全 文 ：白花败酱草中异牡荆苷和异荭草苷的高速逆流色谱分离和制备
彭金咏 1　范国荣* 1　吴玉田1　陈洪渊2
1(第二军医大学药学院 ,上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室 , 上海 200433)
2(南京大学分析科学研究所 , 南京 210093)
摘　要　应用高速逆流色谱分离制备白花败酱草中的异荭草苷和异牡荆苷 , 以乙酸乙酯∶乙醇∶水(4∶1∶5)为
两相溶剂系统 , 上相为固定相 ,下相为流动相 ,流速 2. 0 m L /m in,主机 800 r /m in, 检测波长 254 nm。 以此分离
条件经一步洗脱 ,从 300 mg白花败酱草粗提物中制备得到异荭草苷 24. 1 mg和异牡荆苷 49. 8 m g,产物纯度经
HPLC检测高达 98. 0%,结构经 UV、 IR、MS、1H NMR和 13C NMR鉴定 ,二者均为首次从败酱属植物中分离得到。
关键词　制备色谱 , 高速逆流色谱 , 异牡荆苷 ,异荭草苷 , 白花败酱草
　 2004-11-02收稿;2005-02-05接受
本文系国家高新技术研究发展计划 863计划基金资助项目(N o. 2003AA2Z3524)
1　引　　言
白花败酱草 (Patrinia Villosa Juss)系败酱科多年生草本植物 ,分布于我国华东 、华中 、华南及西南各
地 ,始载于《神农本草经》,后又被《中国药典》(1977版)收载 ,具有清热利湿 、解毒排脓 、活血化瘀 、清心
安神 、促进肝细胞再生 、改善肝功能 、增强抑菌和抗病毒等作用。
异荭草苷和异牡荆苷 (结构式见图 1)广泛分布于天然产物当中[ 1 ～ 3] 。现代药理研究表明 ,异荭草
苷具有明显的保肝活性[ 4] ,异牡荆苷具有很强的抗氧化活性[ 5] 。因此 ,如何快速 、简便的从天然产物中
分离纯化高纯度异荭草苷和异牡荆苷 ,对进一步研究药效作用机制具有重要意义;同时有助于进行以异
荭草苷和异牡荆苷为指标性成分的药材及相关制剂的质量控制。
采用传统的柱色谱法从天然产物中制备这两种活性成分 ,不仅费时费力 、污染环境 , 而且所用固定相
对样品有不可逆性吸附作用。高速逆流色谱(high-speed counter-cu rrent chromatog raphy, HSCCC)不用任何
固体支撑体或载体 ,克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用 ,因而样品回收率高 [ 8] 。同时 ,还具
有应用范围广 、仪器操作简单 、分离量大等优点 ,因此被广泛应用于天然产物的分离制备[ 7 ～ 9] 。
本实验采用 1300大孔吸附树脂从白花败酱草中制备得到粗提物 ,以此粗提物进行高速逆流色谱分
离纯化 ,经一步洗脱分离得到纯度高于 98. 0%的异牡荆苷和异荭草苷;制备量大 、操作简单。目前 ,还
未见快速 、大量地从白花败酱草中分离一种或多种成分的报道 ,也未见 HSCCC用于败酱属植物化学成
分分离的报道。
图 1　异荭草苷和异牡荆苷结构式
F ig. 1　The chem ical struc tures o f isoo rien tin and isovitex in
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
TBE-300A高速逆流色谱仪 (深圳同田生化技术有限公司 );聚四氟乙烯管缠绕在 3个水平轴上形
成螺旋管(2. 6mm .i d. ,分离体积 300 mL);20mL进样圈。柱塞式泵(S系列 ,北京圣益通技术开发有
第 33卷
2005年 10月　　　　 　　　　　　　
分析化学 (FENXIHUAXUE)　研究报告
Ch inese Journa l o f Ana ly tica l Chem istry
　　　　　　　 　　　　 第 10期
1389 ～ 1392
限公司 );UV-Ⅱ型检测器 (中国科学院上海生物化学所 );HX-1050恒温循环器 (北京博医康实验仪器有
限公司 );N2010色谱工作站 (浙江大学智能信息工程研究所);LC-10AVP高效液相色谱仪 (日本岛津公
司 ),包括 SPD-10A UV-V is检测器 , LC-10AT泵 , 20 μL定量圈;N2000色谱工作站 (浙江大学智能信息
工程研究所 );1300型大孔吸附树脂 (上海医药工业研究院 )。白花败酱草药材购自上海童涵春中药饮
片厂 ,经第二军医大学生药学教研室秦路平博士鉴定 。氯仿 、丙酮 、三氯化铝 、磷酸 、乙酸乙酯 、乙醇 、冰
