全 文 ：第 26卷 ,第 3期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 6 , No . 3
2 0 0 9年 5月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory May , 2 0 0 9
川桂叶中黄酮类化合物的提取与测定①
① 湖南省教育厅基金资助项目 ( 07C811)
② 联系人 ,手机: ( 0) 13755112865; E-mail: lijiaojuan2005@ 163. com
作者简介:李姣娟 ( 1965— ) ,女 ,湖南省新化县人 ,副教授 ,学士 ,主要研究方向为天然产物化学与利用。
收稿日期: 2008-08-19;接受日期: 2008-11-26
李姣娟②　黄克瀛a　龚建良a　周尽花　陈丛瑾a
(中南林业科技大学应用化学研究所　长沙市韶山南路 498号　 410004)
a(中南林业科技大学材料科学与工程学院　长沙市　 410004)
摘　要　采用加热回流法提取川桂叶中的黄酮类化合物 ,建立了川桂叶中总黄酮含量测定的光谱分
析方法。结果表明: 以芦丁为标准品 ,用 NaNO2-Al( NO3 )3-NaOH显色法可测定川桂叶中总黄酮的含量 ,该
方法的精密度和准确度均较高 ,相对标准偏差为 0. 63% ,方法的回收率为 97. 18%— 102. 20%。 通过正交
试验优化 ,得到提取川桂叶中黄酮类化合物的最佳工艺条件是:用体积分数为 70%的乙醇作溶剂 ,在固液
比 1∶ 20( g /m L)、提取温度 80℃的条件下提取 1. 5h,连续提取 2次。 测得川桂叶中总黄酮含量为 22. 53
mg· g- 1。
关键词　川桂叶 ;黄酮类化合物 ;提取 ;分光光度法
中图分类号: O657. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2009) 03-0530-05
1　引言
黄酮类化合物是植物中分布最广的一类物质 ,是许多中草药的有效成分之一 ,具有抗氧化、清
除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保护心血管、免疫调节等多种功能 ,在食品和医药工业中有
着广阔的应用前景 [1, 2 ]。 对黄酮类化合物的研究也引起了国内外学者的广泛重视。
川桂 (Cinnamomum wilsonii Gamble)为樟科芳香植物 ,常绿乔木 ,生长在山谷或山坡阳处、沟
边 ,疏林或密林中 ,分布于湖北、四川、湖南、广西、广东、江西和陕西等地 [3 ]。川桂的枝和皮常用作中
药材治疗疾病 ,可单独使用或复方配伍 ,具有多种疗效 [4, 5 ] ,川桂叶民间常用作烹饪香料 ,烹制各种
肉类、鱼类等食品 ,具有去腥增香的作用。目前 ,对川桂化学成分研究较多的是其挥发油 [6— 9 ] ,对其
他成分的研究国内外文献少有报道。 本文采用加热回流法提取川桂叶中的黄酮类化合物 ,并用
NaNO2 -Al( NO3 ) 3-NaOH显色法测定了川桂叶中总黄酮的含量 ,以期为川桂的药用研究和资源利
用提供理论依据。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
101-3B型电热恒温鼓风干燥箱 (上海实验仪器有限公司 ) ; FW100型高速万能粉碎机 (天津市
泰斯特仪器有限公司 ) ; AUY220型电子分析天平 [岛津 (香港 )有限公司 ]; UV-1100型紫外可见分
光光度计 (北京瑞利分析仪器公司 ) ; DZF-6050型真空干燥箱 (上海精密实验设备有限公司 ) ; ZF-6
型台式三用紫外分析仪 (上海嘉鹏科技有限公司 )。
芦丁 (生化试剂 ) ;石油醚 (沸程 60— 90℃ ) , 95%乙醇 ,氢氧化钠 ,亚硝酸钠 ,硝酸铝 ,均为分析
纯。
川桂叶样品于 2007年 2月采于湖南省新化县海拔 800m的山坡 ,属野生川桂 ,经中南林业科
技大学刘克旺教授鉴定确认。川桂叶样品经洗净、阴干 ,粉碎至过孔径 0. 6mm筛 ,贮存于棕色试剂
瓶中避光保存。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　标准溶液的制备
精密称取 120℃下减压干燥至恒重的芦丁对照品 0. 0346g ,加入 30%乙醇适量 ,置于水浴上微
热使之溶解 ,冷却后定量转入 100mL容量瓶中 ,用 30%乙醇定容 ,摇匀 ,即得浓度为 0. 346g· L- 1
的芦丁标准溶液。
