全 文 ：※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.03 93
灰叶马尾藻多糖的提取及其生物活性
刘 芳1，郑育声1，尹学琼1,*，沈 琦2，杨冬云2
(1.海南大学 海南省精细化工工程研究中心，海南 海口 570228；
2.海南惠普森医药生物技术有限公司，海南 海口 570216)
摘 要：采用NaOH水溶液对灰叶马尾藻(Sargassum cinereum)进行超声浸提，通过Sevag法脱蛋白、柱层析，分离得2
种浅黄色海绵状水溶性马尾藻多糖SP1、SP2。在质量浓度2g/100mL NaOH水溶液中80℃超声1h，再在80℃恒温水浴
4h，得最高多糖产率为13.4%。SP1、SP2苯酚-硫酸显色反应呈阳性，紫外扫描、电泳检测表明多糖纯度较好；凝胶
渗透色谱测得SP1、SP2分子质量分别约为36、77kD，红外光谱显示SP1、SP2有硫酸基、羧基和α-D-半乳吡喃糖的特
征吸收峰。以电子自旋共振技术研究SP1、SP2抗氧化活性，10mg/mL的SP1、SP2对羟自由基(•OH)的清除能力分别
为87.2%、61.5%；SP1、SP2均具有较强的抑制人前髓白细胞(HL60)生长的作用，而SP2抗癌活性更高。
关键词：灰叶马尾藻；多糖；抗癌活性；抗氧化活性
Extraction and Bioactivity of Polysaccharides from Sargassum cinereum
LIU Fang 1，ZHENG Yu-sheng 1，YIN Xue-qiong1,*，SHEN Qi2，YANG Dong-yun2
(1. Hainan Provincial Fine Chemical Engineering Research Center, Hainan University, Haikou 570228, China；
2. Hainan Helpson Medicine and Biotechnique Co. Ltd., Haikou 570216, China)
Abstract：Two yellow sponge polysaccharides (SP1 and SP2) were extracted from Sargassum cinereum after ultrasonic
treatment in NaOH solution, protein removal through Sevag method, column separation, dialysis and lyophilization. Maximum
yield of polysaccharide was up to 13.4% when the algae was subjected to ultrasonic extraction in 2% NaOH at 80 ℃ for 1 h
and continuous treatment for 4 h in water bath. SP1 and SP2 revealed the positive phenol-sulfuric colorimetric reaction. UV and
electrophoresis showed that SP1 and SP2 had high purity. According to GPC, the molecular weights of SP1 and SP2 were approximately
36 kD and 77 kD, respectively. Both SP1 and SP2 had characteristic FTIR absorption spectra of sulfate, carboxyl group and α-D-
galactopyranosides. In addition, SP1 and SP2 showed good antioxidant activity. The hydroxyl radical scavenging capacity of SP1
and SP2 in aqueous solution (10 mg/mL) was 87.2% and 61.5%, respectively. Moreover, SP1 and SP2 also showed good ability to
inhibit the proliferation of HL-60 cells. The anti-cancer activity of SP2 was higher than that of SP1.
Key words：Sargassum cinereum；polysaccharide；anti-cancer activity；antioxidant activity
中图分类号：Q539.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)03-0093-04