醋酸均为分析纯 (中国医药集团上海化学试剂公司 );乙腈 、甲醇为色谱纯(德国默克公司 );水为二次蒸
馏水 ,并经微孔滤膜过滤。
2. 2　白花败酱草粗提物的制备
将药材适当粉粹 ,称取粗粉 400 g,加 8倍量 70%乙醇 ,回流提取 2次 ,每次 2. 0 h。过滤 ,合并滤液 ,
减压回收乙醇 ,得浸膏 。取浸膏加适量水混悬后 ,加到装有 650 g预处理过的 1300型大孔吸附树脂的
层析柱上(7. 0×70 cm),静止吸附 1. 0 h后 ,依次用 20%乙醇 、40%乙醇和 95%乙醇洗脱 ,接收 40%乙
醇洗脱物 ,减压浓缩至浸膏后真空干燥(60℃),得浅黄色粉末 ,冰箱保存 ,备用 。
2. 3　高速逆流色谱分离条件
在分液漏斗中配制乙酸乙酯-乙醇-水 (4∶1∶5 , V, V)两相溶剂系统 ,充分振摇后静止 ,分取上下相。
上相为固定相 ,下相为流动相 ,主机转速为 800 r /m in,流动相流速 2. 0 mL /m in ,分离温度 25℃,检测波
长 254 nm ,进样量 300mg,用上下相各 5mL溶解后进样 。
2. 4　高效液相色谱条件
色谱柱:Lichrospher C18(6. 0 mm ×150mm .i d. , 5 μm) (江苏汉邦科技有限公司);流动相:乙
腈 /水 /冰醋酸(20∶80∶1, V /V),流速 1. 0 mL /m in;检测波长 254 nm;柱温为室温 ,进样量 20μL。
3　结果与讨论
3. 1　白花败酱草粗提物的制备及 HPLC分析
400 g白花败酱草药材经 70%乙醇提取浓缩后过大孔吸附树脂柱 ,依次用水和不同浓度乙醇
(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和 95%)梯度洗脱 ,分段接收洗脱液 ,对各洗脱液进行聚
酰胺薄层跟踪监测 ,展开剂为氯仿 /甲醇 /丙酮 /乙酸 (2∶1∶2∶0. 05, V /V), 1%三氯化铝的乙醇溶液为显色
剂 。结果表明:水和 10%、20%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇洗脱物中未见目标成分斑点 ,它们主
　图 2　白花败酱草粗提物色谱图
F ig. 2　H igh pe rform ance liquid chrom a tog ram
(HPLC) o f crude extract from Patrinia Villosa
Juss
1. 异荭草苷 ( isoorientin);2. 异牡荆苷( isovitexin)。
要存在于 30%乙醇和 40%乙醇洗脱物中 。由此确定用
20%乙醇洗脱去掉糖类和无机盐等强极性成分 ,用 40%乙
醇洗脱目标成分 ,用 95%乙醇活化树脂 ,这样可以避免用
正丁醇萃取 ,减少有机溶剂用量 ,对环境友好。按此工艺条
件得到部分纯正的粗提物 ,称重 8. 6 g,提取率 2. 15%。
在粗提物 HPLC分析中考察了不同流动相 (甲醇 /水 、
乙腈 /水 、冰醋酸 、磷酸等调节剂 )、不同流速和不同柱温等
因素对分离的影响。结果发现 ,在室温下以乙腈-水-冰醋
酸 (20∶80∶1)为流动相 ,流速 1. 0mL /m in,检测波长 254 nm
时 ,分离良好 ,色谱图见图 2。由图可知该粗提物含有异荭
草苷(峰 1)和异牡荆苷(峰 2)。
3. 2　高速逆流色谱分离条件选择
在高速逆流色谱中 ,溶剂系统的选择至关重要 ,合适的溶剂系统是其分离的关键 。本研究中根据所
分离化合物的特性 ,考察了乙酸乙酯 /正丁醇 /水(4∶1∶5, 1∶4∶5, 2∶3∶5, 3∶2∶5, V /V),乙酸乙酯 /乙醇 /水
(4∶1∶5, 2∶3∶5, 3∶2∶5, 1∶4∶5, V /V)和氯仿 /甲醇 /水 (4∶3∶2和 5∶8∶10, V /V)10种不同溶剂体系 ,并依据
文献 [ 10]计算分配系数和分离度值 ,以此来优选异荭草苷和异牡荆苷最佳分离溶剂体系 。实验结果表
明:乙酸乙酯 /乙醇 /水体系 (4∶1∶5, V /V)对异荭草苷和异牡荆苷有较合适的分配系数和分离度值 ,因此
被用来分离目标成分 。
1390　　 分 析 化 学 第 33卷
在逆流色谱中 ,影响分离好坏的因素还有分离温度 、主机转速和流动相流速等。其中分离温度能影
响固定相保留率和组分的分配系数。在考察不同温度 (15、20、25、30和 35℃)后 ,分离温度选择 25℃;
流动相流速主要影响分离时间长短 ,本实验中流动相流速设定为 2. 0 mL /m in;主机转速也能影响固定