2. 2. 2　样品溶液的制备
准确称取川桂叶粉 4. 000g ,置于索氏提取器中 ,用石油醚作溶剂 ,水浴回流脱脂至近无色。 待
川桂叶粉中的脱脂溶剂石油醚挥发后 ,用体积分数 70%的乙醇 80mL,在 80℃水浴中加热回流提
取 1. 5h,抽滤 ,用少量 70%的乙醇洗涤滤饼 ,合并滤液和洗涤液 ,定容至 100mL容量瓶中。
2. 2. 3　黄酮类化合物的定性鉴定
( 1)荧光试验:取少量样品溶液滴于滤纸上 ,干燥后在紫外灯下观察荧光。( 2)盐酸-镁粉反应:
取适量样品溶液置于试管中 ,加入少量镁粉 ,再滴加 1— 2滴浓盐酸 ,观察反应现象。 ( 3)铝盐显色
反应:取少量样品溶液滴于滤纸上 ,干燥后 ,喷上 1% AlCl3乙醇溶液 ,观察反应现象 ,并在紫外灯下
观察荧光。 ( 4)碱性试剂显色反应: 取少量样品溶液滴于滤纸上 ,干燥后 ,用 NH3熏或喷上 1%
NaOH溶液 ,观察反应现象 ,并在紫外灯下观察荧光。 ( 5) 紫外吸收光谱:样品溶液用乙醇稀释后 ,
在波长 200— 800nm范围内扫描测定吸收峰。
2. 2. 4　黄酮类化合物的定量测定
按照文献 [10]的方法制作校准曲线。 吸取芦丁标准溶液 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0mL,分别
放入 25mL容量瓶中 ,用 30%乙醇补充至 12. 5mL,加入 5%亚硝酸钠溶液 1mL,摇匀 ,放置 6min后
加入 10%硝酸铝溶液 1mL,摇匀 ,放置 6min后再加入 4%氢氧化钠溶液 10mL,摇匀 ,用 30%乙醇
定容 ,摇匀 ,放置并显色一定时间。以试剂空白为参比 ,用 1cm比色皿于波长 510nm处测定吸光度。
用吸光度 ( A)对浓度 (d)作图 ,绘制校准曲线 ,并用最小二乘法进行线性回归 ,其线性回归方程为:
A= 0. 00627+ 0. 01084d, r= 0. 99989,线性范围为 13. 84— 83. 04mg· L- 1
吸取川桂叶样品溶液 2. 0mL于 25mL容量瓶中 ,按上述制作校准曲线的方法显色 ,以不加硝
酸铝溶液的样品溶液为参比测定吸光度。 川桂叶总黄酮含量按下列公式计算:
k= 25. 00dV
2. 0m
式中:k——总黄酮含量 , mg· g- 1;d——根据线性回归方程计算的溶液浓度 , mg· L- 1 ; V——样品
溶液的总体积 , L; m——称取川桂叶粉的质量 , g; 25. 00 /2. 0为稀释倍数。
531第 3期 李姣娟等:川桂叶中黄酮类化合物的提取与测定
3　结果与讨论
3. 1　黄酮类化合物的定性鉴定
黄酮类化合物的分子中含有酚羟基和 V-吡喃酮环 ,能与许多试剂发生显色反应 ,根据这一性
质 ,对样品溶液分别进行盐酸 -镁粉反应、铝盐显色反应、碱性试剂显色反应 ,并在紫外灯下观察荧
光 ,结果如表 1。将样品溶液用乙醇稀释 ,在 200— 800nm波长范围内扫描测定 ,其紫外吸收光谱曲
线如图 1。
表 1　样品溶液的显色反应
试剂 荧光试验 HCl-Mg 1% AlCl3 1% NaOH NH3
现象 黄绿色荧光 橙色溶液
斑点显黄色 ,并有鲜黄色
荧光 ,且荧光明显加强
斑点显黄色 ,并有黄
色荧光 ,且荧光加强
斑点显黄色 ,并有黄
色荧光 ,且荧光加强
图 1　样品溶液的紫外吸收光谱
　　从表 1的显色反应结果可知 ,样品溶液的显色
反应都呈正反应 ,说明川桂叶中含有黄酮类化合物。
同时样品溶液在 267nm和 307nm处有黄酮类化合
物的特征吸收峰 ,进一步确认川桂叶中含有黄酮类
化合物。
3. 2　最佳测定波长的选择
分别取适量芦丁标准溶液和样品溶液 ,按 2. 2. 4
节的实验方法显色 ,在 400— 600nm波长范围内扫
描测定 ,结果如图 2所示。 芦丁标准溶液在 510nm
有最大吸收峰 ,样品溶液在 495nm有最大吸收峰。
由于样品溶液含有杂质 ,其最大吸收峰与标准溶液的最大吸收峰存在一定的偏差 ,但由于是以芦丁
为标准溶液测定样品的总黄酮含量 ,因此选择 510nm作为测定波长。
图 2　标准溶液和样品溶液显色后的吸收光谱曲线
1—— 标准溶液 ; 2—— 样品溶液。
3. 3　显色溶液的稳定性与显色时间的选择
分别取 3. 0mL芦丁标准溶液和 1. 5mL
样品溶液 ,按 2. 2. 4节的实验方法依次加入
各试剂并显色后 ,每隔 5min测定一次吸光
度 ,结果如表 2所示。 标准溶液的吸光度在
10— 30min内稳定不变 , 35min后略有下降。
样品溶液由于含有杂质 ,其稳定性较标准溶
