全 文 ：鹅绒委陵菜多糖对荷瘤小鼠细胞因子的影响
成 英，宋九华，刘素君* (乐山师范学院天然产物研究所，四川乐山 614004)
摘要 ［目的］研究鹅绒委陵菜多糖(PAP)对荷瘤小鼠外周血细胞因子白介素-2(TL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。［方法］建
立肉瘤 S180小鼠动物模型，灌胃给予 50、100和 200 mg /kg剂量的 PAP，以抑瘤率为指标，考察鹅绒委陵菜多糖的体内抗肿瘤活性，测定
其抑瘤率;ELISA法测定荷瘤小鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TN-α)的水平。［结果］低、中、高 3 个剂量的 PAP对
S180荷瘤小鼠的抑瘤率分别为 46． 41%、52． 29%和 59． 48%;其中 CY和低剂量的多糖组合抑瘤率与中、高剂量的多糖抑瘤率相当，并明
显高于单用环磷酰胺组的抑瘤率;低、中、高 3个剂量的 PAP能明显提高荷瘤小鼠血清中 IL-2、TNF-α的水平。［结论］鹅绒委陵菜多糖
具有提高荷瘤小鼠细胞免疫的作用。
关键词 鹅绒委陵菜多糖;抗肿瘤;细胞因子
中图分类号 S567;R284 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)09 －05177 －02
Effects of Polysaccharides from Potentilla anserina on the Levels of Cytokines in Tumor Mice
CHENG Ying et al (Natural Products Utilization Research Unit，Leshan Normal College，Leshan，Sichuan 614004)
Abstract ［Objective］To study the effects of polysaccharides from Potentilla anserine(PAP)on the levels of interleukin-2 (IL-2)and tumor
necrosis factor-α (TNF-α)from peripheral blood．［Method］The mice models with tumor S180 were established and treated with 50，100 and
200 mg /kg PAP by gastric perfusion，respectively． The inhibition rate of S180 tumor was measured to investigate the antitumor activity in vivo
of PAP． The levels of IL-2 and TNF-a in mice peripheral blood were determined with ELISA．［Result］ The tumor inhibition rates were
46. 41%，52． 29% and 59． 48% in different groups treated with 50，100 and 200 mg /kg PAP in vivo，respectively． Of these，the inhibition rate
of CY and low-dose PAP was equal to that of medium-and high-dose PAP，significantly higher than that of cyclophosphamide． Three dose
groups of PAP could significantly increase the content of IL-2 and TNF-α spleen index．［Conclusion］The compound PAP could improve the
antitumor activity and immunological function of S180 tumor-bearing mice．
Key words Potentilla anserine;Po1ysaccharides;Antitumor;Cytokines
基金项目 国家科技支撑项目(2007BAC18B04) ;四川省教育厅重点项
目(08ZA095)。
作者简介 成英(1974 － ) ，女，四川仁寿人，副教授，博士，从事植物化
学研究，E-mail:cying215@ hotmail． com。* 通讯作者，副教
授，博士，从事天然产物研究，E-mail:zouliurui@ 126． com。
收稿日期 2011-12-15
鹅绒委陵菜(Potentilla anserina L)属蔷薇科委陵菜属多