相保留率 ,转速高则固定相保留率高 ,但分离管易损坏 ,因此主机转速设定为 800 r /m in。在此分离条件
下固定相保留率为 55%,分离时间小于 8 h, HSCCC色谱图见图 3,根据色谱图接收两个流分 ,即 “ Ⅰ ”和
“Ⅱ”。
3. 3　产物纯度及结构
对所得流分 “Ⅰ ”和 “Ⅱ ”进行 TLC分析以 M e2CO-E tOAC-H 2O-AcOH(25∶35∶5∶1 , V /V)为展开剂 ,二
　图 3　粗提物的高速逆流色谱图
F ig. 3　Chrom a tog ram of the crude extrac t by h igh speed
counter current ch rom a tog rpahy (HSCCC)
者均为单一斑点 ,R f值分别为 0. 55和 0. 68。在上述
HPLC色谱条件下分析 , Ⅰ和 Ⅱ均为单一色谱峰 ,
HPLC色谱图见图 4。其中流分Ⅰ峰纯度为 98. 6%;
流分Ⅱ峰纯度为 99. 4%(峰面积归一化法 )。取制备
所得流分进行熔点 、UV、 IR、MS、1H NMR和 13C NMR
分析 ,结果如下。
异荭草苷 (流分 Ⅰ ):浅黄色粉末 , mp 237 ～
239℃, [ α] D =+30°(C 0. 50, E tOH), IR:(KBr)
3390 ( C OH ), 1650 ( C O ), 1619、 1578、
1478 (苯环 ) cm - 1。 UVλmax (nm M eOH):348、270。
TOF-MS:447[M - 1] - , 895[ 2M - 1] - , 471[M +Na] + , 919[ 2 M +N a] + , 449[M +1] + , 487[M +
K ] +。1H NMR (500MH z, DMSO-d6) δ:13. 25 (1H , brs, 5-OH ,加重水后消失 ), 7. 48 (1H , dd, J =
2.5H z, 9. 0H z, 6-H), 7. 26 (1H , d, J =2. 5Hz, 2′-H), 6. 94 (1H , d, J =9. 0 Hz, 5-H), 6. 64 (1H ,
s, 3-H), 4. 58 (1H , d, J =10. 0 H z, 1-H )。13C NMR (125MH z, DMSO-d6) δ:163. 44 (C-2), 102. 38
(C-3), 181. 45 (C-4), 160. 59 (C-5), 108. 88 (C-6), 163. 44 (C-7), 93. 73 (C-8), 156. 27 (C-9),
102.79 (C-10), 121. 56 (C-1), 112. 92 (C-2), 145. 95 (C-3), 150. 04 (C-4), 116. 00 (C-5), 118. 82
(C-6), 73. 18 (C-1), 70. 50 (C-2), 78. 95 (C-3), 70. 19 (C-4), 81. 35 (C-5), 61. 34 (C-6)。该数据
与文献对照 [ 11]结果一致 ,故确定Ⅰ为异荭草苷 。
图 4　高速逆流制备流分 H PLC色谱图
F ig. 4　H igh perform ance liquid chrom a tog ram o f frac tions ob ta ined byH SCCC
A. 流分Ⅰ(A for fractionⅠ);B. 流分Ⅱ(B for fractionⅡ)。 1. 异荭草苷( isoorien tin );2. 异牡荆苷( isovitexin)。
　　异牡荆苷(流分Ⅱ ):浅黄色粉末 , mp 223 ～ 224℃, [ α] D =+17. 2°(C 0. 37, E tOH), IR (KB r):
3300 ( C OH ), 1658 ( C O ), 1610, 1510, 1448 (苯环 ) cm - 1。 UVmax (nm M eOH):329, 270。
TOF-MS:455[M +N a] +, 433[ M +1] +, 471[M +K ] + , 887[ 2M +N a] + , 903[ 2M +K ] +。1H NMR
(500MH z, DMSO-d6)δ:13. 46 (1H , brs, 5-OH ,加重水后消失), 7. 85 (2H , d , J =8. 5Hz, 3, 5-H),
6. 94 (2H , d, J =8. 4H z, 2, 6-H), 6. 71 (1H , s, 3-H), 6. 42 (1H , s, 8-H), 4. 56 (1H , d, J =9.8H z,
