全 文 ：93※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 12
高速逆流色谱分离纯化丰城鸡血藤中刺芒柄花素
阮 征 1,2，吴昌强 1,2，印遇龙 1,2 ,3，邓泽元 1,2 ,*
(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西 南昌
330031；3.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙 410125)
摘 要：目的：确定高速逆流色谱分离制备高纯度丰城鸡血藤黄酮类物质刺芒柄花素的条件。方法：利用高效
液相色谱测定刺芒柄花素在两相溶剂体系中的分配系数 K值，通过 K值优化确定高速逆流色谱分离的两相溶剂体
系，并测定刺芒柄花素的纯度。结果：用于高速逆流色谱分离的两相溶剂体系为：正己烷 -乙酸乙酯 - 甲醇 - 水
( 4 : 5 : 4 : 5，V / V )，体系的上相为固定相，下相为流动相。高速逆流色谱分离条件为：流速 2 m L / m i n，转速
800r/min，检测波长 260nm，温度 26℃。从鸡血藤乙醚提取物中可一步纯化得到活性成分刺芒柄花素，得率为
16.1%，高效液相色谱检测其纯度达 96.3%。结论：该溶剂体系分离结果可靠，可作为高效快速分离纯化刺芒柄
花素的制备分离方法。
关键词：丰城鸡血藤；高速逆流色谱；刺芒柄花素；高效液相色谱
Separation of Formononetin from Millettia nitita var. hirsutissima Using High-Speed Counter-current
Chromatography
RUAN Zheng1,2，WU Chang-qiang1,2，YIN Yu-long1,2,3，DENG Ze-yuan1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；
2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；
3. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China)
Abstract ：Purpose: To develop the experimental system for the separation of formononetin from Millettia nitita var. hirsutissima
by high-speed counter-cunent chromatography (HSCCC). Methods: The optimum solvent composition for HSCCC separation
was determined based on partition coefficients and phase separation times for various fractions of the Millettia nitita var.
hirsutissima. The purity of the formononetin fraction from HSCCC separation was measured by HPLC. Results: A mixture of
n-hexane, ethylacetate, methanol and water (4:5:4:5, V/V) was the selected solvent system, the upper phase and the lower phase
separated from which provided mobile phase and stationary phase, respectively. The HSCCC separation of formononetin was
carried out under the following conditions: flow rate 2.0 mL/min, rotation speed 800 r/min and 26 ℃. The yield of formononetin
purified from the ether extract from Millettia nitita var. hirsutissima was 16.1%, with 96.3% purity. Conclusion: The developed
solvent system can provide a reliable separation of formononetin. The HSCCC method is applicable for the rapid and efficient
separation of formononetin.
Key words：Millettia nitita var. hirsutissima；HSCCC；formononetin；HPLC
中图分类号：TQ460.72 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)12-0093-04
收稿日期：2009-10-01
基金项目：南昌大学“赣江学者奖励计划”项目；中国博士后科学基金一等资助项目(20080440166)；