年生匍匐草本植物，俗称人参果，又称蕨麻，可食用［1］。其主
产于我国甘肃、四川、青海、西藏、宁夏等十多个省区。鹅绒
委陵菜全身都是宝，为藏民四季常用传统滋补品，使用历史
悠久，在当地常作为保健品和中草药使用。《月王药诊》、《图
鉴》、《藏医药选编》和《中药大辞典》等中记载鹅绒委陵菜性
平、味甘温，具有生津止渴、健脾益胃、益气补血、收敛止血、
止泻、止咳和利痰的功效，主治吐血、下血、崩中、疟疾痈疮、
脾虚腹泻和下痢等症［2］。在蒙药里鹅绒委陵菜味甘，性凉、
轻，用于止泻、抗身倦乏力、清热和强身等。现代药理学研究
显示，鹅绒委陵菜水提物具有提高机体免疫力、抗疲劳、耐缺
氧、止泻抑菌、抗氧化、抗应激、清除自由基和抗损伤等作
用［3 －4］。鹅绒委陵菜多糖是鹅绒委陵菜的主要活性成分之
一，从植物中提取分离多糖成分的技术已有研究报道［5］。
细胞因子是具有免疫调节作用的一类重要蛋白质物质。
许多中药可以通过激活单核巨噬细胞系统，诱生多种细胞因
子(如促进干扰素生成，促进白细胞介素生成，诱生肿瘤坏死
因子等)来增强动物免疫功能。白细胞介素(IL)能活化 B细
胞、巨噬细胞、NK细胞。近年来研究发现许多中药都有促进
细胞因子产生的作用［6］。试验探讨鹅绒委陵菜多糖抗肿瘤
及免疫调节等生物学活性，目的是要探明鹅绒委陵菜多糖对
肿瘤小鼠细胞分泌细胞因子的影响，以期为鹅绒委陵菜多糖
的进一步开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。鹅绒委陵菜，购于四川省阿坝州若尔盖，
由四川大学杨志荣教授鉴定为 Potentilla anserine L．
1． 1． 2 试验动物。昆明种小鼠，雄性，体重(22 ± 2)g，清洁
级，由长征制药厂提供，合格证号:09-4123 。
1． 1． 3 主要仪器。二氧化碳培养箱，购自美国 NBS 公司;
DEAPHOTFx-35DX倒置显微镜，购自尼康仪器有限公司;
UV-2100分光光度计，购自尤尼柯上海仪器有限公司;Bio-
Rad，Model 3550酶标仪，购自济南光机医疗设备有限公司。
1． 1． 4 主要试剂。小鼠肉瘤细胞 S180 及人肝癌细胞
SMMC-7721，由四川中药研究所提供;注射用环磷酰胺(cy-
clophosphamide，CY，购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号:
090221;5-氟尿嘧啶(5-FU) ，购自上海旭东海普，批号:
090311;小鼠 IL-2 2(ELISA)、TNF-α(ELISA)试剂盒，均购自
武汉博士德生物工程有限公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 鹅绒委陵菜多糖(PAP)的制备。取鹅绒委陵菜根，
在温度为 65 ℃下烘干后，粉碎，称取 500． 00 g 粗粉，按料液
比 1∶5(g /ml)加入蒸馏水溶解，浸提温度为 75 ℃，浸提时间 3
～5 h，共提取 4次，合并 4次浸提液。减压抽滤，浓缩至 800
ml。对鹅绒委陵菜多糖提取液进行脱色处理，搅拌均匀加热
煮沸15 min后，以5 000 r /min离心15 min，收集上层清液，弃
沉淀。在上清液中加入 3 倍体积的浓度 95%乙醇，搅拌均
匀，有白色略带黄色絮状沉淀，沉淀为多糖和蛋白质的混合
物，此为粗多糖。放置冰箱过夜，经抽滤，收集沉淀物(滤液
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(9):5177 － 5178，5180 责任编辑 石金友 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.09.119
减压抽滤回收乙醇)。加适量的蒸馏水搅拌使沉淀溶解，以
每 100 ml溶液加 20 mlsevag试剂(氯仿正丁醇 4∶1 液) ，置恒
温振荡器中振荡 60 min后，以 5 000 r /min离心 15 min，去除
下层氯仿及中层变性蛋白，取上部水层再重复去蛋白操作，
至无明显中层为止。收集去蛋白后的上部水层，加入 3倍量
浓度 95%乙醇，搅拌均匀，有白色略带黄色絮状沉淀。放置
冰箱过夜，经抽滤，收集沉淀物(滤液减压抽滤回收乙醇)［7］。
再依次分别用无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤沉淀物后，离心
(5 000 r /min，15 min)，弃上清，将沉淀物(即多糖)于30 ℃下真
空干燥至恒重，即得多糖。采用苯酚 －硫酸法测定多糖含量。
1． 2． 2 鹅绒委陵菜多糖对荷瘤小鼠肉瘤 S180 的影响［8］。
抽取小鼠 S180腹水，用生理盐水稀释至细胞浓度为 2 × 1010
个 /L。取 72只小鼠，于右侧腋下接种 0． 2 ml肿瘤细胞悬液，
制备局灶性实体瘤模型。接种 24 h后，随机分为 6 组，即阴