1-H)。13C NMR (125MHz, DMSO-d6)δ:163. 32 (C-2), 102. 60 (C-3), 181. 73 (C-4), 160. 64 (C-5),
108. 95 (C-6), 163. 32 (C-7), 93. 79 (C-8), 156. 31 (C-9), 102. 95 (C-10), 121. 00 (C-1), 128. 35
(C-2, 6), 116. 01 (C-3, 5), 161. 32 (C-4), 73. 13 (C-1), 70. 52 (C-2), 78. 93 (C-3), 70. 20 (C-4),
1391第 10期 彭金咏等:白花败酱草中异牡荆苷和异荭草苷的高速逆流色谱分离和制备 　　
81. 38 (C-5), 61. 37 (C-6)。以上数据与文献对照 [ 12] ,结果一致 ,故确定 Ⅱ为异牡荆苷 。
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Isalation and Separation Isoorientin and Isovitexin from Patrinia
Villosa Juss byH igh Speed Coun ter-currentChromatography
Peng Jinyong1 , Fan Guo rong﹡1 , Wu Yutian1 , Chen H ongyuan2
1(Shanghai Key Labora tory forD rug Metabolism , College of Pharm acy,
theS econd M ilitary Medica lUniversity, Shanghai 200433)
2(Institute of Analysis S cience, Nan jing University, Nanjing 210000)
Abstract　A sem i-prepara tive high speed coun te r-cu rrent chrom atog raphy w ith a two-phase so lven t system
composed o f ethy l ace tate-e thanol-wa ter (4∶1∶5, V /V) was used to isola te and separate isoorientin and isov i-
tex in from Patrinia Villosa Juss. The mobi le phase w as the lowe r phase, and ope rated at a flow rate of 2. 0
mL /m in, while the appa ra tus rota ted at 800 r /m in and the e ff luent w as de tec ted at 254 nm. The separation
produced 49. 8mg isov itex in and 24. 1mg isoorientin w ith pu rities o f over 98. 0% de term ined by high perform-
ance liquid chromatog rpahy in one step elution from 300mg crude ex tract, and iden tification w as performed by
ultrav io le t, infrared, mass spectrome try, 1H nuc learmagne tic resonance (NMR) and 13C NMR. It is the first
report o f d iscovering isoorientin and isov itex in from the plan t of Patrin ia genius.
Keywords　Preparative chromatog raphy, h igh speed counter-current chrom atog raphy, isoorientin, isov itexin,
Patrin ia Villosa Juss
(Received 2 Novem ber 2004;accep ted 5 Feb ruary 2005)
1392　　 分 析 化 学 第 33卷