收稿日期：2011-11-19
基金项目：海口市重点科技计划项目(2010-084；2011-0079)；海南大学“211工程”创新人才计划项目
作者简介：刘芳(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为多糖提取及应用。E-mail：315946331@qq.com
*通信作者：尹学琼(1975—)，女，教授，博士，研究方向为生物资源开发与利用。E-mail：yinxq7584@yahoo.com.cn
多糖是由同种单糖或不同种单糖通过糖苷键结合而成
的天然大分子碳水化合物，普遍存在于高等植物、细菌、
真菌、藻类和动物体内，自然资源丰富。天然多糖不仅对
正常细胞无毒副作用，而且具有提高免疫、抗病毒、抗辐
射、抗癌、降血糖、减肥和抗氧化等作用[1-5]。海洋中的海
藻、虾蟹壳、微生物等蕴含着极其丰富的甲壳素、硫酸多
糖、肝素等活性多糖，是开发海洋生物多糖保健食品和多
糖药物、寻找新型多糖药物先导化合物的宝贵资源[6-8]。
灰叶马尾藻(Sargassum cinereum)，隶属褐藻门、墨
角藻目、马尾藻科、马尾藻属，主要分布于我国东海、
南海沿岸[9]，由于其可食性差，目前开发利用度较低，对
其有效成分研究较少。本研究采用NaOH水溶液对海南产
灰叶马尾藻进行多糖提取纯化、结构分析及生物活性测
定，以期为开发海南特色海藻资源提供一定的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
灰叶马尾藻采自海南省南燕湾，经海南大学农学院
刘美华副教授鉴定，确定为灰叶马尾藻。海藻经洗净晒
干后，剪成0.5cm碎片装入塑料袋备用。抗癌活性测定中
所用细胞为人前髓性白血病细胞(HL60)。
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C C K 8细胞计数试剂盒 日本D o j i n d o公司；
NaOH、无水乙醇、NaCl、硫酸、盐酸、氯仿、正丁醇
中国医药上海化学试剂公司；DEAE-32纤维素 北京
索莱宝科技有限公司；葡聚糖凝胶SephadexG-75 美国
Pharmacia公司；琼脂糖、溴酚蓝、硫酸亚铁、5,5-二甲
基-吡咯啉-N-氧化物(DMPO) 阿拉丁试剂(中国)有限公
司；所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
FD-1E冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公
司；T6新锐可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责
任公司；KQ3200B超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限
公司；Paragon 1000傅里叶红外光谱仪 美国PE公司；
1515GPC凝胶渗透色谱 美国Waters公司；A320电子自
旋共振仪 德国Bruker公司。
1.3 方法
1.3.1 多糖提取与纯化
称取2g灰叶马尾藻碎片，加入80mL NaOH水溶液
(质量浓度分别为1、2、3g/100mL)，80℃超声1h，再在
80℃恒温水浴4h，抽滤，取上清液浓缩。用2% HCl调pH
值至4，4℃静置过夜。离心，沉淀用20mL超纯水溶解，
转入分液漏斗中，加入20.0mL Sevag去蛋白质试剂(氯
仿、正丁醇体积比为4:1的混合液)，剧烈振摇15min，静
置30min，弃去有机溶剂层和蛋白质层，再加入20.0mL
Sevag试剂。重复以上操作，直至其水溶液用紫外光谱仪
检测不到蛋白质为止。在去蛋白后的溶液中加入50mL无
水乙醇，4℃静置过夜。离心，沉淀用无水乙醇、丙酮洗
涤，真空干燥得产品[10]。
取0.3g灰叶马尾藻多糖样品溶于20mL水中，注入
DEAE-32纤维素离子交换柱(2.6cm×60cm)，分别用0.2、
0.4、0.6、0.8、1.0mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱体积流量
为2mL/min，每管收集4mL，以苯酚-硫酸法检测多糖含
量，收集、浓缩、透析，冷冻干燥，得纯多糖[11]。
1.3.2 结构分析
将各待测样品及0.1%溴酚蓝指示剂于琼脂糖电泳(厚
度约为3mm，7cm×9cm)负极端点样，点样量为5μL，
置于电泳槽中；加入电极缓冲液，于电压10V/cm进行电
泳。观察指示剂移动情况，待指示剂行至距凝胶前沿约
1.5～2cm处，停止电泳。剥取凝胶，置甲苯胺蓝染色液
染色10min，用水脱色[12]。
将多糖溶解在水中，以凝胶渗透色谱测试分子质量
分布情况，测试条件如下：检测器：示差检测器；流动
相：0.05%叠氮化钠水溶液；流速：0.6mL/min；柱温：
55℃；检测器温度：50℃；柱子填料：葡聚糖；柱子型
号：UtrahydrogelTM500、UtrahydrogelTM120双柱串联。以
