全 文 ：白花败酱草对 U14荷瘤鼠肿瘤细胞周期和 PCNA 表达的影响
张　涛 ,田黎明 ,王　昭 ,田丽华
(佳木斯大学医学院 ,黑龙江佳木斯 154007)
关键词:白花败酱草;U14 荷瘤鼠;细胞周期;PCNA
中图分类号:R979.1;R285　献标识码:A　文章编号:1008-0104(2011)03-0084-02
　　白花败酱草是败酱科草本植物的根茎及带根全草 ,具有
清热利湿 、解毒排脓 、活血化瘀 、改善肝功能 、抑菌和抗病毒
等作用[ 1] 。民间验方中与其它中药配伍 , 用于治疗肠癌和膀
胱癌[ 2] 。有报道此药可抑制鼠源性腹水癌[ 3] 。 但有关白花
败酱草皂苷在抗肿瘤方面的作用 , 国内外尚未见报道。本实
验探讨白花败酱草的抗肿瘤作用与机制 , 为寻找有效的抗肿
瘤药物提供部分理论和实验依据。
1　材料与方法
1.1　实验动物及处理
昆明种雌性小鼠(6 周龄 20 ～ 22g), 中国医学科学院实
验动物研究所繁育场提供。动物随机分瘤源鼠组 、皂苷低组
(50mg/ kg· d)、皂苷高组(100mg/ kg · d)、C TX(环磷酰胺
25mg/ kg · d)组及对照组。每组 10 只 , 瘤源鼠组腹腔注射
U14 细胞株 0.2mL/只 ,注射 7d 后在无菌条件下吸取腹腔中
的腹水型瘤细胞 ,稀释成 1.6×106 个/ mL , 无菌条件下给其
余 5 组小鼠每只左前腋下接种 0.2m L 瘤细胞。在接种瘤细
胞 24h 后 ,给各组鼠灌服皂苷 , 对照组灌服同剂量的凉开水;
C TX组按 25mg/ kg · d腹腔注射 CTX;连续 14d , 第 15 天小
鼠摘眼球取血后 ,断髓处死 , 剥离瘤体称重。
1.2　瘤细胞株
U14 鼠宫颈癌细胞株购自中国医学科学院细胞库。
1.3　药物制备及主要试剂
白花败酱草购于中国河北省秦皇岛市民乐医药公司 , 由
安国市昌达中药材饮片有限公司提供 , 此药通过秦皇岛市药
材公司鉴定。白花败酱草粉碎按 1:10 用 70%食用酒精浸泡
4h ,加热回流提取 2 次滤液 , 减压回收乙醇 ,得白花败酱草醇
粗提物[ 4] ,此醇提物上 AB8 大孔吸附树脂层析柱后用蒸馏
水洗脱至洗脱液中无糖为止(M olish 反应阴性)。再分别用
30%、50%和 70%乙醇洗脱 , 收集各浓度的洗脱液 ,至各洗脱
液 Liberman-Burchard 反应阴性为止。混合各洗脱液 , 减压
浓缩真空干燥得白花败酱草总皂苷粗提物。 AB8 大孔吸附
树脂购于天津南开大学化工厂 , 环磷酰胺(C TX):江苏恒瑞
医药股份有限公司产品 , PCNA 免疫组化试剂盒购于福建迈
新生物技术有限公司。
1.4　实验方法
肿瘤组织细胞 PCNA 蛋白的检测:对照组 、皂苷高及
CTX组的瘤体切片采用免疫组织化学 SP 法检测(按试剂盒
说明书操作), 光镜下观察 PCNA 蛋白的表达 , 判断标准:褐
色核表达的是阳性细胞 , 蓝色核表达的是阴性细胞 , 随机计
数 5 个高倍镜(40倍)视野中阳性细胞百分率。细胞周期分
析和细胞凋亡检测:对照组 、皂苷高及 C TX组的瘤体组织剪
碎 ,用 200 目过滤制备单细胞悬液。离心洗涤 3 次后 , 调整
细胞浓度为 1×106个/ mL , 4℃70%的乙醇固定 30min ,用含
RNA 酶的碘化丙啶染色液染色 30min 后上流式细胞仪检测
DNA含量和分析细胞周期 , 并用 Muhicycle 软件处理 , 得出
细胞各周期的百分率和凋亡细胞百分率[ 8] 。
1.5　统计学处理
实验数据以均数±标准差表示 , 应用 SAS 9.13 软件进
行统计学处理 ,组间差异的显著性先进行完全随机设计的方
差分析 ,再采用 dunnet t检验。
2　结果
2.1　白花败酱草总皂苷对 U14 荷瘤鼠肿瘤的抑制率
对照组瘤体平均重量为(2.82 ±0.92)g , 皂苷低 、高和
CTX组 , 瘤体重量分别为(1.83±0.43)g 、(1.21±0.11)g 和
(1.59 ±0.45)g , 给药组瘤体重量明显低于对照 组
(P <0.01), 肿瘤的抑制率分别是 35.11%、57.09%和
43.62%(见表 1)。
表 1　白花败酱草皂苷对 U14 荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用(x±s)
组 剂量(mg/ k g) 动物数开始 结束
体　　重
开始 结束 肿瘤重量(g) 抑制率(%)
对照组 10 9 24.33±1.92 32.67±2.14 2.82±0.92　
CTX 组 25 10 10 24.10±1.62 28.27±2.46 1.59±0.45＊＊ 43.62
皂苷低组 50 10 10 24.73±1.27 30.57±0.83 1.83±0.43＊＊ 35.11
皂苷高组 100 10 10 24.15±0.99 28.12±1.30 1.21±0.11＊＊ 57.09
　　与对照组比较＊＊P < 0.01。
图 1　白花败酱草皂苷对肿瘤细胞 PCNA 表达的影响(SP×100)
A ,对照组;B, CTX 组;C ,皂苷高组