江西省教育厅项目(GJJ09068)
作者简介：阮征(1978—)，男，副教授，博士，研究方向为功能性食品成分与营养调控。E-mail：ezruan@yahoo.com
*通信作者：邓泽元(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品营养学。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn
丰城鸡血藤(Millettia nitita var．hirsutissima)为豆
科类植物，别名过山龙、毛豆结藤、猪婆藤、香花
崖豆藤、弟氏崖豆藤、下巴豆，为江西中药特产。其
根入药，性味微甘、苦、温，能行气活血，用于治
疗月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿疼痛等症。
黄酮类化合物为其主要生物活性物质，且多为异黄酮，
具有较高药用价值[1-2]。天然植物中的黄酮类化合物的分
离和分析方法很多，有梯度 p H 值萃取法、铅盐沉淀
法、柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液
相色谱法、超临界流动萃取等。现代仪器分离法能快
2010, Vol. 31, No. 12 食品科学 ※工艺技术94
速对复杂成分进行精分离，得到高纯度物质。作为先
进的现代仪器分离方法，高速逆流色谱( h i g h - s p e e d
counter-current chromatography，HSCCC)用于分离天然
植物中的活性成分越来越受到重视。
HSCCC是 20世纪 80年代期发展起来的一种液液分
配色谱分离技术。由于不使用固态支持介质，避免了
因不可逆吸附引起的样品损失、失活变性等现象，具
有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离
等优点，高速逆流色谱法已广泛应用于天然产物化学成
分的分离[3-4]。流体动力学中有一种特殊的动力学平衡现
象，即单向流体动力学平衡现象，在这样的动力平衡
体系中，两种互不混溶的溶剂相在转动螺旋管中单向地
分布。HSCCC就是利用这种现象，让色谱仪中的螺旋
管做行星运动，由于重力及螺旋管力的作用，固定相
移向螺旋管的入端，使得固定相得以保留，同时两相
溶剂在螺旋管中得以混合。由于各溶质在两种互不相溶
的溶剂系统中分配系数不同，从而得以分离[ 5- 8]。
目前，采用HSCCC法分离丰城鸡血藤提取物中生
物活性物质的研究还未见报道。本研究旨在选择分离丰
城鸡血藤黄酮类物质最佳的 HSCCC溶剂体系和操作条
件，利用高效液相色谱( h i g h p e r f o rm a nc e l i q u i d
chromatography，HPLC)来测定两相溶剂体系中各组分
的分配系数K值，运用高速逆流色谱技术分离纯化丰城
鸡血藤中刺芒柄花素。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
丰城鸡血藤采自江西省丰城市罗山乡，由南昌大学
生物系植物教研室杨柏云教授鉴定。
用于样品的提取及HSCCC分离的试剂(正己烷、乙
酸乙酯、乙醇、乙醚、甲醇)为分析纯；所有用水均
为二次蒸馏水；用于 HPLC检测的试剂为色谱纯试剂；
刺芒柄花素标准品(纯度≥ 98%，HPLC测定) 陕西慧科
植物开发有限公司。
TBE-300A 高速逆流色谱仪 上海同田生化技术有限
公司；紫外吸收检测器 瑞士安玛西亚生化技术有限公
司；分离管路(聚四氟乙烯制成的内径为 1.6mm、容积
为 330mL的螺旋管)、HX-1050 恒温循环器 北京博医康
实验仪器有限公司；1100高效液相色谱仪、G1313A自
动进样器、G1315A DAD检测器 美国安捷伦公司；
RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SK3300H
超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 鸡血藤样品的预处理
乙醚粗提物的制备：丰城鸡血藤干料用 90%乙醇
(V/V)和 2%盐酸回流提取，过滤，滤液用NaHCO3中和
后再过滤，滤液(pH5.2)减压蒸除乙醇，得粗提物。粗
提取物用乙醚回流提取，分液漏斗分离，滤液减压蒸
出乙醚至干，得乙醚提取物，置于 4℃保存。
供试样品的前处理：正己烷萃取鸡血藤乙醚提取物
48h，再用乙醚对其残留物进行萃取 48h得乙醚二次萃取
液。旋转蒸发仪蒸馏浓缩得乙醚二次萃取样品浸膏，置
于 4℃冰箱中以备高速逆流分离。
1.2.2 分配系数K值的测定及两相溶剂体系的选择
本实验用HPLC法来测定鸡血藤乙醚提取物中各组
分的分配系数K值，来确定用于高速逆流色谱分离的两
相溶剂体系[9]。测定方法如下：配得不同比例的溶剂体
系 10mL并静置过夜。取适量样品于试管中，用预先达
到分配平衡的两相溶剂系统的下相 2mL将其溶解，取
1mL该溶液用 HPLC 进行检测，峰面积为 A 1。然后取
1mL上相加入剩余溶液中，剧烈振荡让其充分混合。待
达到分离平衡后，再取下相用于HPLC检测，峰面积为
A2。分配系数 K则按下式计算：K=(A1－ A2)/A2。选取
待分离组分的 K值为 0.6～1.5，且不同相邻组分 K值之