性对照组、CY 组、PAP 50 mg /kg 组、PAP 100 mg /kg 组、PAP
200 mg /kg 组和 CY + PAP(20 + 50)mg /kg 组。PAP 腹腔注
射，每天 1次，连续给药 8 d;CY 腹腔注射 20 mg /kg，隔日给
药，给药 4次。末次给药 24 h后称重;然后摘眼球取血，收集
血液，放置 4 h后离心，取血清放于 －20 ℃备用;并颈椎脱臼
处死小鼠，剥取瘤块称重。肿瘤抑制率的计算方法:
肿瘤抑制率 =抑瘤率(%)=(模型组平均瘤重 －给药
组平均瘤重)/模型组平均瘤重 ×100。
1． 2． 3 细胞因子(ELISA法)检测［9］。严格按照 ELISA试剂
盒说明书进行操作，测定细胞因子 IL-2、TNF-α水平。
1． 2． 4 PAP 含量测定。称取 20． 0 mg 纯化后的 PAP，溶于
100 ml蒸馏水中，作为多糖储备液。精确吸取 1． 0 ml样品溶
液，加蒸馏水至 2． 0 ml，再加入 1． 0 ml 浓度 5%苯酚溶液，摇
匀，迅速加入浓硫酸 5． 0 ml 摇匀，放置 10 min，置 40 ℃水浴
保温15 min，迅速冷却至室温，在490 nm波长处测定吸光度，
多糖含量计算公式为:多糖含量(%)= C·D·F /W × 100
(W为供试品的重量，mg;C为供试液中葡萄糖的浓度mg /ml;
D为样品的稀释因素)。
1． 2． 5 数据分析。所有结果经 SPSS1 1进行统计学分析。
2 结果与分析
2． 1 PAP 含量测定 计算样品溶液中多糖的含量为
49. 38%。
2． 2 PAP对 S180荷瘤小鼠的作用 由表 1可知，在试验剂
量下，高低剂量的 PAP均能明显抑制肿瘤的生长，与阴性对
照组比较均有极显著性差异(P ＜ 0． 01) ，并随 PAP作用浓度
升高抑瘤效率增加。浓度为 50 mg /kg的 PAP抑瘤效果与浓
度 20 mg /kg的 CY试验组相似，而中剂量和高剂量 PAP抑瘤
效果较之 CY组分别提高了 8． 49%和 15． 68%。PAP低剂量
组和 CY联用，与对照组相比有显著性差异(P ＜ 0． 01) ，并能
明显增强 CY的抗肿瘤作用，与对照组相比提高了 13． 06%。
2． 3 鹅绒委陵菜多糖对荷瘤小鼠血清细胞因子水平的影
响 由表 2可知，与正常组比较，模型组及阳性对照药物的
IL-2和 TNF-α水平明显降低。鹅绒委陵菜多糖 3 个剂量，可
明显升高 IL-2和 TN F-α 水平，其中以 200 mg /kg·d 最佳，
同时鹅绒委陵菜多糖与 CY 联合用药也能明显提高肿瘤小
鼠的 IL-2 和 TN F-α水平，与模型组比较差异有统计学意义
(P ＜0. 01)。
表 1 PAP对 S180荷肿瘤小鼠的抑制作用(珔x ± SD，n =12)
组别
剂量
mg /kg·d
n
试验前 试验后
瘤重
g
抑瘤率
%
模型组 － 12 11 1． 53 ±0． 46 0
PAP 50 12 12 0． 82 ±0． 44* 46． 41*
PAP 100 12 11 0． 73 ±0． 49* 52． 29*
PAP 200 12 12 0． 62 ±0． 41* 59． 48*
CY 20 12 12 0． 86 ±0． 37* 43． 80*
PAP + CY 50 +20 12 12 0． 66 ±0． 38* 56． 86*
注:与模型组比较* P ＜0． 01。
表 2 PAP对肿瘤小鼠血清细胞因子水平影响(X ± S，n =12)
组别
剂量
mg /kg·d
白细胞介素-2
pg /ml
肿瘤坏死因
子 － α∥pg /ml
空白组 42． 38 ±0． 25 70． 32 ±1． 05
模型组 28． 56 ±0． 56 56． 29 ±0． 98
CY 20 18． 78 ±0． 34 40． 72 ±1． 12
PAP 100 115． 27 ±0． 43＊＊ 166． 82 ±1． 17＊＊
50 98． 78 ±0． 36* 135． 66 ±1． 05*
25 86． 64 ±0． 52 115． 28 ±1． 25
PAP + CY 50 +20 100． 46 ±0． 41＊＊ 142． 56 ±1． 21＊＊
注:* 与空白组比较，P ＜0． 05;＊＊与模型组比较，P ＜0． 01。
3 结论与讨论
癌症是一类细胞周期性疾病，其发生和发展与细胞周期
正负调控因子失衡所致的细胞周期运转速率加快和凋亡减
少密切相关。IL-2和 TNF-α都是抗肿瘤免疫细胞因子，其中
IL-2是最重要的细胞因子之一［10］，能直接或间接促使 T 细
胞的增殖，诱导杀伤性 T细胞活化，发挥对肿瘤的直接杀伤
作用。恶性肿瘤患者随着病程的发展和病情的恶化，往往伴
有免疫功能的下降。这种免疫功能的降低在接受放疗、化疗
的患者身上表现得更为明显。TNF-α 是由单核一巨噬细胞
分泌的，对肿瘤有直接杀伤作用;TNF-α 具有双重的生物学
作用。一方面其是机体免疫防护的重要介质，具有抗肿瘤和