※　褐色核染色是 PCNA 阳性表达细胞　　　　※　蓝色核染色是 PCNA 阴性表达细胞
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　黑龙江医药科学　2011 年 6 月第 34卷第 3期
2.2　白花败酱草皂苷对 U14 荷瘤鼠肿瘤组织细胞 PCNA
蛋白表达的影响
皂苷高 、CTX 与对照组比较 , PCNA 蛋白的阳性细胞率
明显减少 ,分别是(21.8±3.19)%、(26.2±3.68)%和(80.6
±6.02)%;可见各给药组 PCNA 、蛋白的表达明显低于对照
组(P <0.01 , 见表 2 , 图 1)。
表 2　皂苷对 U14荷瘤鼠肿瘤组织细胞PCNA 蛋白表达的影响
分组 用药剂量(m g/ kg· d)
动物数
(只)
PCNA
(%)
对照组 9 80.6±6.02　
CTX组 25 10 26.2±3.68＊＊
皂苷高组 100 10 21.8±3.19＊＊
　　与对照组比较＊＊P < 0.01。
2.3　白花败酱草皂苷对 U14荷瘤鼠肿瘤组织细胞周期和凋
亡的影响
皂苷高组和 CTX 组 ,处于 G0/ G1 期的肿瘤细胞数由对
照组的 38.1%增加为 68.5%和 65.0%, 而处于 S 期和 G2/
M 期细胞的百分数减少;肿瘤细胞凋亡数由对照组的(9.42
±0.16)%增至(28.92±1.24)%和(23.86±0.13)%, 结果
见表 3 , 图 2。
表 3　白花败酱草皂苷对 U14荷瘤鼠肿瘤组织细胞周期和凋亡的影响
组别 n G0/G1(%)S(%)G2/M(%) Apoptosi s(%)
对照 9 38.1 41.0 20.9 9.42±0.16
C TX 10 65.0 21.3 13.7 23.86±0.13
SPVJ 10 68.5 26.2 5.3 28.92±1.24
图 2　白花败酱草皂苷对 U14荷瘤鼠肿瘤组织细胞周期的影响
A ,对照组;B ,环磷酰胺组;C ,皂苷高组
　　
3　讨论
肿瘤发生的主要特征是细胞周期失调后导致的细胞无
限制增殖 ,阻止癌细胞分裂即可达到抑制其恶性生长甚至将
其杀灭的目的 ,实际上多数肿瘤化疗药物均是细胞周期的抑
制剂。 肿瘤细胞增殖的速度主要决定于 G0/ G1 期的长短及
参与分裂的细胞数量的多少[ 5] 。本实验灌服 100mg/ kg · d
皂苷和 25mg/ kg· d 腹腔注射 CTX 后 , U14 荷瘤鼠瘤体组
织细胞处于 G0/G1 期的细胞数由对照组的 38.1%增加为
68.5%和 65.0%, 而处于 S 期和 G2/M 期细胞的百分数减
少 ,可见败酱草皂苷和环磷酰胺可使肿瘤细胞主要受阻于
G0/ G1 期 , G0/ G1 期阻滞使肿瘤细胞周期延长 , S 期细胞减
少使参与分裂的细胞数减少 , 进而使肿瘤细胞的增殖速度
降低 ,达到抑制其生长繁殖的作用。 诱导细胞凋亡可能是不
同机制的抗癌药物发挥作用的共同途径[6] 。本研究表明 ,
U14 荷瘤鼠灌服大剂量白花败酱草皂苷后 ,肿瘤组织细胞凋
亡率由对照组的(9.42 ±0.16)%明显上升为(28.92 ±1.
24)%,环磷酰胺组细胞凋亡率也增致为(23.86±0.13)%,
揭示败酱草皂苷可以诱导肿瘤细胞的凋亡 ,使肿瘤细胞数减
少。诱导肿瘤细胞凋亡是败酱草皂苷抑制肿瘤细胞生长的
又一机制。
PCNA 是细胞核内 DNA 聚合酶δ的辅助蛋白 , 许多研
究发现 PCNA 在 G0 ～ G1 期细胞中无明显表达 , G1 晚期表
达增加 , S 期达到高峰 , G2/M 期明显下降 , PCNA 量的变化
与 DNA 合成一致 ,可作为评价细胞增殖状态的一个指标[ 7] 。
本研究表明 ,对照组肿瘤组织细胞 PCNA 蛋白高表达 , 而皂
苷和 CTX能抑制肿瘤细胞中 PCNA 的表达 , 同时阻止肿瘤
细胞于 G1 期 , 揭示肿瘤细胞 PCNA 表达量与其增殖分化程
度相一致 ,提示白花败酱草皂苷可以抑制 PCNA 的表达 , 推
测可阻止肿瘤细胞 DNA 的合成 , 达到抑制肿瘤细胞增殖的
目的。总之白花败酱草皂苷能抑制体内 U14 宫颈癌细胞的
生长 ,其抗肿瘤作用可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡 , 干扰肿
瘤细胞周期 ,抑制肿瘤细胞中 PCNA 基因的表达而实现其抑
制实体瘤的生长。
参考文献:
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(收稿日期:2011-02-21)
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术项目 ,编号:11531373
作者简介:张涛(1964 ～)女 , 黑龙江佳木斯人 ,博士 , 教授 ,硕士研究生导师。
通讯作者:田黎明(1962 ～)男 , 黑龙江佳木斯人 ,硕士 , 教授 ,硕士研究生导师。
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HEILONGJIANG M EDICINE AND PHARMACY Jun.2011 , Vol.34 No.3