比大于1.2的两相溶剂体系作为高速逆流色谱分离过程中
的两相溶剂体系。
1.2.3 HSCCC分离过程
用AKTA-prime系统将固定相(两相体系的上相)以
10mL/min的流速泵入高速逆流色谱的螺旋管柱，待有液
体溢出，再以 2mL/min的流速泵入流动相(两相体系的下
相)，同时开启HSCCC，将转速调至 800r/min。达到动
力学平衡后，将 1.2.1节所制供试样品用 5mL溶剂体系
下相溶解，并从AKTA-prime系统进样圈注入HSCCC，
根据出峰情况主动收集各流出组分。
螺旋管总体积－平衡时流出固定相体积
固定相保留值 =—————————————————
螺旋管总体积
1.2.4 各组分的HPLC分析条件
色谱柱：Waters(250mm× 4mm，5μm)；流速：
0.8mL/min； 检测波长：260nm；进样量：10μL；流
动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(V/V)(B)；梯度条件变为：A：
0～10min，20%～25%；10～11min，25%～30%；11～
16min，30%；16～25min，45%；25～32min，60%。
2 结果与分析
2.1 HSCCC溶剂体系的选择
本实验中用于分离的乙醚提取物中组分繁多(图 1)。
不同的溶剂体系对丰城鸡血藤提取物的分离及其分离纯
度有很大的影响。根据分离原则与经验，本实验选择
的两相溶剂系统为：正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水。
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通过配制不同比例的两相溶剂体系：正己烷 -乙酸乙酯 -
甲醇 -水(4:5:4:5、3:5:3:5、2.5:5:2.5:5、2:5:2:5)(V/V)，根
据分配系数K选出最佳的两相溶剂体系。高速逆流色谱
两相溶剂体系的最佳分配系数 K由高效液相色谱测出其
上下相溶解样品的峰面积计算出 K值[10-11]，最佳K值在
0.5～2之间。待分离组分在这些体系里的 K 值见表 1。
溶剂体系(V/V) 4:5:4:5 3:5:3:5 2.5:5:2.5:5 2:5:2:5
K1 1.003 1.504 1.821 1.894
K2 0.613 1.732 1.876 1.931
表 1 不同体系下分配系数K值比较
Table 1 Partition coefficients for two fractions (retention time 31.695
and 31.369 min, respectively, as shown in Fig.1) of the ether extract
from Millettia nitita var. hirsutissima in different solvent systems
各组分保留时间 /min 峰面积 A1 峰面积 A2 A1－A2 K
4.549 631.1 552.9 78.2 0.141
7.197 52.4 38.9 13.5 0.347
7.32 38.8 33.5 5.3 0.158
7.631 1382.5 1053.1 329.4 0.313
14.346 46.5 42.1 4.4 0.105
15.143 763.6 658.4 105.2 0.160
17.309 510.9 465.5 45.4 0.098
20.029 1431.6 1233.2 198.4 0.161
20.754 1405.2 1121 284.2 0.254
22.129 1791.4 1587 204.4 0.129
22.746 1290.1 1059.8 230.3 0.217
26.861 610.1 462.4 147.7 0.319
27.308 1382.3 905.1 477.2 0.527
31.369 6169 3823.4 2345.6 0.613
31.695 6174.8 3083.3 3091.5 1.003
表 2 4:5:4:5体系中各组分K值
Table 2 Partition coefficients for each separated fraction of the
ether extract from Millettia nitita var. hirsutissima in the n-hexane-
ethylacetate-methanol-water (4:5:4:5) system
其中K1为图1中保留时间为31.695min的物质的分配
系数；K2为图 1中保留时间为 31.369min的物质的分配
系数。由于高速逆流色谱主要是利用目标提取物在流动
相和固定相两相中分配系数的不同从而达到被洗脱的原
理来分离制备的，如要达到理想的分离，还需待分离
组分 K 值与其他组分 K 值间有一定差别。实验中测得
4:5:4:5体系下各组分的 K 值，见表 2。
由表 2可知，4:5:4:5体系中待分离组分的K值与其
他组分的 K 值相差较大，能够实现较理想的分离。确
定最佳溶剂体系正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水(4:5:4:5)。
2.2 HSCCC分离优化及组分鉴定
以流动相为溶剂体系下相，固定相为溶剂体系上
相，测得固定相保留率为 54 %。进样后，由于其他组