抗感染等作用。对机体有利;另一方面可参与机体的免疫病
理损伤，引起机体发热、休克、恶病质或器官出血坏死等，在
免疫性疾病的发病机制中起到十分重要的作用。
研究结果显示，低、中、高 3 个剂量的 PAP对 S180 荷瘤
小鼠的抑瘤率分别为 46． 41%、52． 29%和 59． 48%，其中 CY
和低剂量的多糖组合抑瘤率与中、高剂量的多糖抑瘤率相
当，并明显高于单独 CY组的抑瘤率，表明 PAP能增强 CY的
抗肿瘤作用。同时，鹅绒委陵菜多糖 3个剂量组能够明显提
高荷瘤小鼠血清当中 IL-2 和 TNF-α 水平(P ＜ 0． 01)。其联
合 CY应用能拮抗 CY降低的荷瘤小鼠血清中细胞因子 I L-
2，提高 TNF-α的水平。因此，鹅绒委陵菜多糖具有一定的体
内抗肿瘤免疫调节活性，可拮抗 CY对机体的毒副作用。其
抗肿瘤免疫调节机制可能与有效调节细胞因子水。
参考文献
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析研究［J］．青海大学学报，2003，21(1):7 －8．
(下转第 5180页)
8715 安徽农业科学 2012 年
水浴中显色 10 min，取出冷却至室温后，用浓度 0． 1 mol /ml-
HCl定容至刻度，将检测波长设定为 623 nm，用原提取液作
参比溶液测定其吸光度值，平行测定 5 次取平均值，绘制标
准工作曲线。
1． 2． 3 河湟红花籽粕中 5-羟色胺衍生物提取的工艺流程。
图 2 5-羟色胺衍生物的提取工艺流程
1． 2． 4 5-羟色胺衍生物的含量测定。吸取 30 ml“1． 2． 3”项
下供试品溶液，用浓度 0． 1 mol /ml HCl定容至 50 ml，然后吸
取 2 ml，加入 5 ml显色剂显色后，用浓度 0． 1 mol /ml的 HCL
定容至25 ml，进行比色测定。5-羟色胺衍生物含量的计算公
式为:
5-羟色胺衍生物含量(%)=(比色液浓度 × 1 ml ×稀释
倍数 /投样质量)×100。
1． 2． 5 正交试验设计。根据预试验结果，在相同的投样量
(10． 000 g) ，粒度 30 目的条件下，选取提取温度、提取时间、
提取次数和料液比 4项为考察因素，按表 1的因素水平设计
安排试验。
表 1 正交试验因素水平设计
水平
因素
A提取温
度∥℃
B 提取时
间∥h
C提取
次数
D 料液
比∥g /ml
1 50 0． 5 1 1∶5
2 80 1． 5 2 1∶10
3 100 2． 5 3 1∶20
2 结果与分析
2． 1 线性关系的考察 计算得回归方程为 Y = 0． 006 2X －
0． 008 3，R2 = 0． 999 1，表明在 10． 016 ～ 50． 08 μg /ml 浓度范
围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系。
2． 2 正交试验 由表 2 可知，影响蒸馏水回流提取河湟红
花籽粕中 5-羟色胺衍生物含量因素的主次顺序为 A ＞ B ＞ C
＞ D。以 D项为误差项作方差分析，结果表明，A因素对试验
有明显影响。综合考虑最佳工艺为A2 B2 C3 D3，即提取温度
80 ℃，提取时间 1． 5 h，提取次数 3次，料液比 1∶20(g /ml)。
2． 3 优选工艺的验证试验 按优选工艺条件进行验证试
验(共 3次)。由表 3 可知，利用试验所得的工艺条件对河
黄红花籽进行提取，3 次试验所得出油率平均值为 0． 66%，
优于预试验及正交试验中任何一组试验数据，表明该工艺
稳定可行。
表 2 正交试验结果
试验号 A B C D 含量∥%
1 1 1 1 1 0． 15
2 1 2 2 2 0． 27
3 1 3 3 3 0． 34
4 2 1 2 3 0． 51
5 2 2 3 1 0． 65
6 2 3 1 2 0． 55
7 3 1 3 2 0． 35
8 3 2 1 3 0． 43
9 3 3 2 1 0． 36
k1 0． 25 0． 34 0． 38 0． 39
k2 0． 57 0． 45 0． 38 0． 39
k3 0． 38 0． 42 0． 45 0． 43
R 0． 32 0． 11 0． 07 0． 04
表 3 验证试验
编号 投籽粕量∥g 吸光度值∥A 提取率∥%
1 10 0． 41 0． 65
2 10 0． 39 0． 66
3 10 0． 41 0． 66
平均值 10 0． 40 0． 66
3 结论与讨论
正交试验法用于提取工艺优化，可减少试验次数，节约
成本，是天然产物有效成分提取工艺优化的良好工具。试验
通过正交试验确定该法的最佳提取条件为提取温度 80 ℃，
每次提取时间 1． 5 h，提取次数 3 次，料液比为 1∶20(g /ml)。
通过验证表明该工艺稳定可行，为河湟红花籽的开发生产可
提供依据。
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