葡聚糖系列多糖标定色谱柱[13]。
分别取各浓度淋洗得到的精多糖样品少量，KBr压
片，在4000～400cm-1波数处，用Paragon 1000傅里叶红外
光谱仪进行扫描。
1.3.3 抗羟自由基(·OH)活性测试
将50μL 1%多糖样品或者作为对照的等体积的双
蒸水，50μL 0.05mol/L的PBS溶液(pH7.4)加入到50μL
0.3mol/L DMPO溶液和10mmol/L FeSO4溶液，再加入
50μL 10mmol/L H2O2溶液启动反应，将反应体系吸入密
封的毛细管中。2.5min后用ESR光谱仪记录ESR图谱。测
试条件为：中心磁场(CF)：3512.3G；扫描宽度(SW)：
200G；扫描时间(ST)：15.36s；调制幅度(MA)：3.0G；
调制频率：100kHz；微波频率：9.863GHz；微波功率：
20.0mW；测试温度：室温[14]。
多糖溶液对·OH的清除作用以清除率表示，计算公
式为：
H0 ˉHx⏙䰸⥛/% = h100H0
式中：H0和HX分别为样品不添加和添加多糖时ESR
图谱第2峰信号强度(高度)。
1.3.4 抗癌活性测定[15]
药物溶解：用灭菌PBS溶解SP1和SP2，总质量浓度
为50μg/μL，稀释至10μg/μL，备用。
细胞接板：设置0、24、48、72h 4个检测时间。
在96孔板中每孔接种10×104个HL60细胞，之后，在每
孔中分别加入9μL以上2种药物，使其终质量浓度达到
900μg/μL，放置培养箱中培养至各设定检测时间。
细胞生长情况检测：96孔板测定孔中加入10μL
CCK-8，分别于450nm和600nm(参比波长)处测定光密度
(OD)值，样品OD值为OD450nm－OD600nm。
2 结果与分析
2.1 灰叶马尾藻多糖的产率
采用NaOH水溶液提取灰叶马尾藻多糖，通过Sevag
法脱蛋白、DEAE-纤维素柱层析进行多糖纯化。以0.2、
0.4、0.6、0.8mol/L NaCl淋洗DEAE-纤维素柱，0.2mol/L
NaCl溶液洗脱得样品SP1，产量为总上样量的46.2%；
0.4mol/L NaCl溶液洗脱得样品SP2，产量为总上样量的
41.1%；其他浓度的NaCl溶液洗脱得到的样品量太少，无
法收集分析。
当提取温度80℃、提取时间4h、NaOH的质量浓度为
1、2、3g/100mL时，脱蛋白未过柱的粗多糖的产率分别
为9.6%、13.4%、11.0%。
2.2 灰叶马尾藻多糖的理化性质
经冷冻干燥后的SP1、SP2均呈浅黄色海绵状，易
溶于热水，不溶于无水乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。
SP1、SP2的水溶液均为透明的黏稠状浅黄色液体，苯酚-
※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.03 95
硫酸显色反应阳性。对SP1、SP2水溶液进行紫外光谱扫
描，没有发现在260、280nm波长处的核酸和蛋白质特征
吸收峰，说明提取的多糖基本不含多肽和蛋白质[11]。
2.3 琼脂糖电泳结果
Ϟ
ḋ
໘
1
2
3
ˉ +
加
样
缓
冲
液
1. 0.1%的溴酚蓝溶液；2. 1%的SP1溶液；3. 1%的SP2溶液。
图 1 灰叶马尾藻粗多糖的琼脂糖电泳图
Fig.1 Agarose electrophoresis of SP1 and SP2
采用琼脂糖电泳法对所得的多糖纯度及荷电性进行
检验，如图1所示。SP1、SP2都带负电荷，图中SP1、
SP2均为单一均匀连续带，表明SP1、SP2所带电荷数相
近，且SP1谱带比SP2宽，即SP1分子质量分布较宽。
2.4 凝胶渗透色谱(GPC)结果
SP2(21.064)
SP1(22.364)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
ᯊ䯈/min
图 2 多糖分子质量分布GPC图
Fig.2 GPC curves of SP1 and SP2
多糖分子质量及化学结构对其性能具有重要影响
作用[16-17]，本实验采用GPC对SP1、SP2分子质量进行测
量。由图2可知，SP1、SP2均为较单一峰，但是SP1分子
质量分布很宽，而SP2分子质量分布较窄。由表1可知，
SP1数均分子质量约36kD，分子质量分散系数为1.79；
SP2数均分子质量约为77kD，分子质量分散系数为1.29。
GPC分析结果与电泳结果一致。
表 1 灰叶马尾藻多糖分子质量分布情况
Table 1 Molecular weight distribution of SP1 and SP2
样品 保留时间/min Mn/kD Mw/kD Mp/kD Mz/kD PI
SP1 22.4 35.960 64.202 36.037 117.379 1.79
SP2 21.1 77.112 99.843 87.745 128.346 1.29
注：Mn. 数均分子质量；Mw. 重均分子质量；Mp. 峰位分子质量；Mz.