液稍差 ,吸光度在 10— 25min内基本不变 ,
30min后开始下降。 因此实验选择显色
10min后测定吸光度 ,并且在 25min内测完。
表 2　显色溶液的稳定性
时间 ( min) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
吸光度 A (标液 ) 0. 449 0. 451 0. 451 0. 451 0. 451 0. 451 0. 450 0. 448 0. 445 0. 444 0. 442 0. 441
吸光度 A (样液 ) 0. 541 0. 544 0. 544 0. 543 0. 543 0. 540 0. 533 0. 527 0. 523 0. 514 0. 505 0. 502
3. 4　方法的重现性与精密度
重现性实验可用于评价测定方法的可靠性。分别吸取 2. 0mL样品溶液 5份 ,按 2. 2. 4节的实
验方法测定其吸光度 ,结果如表 3。
532 光谱实验室 第 26卷
表 3　方法的精密度
序号 吸光度 ( A ) 样液浓度 ( mg· L- 1) 平均值 ( mg· L- 1 ) SD RSD(% )
1 0. 711 812. 6
2 0. 703 803. 4
3 0. 709 810. 3 810. 6 5. 1 0. 63
4 0. 715 817. 3
5 0. 708 809. 2
　　从表 3的实验结果可知 , NaNO2-Al( NO3 ) 3-NaOH显色法测定川桂叶中黄酮类化合物的含量 ,
标准偏差和相对标准偏差均较小 ,说明实验的重现性较好 ,精密度较高 ,测定方法的可靠性较高。
3. 5　方法的回收率与准确度
回收率实验可用于评价测定方法的准确度。 分别吸取样品溶液 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0、 2. 5mL,在
每份样品溶液中加入 0. 5mL芦丁标准溶液 ,按 2. 2. 4节的实验方法测定其吸光度 ,并计算回收率 ,
结果如表 4。
表 4　方法的回收率
序号 加样量 ( mg ) 加标量 ( mg) 吸光度 测得量 (mg ) 回收率 (% ) 平均回收率 (% )
1 0. 405 0. 173 0. 254 0. 571 98. 79
2 0. 811 0. 173 0. 428 0. 973 98. 88
3 1. 215 0. 173 0. 611 1. 395 100. 50 99. 51
4 1. 621 0. 173 0. 801 1. 833 102. 20
5 2. 026 0. 173 0. 933 2. 137 97. 18
　　从表 4的实验结果可知 ,在不同体积的样品溶液中加入一定体积的芦丁标准溶液 ,测得回收率
在 97. 18%— 102. 20%之间 ,平均回收率可达 99. 51% ,说明此方法可用于川桂叶中总黄酮含量的
准确测定。
3. 6　提取工艺条件的优化
以总黄酮得率为考察指标 ,在单因素实验的基础上选取乙醇浓度、固液比、提取温度、提取时间
为影响因素进行 L9 ( 34 )正交试验 ,结果如表 5。
表 5　正交试验结果
试验号
因素
A
乙醇浓度 (% )
B
固液比 ( g /mL)
C
提取温度 (℃ )
D
提取时间 ( h)
总黄酮得率
( mg· g- 1)
1 1( 70) 1( 1∶ 15) 1( 75) 1( 1. 0) 16. 25
2 1( 70) 2( 1∶ 20) 2( 80) 2( 1. 5) 20. 32
3 1( 70) 3( 1∶ 25) 3( 85) 3( 2. 0) 18. 10
4 2( 75) 1( 1∶ 15) 2( 80) 3( 2. 0) 16. 45
5 2( 75) 2( 1∶ 20) 3( 85) 1( 1. 0) 15. 85
6 2( 75) 3( 1∶ 25) 1( 75) 2( 1. 5) 13. 20
7 3( 80) 1( 1∶ 15) 3( 85) 2( 1. 5) 11. 61
8 3( 80) 2( 1∶ 20) 1( 75) 3( 2. 0) 9. 39
9 3( 80) 3( 1∶ 25) 2( 80) 1( 1. 0) 12. 50
k1 18. 22 14. 77 12. 95 14. 87
k2 15. 17 15. 19 16. 42 15. 04
k3 11. 17 14. 60 15. 19 14. 65
R 7. 05 0. 59 3. 47 0. 39
　　从表 5的实验结果可知 , 4种影响因素的主次顺序是: A ,C ,B , D ,提取川桂叶总黄酮的最佳工