分 K值小，先出峰，大概在 200min内基本被洗出，而
待分离组分 K 值较大，出峰较晚，从而实现了与其他
组分的分离。通过实验优化的操作参数为：流速：2mL/
m i n；转速：8 0 0 r / m i n；柱温：2 6℃。检测波长：
260nm。高速逆流色谱图见图 2。
2.3 HPLC分析与组分鉴定
通过实验可判定图 2中峰 2物质为刺芒柄花素，用
高效液相检测其纯度为 96.3%。实验中用刺芒柄花素
标准品，在相同高效液相条件下对照保留时间和紫外
检测图谱对照进行定性。图 3 为峰 2 和刺芒柄花素标
准品在相同高效液相条件下的色谱图，由图 3 可知，
峰 2和刺芒柄花素标准品的保留时间相差小于2%(分别
为 31.383min和 31.541min)。图 4分别为峰 2和刺芒柄
花素标准品的紫外检测图谱。图 2 中峰 1 物质极性比
刺芒柄花素强，推测其结构与刺芒柄花素相近，为 2＇-
hydroxyformononetin 或 koparin，化学结构有待进一步
鉴定(图 5 )。
图 2 鸡血藤乙醚提取物的高速逆流色谱图
Fig.2 HSCCC chromatogram of the ether extract from Millettia
nitita var. hirsutissima
400
350
300
250
200
150
100
50
0
1
m
A
U
时间 /min
50 100 150 200 250 300 350
2图 1 乙醚萃取物HPLC图谱
Fig.1 HPLC chromatogram of the ether extract from Millettia
nitita var. hirsutissima
700
600
500
400
300
200
100
0
m
A
U
时间 /min
0 5 10 15 20 25 30
3.
99
1 4.
54
9
6.
39
5 7.
63
1
14
.3
46
15
.1
43
17
.3
09
20
.0
29
20
.7
45
22
.1
29
22
.7
46
26
.8
61
27
.3
08
31
.3
69
31
.6
95
图 3 图 2中高速逆流色谱分离峰2和刺芒柄花素标准品的HPLC图谱
Fig.3 HPLC chromatograms of peak 2 in Fig. 2 and formononetin
standard
400
350
300
250
200
150
100
50
0
m
A
U
时间 /min
0 5 10 15 20 25 30
31
.3
83
31
.5
41
2010, Vol. 31, No. 12 食品科学 ※工艺技术96
结果表明，从鸡血藤乙醚二次萃取样品浸膏 100mg
中可一步纯化得到活性成分刺芒柄花素 16.1mg，得率为
16.1%。
3 结论与讨论
由于高速逆流色谱所具有的较强的适应性，使得它
能分离制备很多种类的天然产物，使得高速逆流色谱具
有较广的适用范围，根据文献报道和经验，目标样品
高效分离前对样品进行初步分离纯化很有必要[9,11-15]。
本实验首先对鸡血藤乙醚提取物的高效液相色谱条
件进行了优化，结果如下：色谱柱：Waters(250mm×
4mm，5μm)；流速：0.8mL/min； 检测波长：260nm；
进样量：10μL；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)；梯
度条件为：A：0～10min，20%～25%；10～11min，
25%～30%；11～16min，30%；16～25min，45%；
25～32min，60%。
本实验以刺芒柄花素在两相溶剂系统中的分配系数
和分相时间为依据设计了一组溶剂体系，通过实验筛选
出正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水(4:5:4:5，V/V)为分离刺芒
柄花素的溶剂系统。 经 HPLC分析刺芒柄花素得率为
16.1%，纯度为 96.3%。本实验结果表明HSCCC能有效
的从提取物中一步分离得到高纯度的刺芒柄素，样品可
以作为对照品用于分析测试或进行相应药物开发。该
HSCCC分离方法与制备型 HPLC相比较，具有廉价简
单，样品制备量大的优点。再次证明了高速逆流色谱
作为一种新型的分离设备的优越性。
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图 5 图2中高速逆流色谱分离峰1的HPLC图
Fig.5 HPLC chromatogram of peak 1 in Fig.2
400
350
300
250
200
150
100
50
0
m
A
U
时间 /min
0 5 10 15 20 25 30
4.
11
9
27
.4
75
4.
55
4
31
.4
33
31
.7
43
1 .高速逆流分离中峰 2；2 .刺芒柄花素标准品。
图 4 高速逆流分离中峰 2和刺芒柄花素标准品的紫外检测图
Fig.4 UV absorption spectra of peak 2 from HSCCC and
formononetin standard
500
400
300
200
100
0
m
A
U
波长 /nm
1
2
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380