Z均分子质量；PI. 分散系数。
2.5 红外光谱分析结果
为了证实SP1、SP2中有羧基存在，对由NaOH溶液
提取所得SP1、SP2(称为碱式糖)进行酸化处理，将SP1
与SP2溶解后，加稀盐酸调节pH值到4，再用分子质量
3500D的透析袋透析，冷冻干燥得SP1a与SP2a (称为酸式
糖)。由图3～4可知，SP1、SP2具有相似的红外谱图，在
3400～3450cm-1间处出现一宽峰，为O—H的伸缩振动，
表明多糖存在分子间和分子内氢键；2920～2935cm-1处
的吸收峰较弱，为C—H伸缩振动[18]；1250.7cm-1处出现
硫酸基(—O-SO－2 )中S—O的伸缩振动峰，表明样品为
硫酸多糖。在SP1a、SP2a的图谱上，1615cm-1为—C=O
(—COONa)对称伸缩振动峰，酸化后该峰明显减弱，
在1737.0cm-1处出现新的吸收峰，表明—COONa转化成
了—COOH。1035～1045cm-1处为吡喃环结构的C—O吸收峰，
该吸收峰的存在说明样品主要为吡喃多糖，805～820cm-1
是α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰[18]。
34
44
.3
29
26
.2
17
38
.1 16
15
.7
14
12
.6
10
41
.9
80
9.
9
4000 3000 2000 1500 1000 450
34
21
.5
29
24
.9
16
13
.5
14
15
.1 1
03
6.
4 81
8.
7
61
9.
5
a
b
⊶᭄/cm-1
a. 酸式糖；b.碱式糖。下同。
图 3 SP1的红外光谱图
Fig.3 FTIR spectra of SP1
4000 3000 2000 1500 1000 450
⊶᭄/cm-1
34
05
.2
16
17
.3
14
14
.3
10
40
.4
34
37
.8
17
37
.0 10
44
.4
29
31
.5
12
50
.7
14
13
.2
16
31
.3
80
6.
7
a
b
图 4 SP2的红外光谱图
Fig.4 FTIR spectra of SP2
2.6 抗氧化活性
㄀2ዄ
ぎⱑ
10mg/mL SP1
10mg/mL SP2
㄀2ዄ
ぎⱑ
1mg/mL SP1
1mg/mL SP2
图 5 灰叶马尾藻多糖清除•OH活性
Fig.5 Hydroxyl radical-scavenging capacity of SP1 and SP2
96 2013, Vol.34, No.03 食品科学 ※基础研究
由图5可知，10mg/mL的SP1和SP2都有非常明显
的清除•OH活性，其中SP1清除率为87.2%，SP2清除率
为61.5%(具体计算数据未显示)；降低多糖质量浓度至
1mg/mL，SP1和SP2对•OH清除活性变化，SP1清除率
为18.8%，SP2清除率为67.1%(具体计算数据未显示)。
通过对比可以看出，SP1由10mg/mL稀释到1mg/mL后，
对•OH的清除作用明显减弱，而SP2由10mg/mL稀释到
1mg/mL后，对•OH的清除活性反略有升高。SO42－和糖醛
酸的含量对•OH的清除作用影响明显，低硫高糖醛酸组
分对•OH的清除活性更好一些[19]。有些多糖对•OH的清除
能力，是在一定范围内随着质量浓度的升高而增强，但
超过某一质量浓度后，对•OH的清除能力随质量浓度的
升高反而降低[20]。
2.7 抗癌活性测定结果
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
O
D
0 24 48 72
ぎⱑᇍ✻
SP1
SP2
ᯊ䯈/h
图 6 SPI和SP2对HL60细胞生长的影响
Fig.6 Effects of SP1 and SP2 on the growth of HL60 cells
由图6可知，从接种到72h培养过程中，空白组OD
值不断升高，说明HL60细胞正常生长，累计数量逐渐增
多。而添加SP1和SP2的2个实验组，其OD值增加不大，
表明SP1和SP2均具有较强的抑制HL60细胞生长的作用，
SP2抑制活性更高。SP1和SP2发挥抑制白血病细胞作用的
时间约在接触细胞24h后，在48h时抑制作用最为明显。
3 结 论
采用NaOH水溶液对灰叶马尾藻进行超声浸提，柱层
析得到2种纯度较高的水溶性灰叶马尾藻多糖SP1、SP2，
对所得多糖进行初步结构分析，并测定SP1、SP2的抗氧
化和抗癌活性。体外抗氧化测定表明，SP1和SP2均具有
良好抗氧化活性，且随质量浓度降低，SP1对•OH的清除
率下降，SP2的清除率反而升高，该反应的机理有待进一
步研究。体外抗癌测试结果揭示SP1和SP2均具有较强的
抑制白血病细胞生长活性，其作用机制也有待深入探讨。
灰叶马尾藻多糖含量高、提取工艺简单、生物活性高，在
开发海洋多糖类药物方面具有良好应用前景和开发价值。
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