艺为 A1B2C2D2 ,即用 70%乙醇 ,在固液比 1∶ 20,温度 80℃的条件下回流提取 1. 5h。在该条件下 ,
533第 3期 李姣娟等:川桂叶中黄酮类化合物的提取与测定
从川桂叶中提取黄酮类化合物一次的提取率可达 20. 32mg· g- 1。
3. 7　提取次数的确定与川桂叶总黄酮含量的测定
称取 4. 000g川桂叶粉 ,在正交试验确定的最佳工艺条件下 ,分别提取 1、 2、 3、 4次 ,结果如表 6
所示。
表 6　提取次数对总黄酮得率的影响
提取次数 1 2 3 4
总黄酮得率 ( mg· g- 1 ) 20. 32 22. 53 23. 17 23. 46
　　从表 6的实验结果可以看出 ,随着提取次数的增加 ,累计总黄酮得率增大 ,但增大的幅度逐渐
减小 ,当提取次数超过 2次后 ,增大的幅度很小 ,川桂叶中的黄酮类化合物基本溶出 ,因此连续提取
2次即可将川桂叶中的黄酮类化合物基本提完 ,总黄酮得率为 22. 53mg· g- 1。
4　结论
( 1)采用加热回流法从川桂叶中提取黄酮类化合物 ,利用 NaNO2-Al( NO3 ) 3-NaOH显色法测
定川桂叶中总黄酮的含量 ,该方法的精密度和准确度均较高 ,相对标准偏差为 0. 63% ,回收率为
97. 18%— 102. 20%。
( 2)通过正交试验优化 ,获得回流法提取川桂叶中黄酮类化合物最佳工艺条件是:乙醇浓度
70% ,固液比 1∶ 20(g /mL) ,提取温度 80℃ ,提取时间 1. 5h,连续提取 2次。测得川桂叶中总黄酮的
含量为 22. 53mg· g- 1。
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Extraction and Determination of Flavonoids
fromCinnamomum Wilsonii Gamble Leaves
LI Jiao-Juan　 HUANG Ke-Yinga　 GON G Jian-Lianga　 ZHOU Jin-Hua　 CHEN Cong-Jina
( A pplied Chemistr y Institute of Central South University of Forestr y and Technolog y,Changsha 410004,P . R.Ch ina )
a (Material Science and Engineerin g College of Central South University of Forestr y and Technolog y,Changsha 410004,P . R. China )
Abstract　 Flavonoids were ex t racted f rom Cinnamomum wilsonii Gamble leaves by Heating
refluxing, and determined by spectrophotomert ry. The NaNO3-Al( NO3 ) 2 -NaOH method is practicable
to determine flavonoids content f rom C. wilsonii Gamble leaves with rutin as the standard. This
method is higher precision and accuracy with RSD 0. 63% and recoveries 97. 18%— 102. 20% . The
optimum ex traction conditions were obtained by orthogonal experiments as follow s: ex t racting solvent
70% ( V /V ) ethanol, material ratio 1∶ 20( g /mL) , ex traction temperature 80℃ , ex traction duration
1. 5h and ex t racting for tw o times. The to tal flavonoids content f rom C. wilsonii Gamble leaves is
22. 53mg· g- 1 .
Key words　Cinnamomum Wilsonii Gamble Leaves; Flav onoids; Ex traction; Spect rophotometry
534 光谱实验室 第 26卷