分别为 4.145 、9.650 、37.91 mg/ L ,清除 DP-
PH ·能力的 大小顺序为:川桂叶总 黄酮 >
芦丁>BHT 。
(3)川桂叶总黄酮对 DPPH·不仅具有明显的
清除作用 ,而且与 DPPH·反应速率快 ,达到平衡的
时间短 ,是一种具有开发潜力的天然植物自由基清
除剂 。
参考文献:
[ 1] 　郑德勇 , 安鑫南.植物抗氧化剂研究展望[ J] .福建林学院学
报 , 2004 , 24(1):88-91.
[ 2] 　宋怀恩 ,闻　韧.抗氧化剂筛选方法的研究进展[ J] .中国药物
化学杂志 , 2003 , 13(2):119-124.
[ 3] 　郑晶泉.抗氧化剂抗氧化实验研究进展[ J] .国外医药(卫生学
分册), 2000 , 27(1):37-40.
[ 4] 　Choi C W , Kim S C , Hw ang S S , et al.Antioxidan t Act ivi ty
and Free Radical Scavenging Capaci ty betw een Korean Medi-
cine Plan ts and Flavonoids b y Assay-guided Comparis on [ J] .
Plant S cience , 2002 , 163:1161-1168.
[ 5] 　Lu Y R , Foo L Y.An tioxidant and Radical S cavenging Activi-
t ies of Polyphenols f rom Apple Promace [ J] .Food Chemis-
t ry , 2000 , 68:81-85.
[ 6] 　肖培根.新编中药志(第三卷)[ M ] .北京:化工出版社,
2002:645.
[ 7] 　陶光复 ,孙汉董 ,丁靖垲.湖北川桂叶精油的化学成分[ J] .武
汉植物学研究 , 2002 , 20(2):162-164.
[ 8] 　王发松 ,杨得坡 ,任三香 ,等.川桂叶挥发油的化学成分与抗菌
活性研究[ J] .武汉植物学研究 , 2000 , 18(4):321-324.
[ 9] 　李姣娟 ,黄克瀛 ,龚建良 ,等.不同方法提取川桂叶挥发油的比
较研究[ J] .中南林业科技大学学报 , 2007 , 27(2):104-108.
[ 10] 　李姣娟 ,黄克瀛 ,龚建良 ,等.川桂叶中黄酮类化合物的提取
与测定[ J] .光谱实验室 , 2009 , 26(3):530-534.
[本文编校:邱德勇]
132 陈德良 , 等:物流网络的可靠性及概率特征研究　 　第 8 期