全 文 ：书收稿日期:2012-07-07; 修订日期:2012-12-11
基金项目:江苏省海洋生物技术重点实验室开放课题( No． 2008HS012)
作者简介:李盈蕾( 1973-) ，女( 汉族) ，吉林长春人，现任淮海工学院讲师，
硕士学位，主要从事天然产物活性物质提取与活性研究工作．
青风藤中青藤碱微波提取工艺的
星点设计 －效应面法优化
李盈蕾1，陈建华2，王 寅1
(1．淮海工学院化学工程学院，江苏 连云港 222005;
2．江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005)
摘要:目的 星点设计 －效应面法优化青风藤中青藤碱的微波提取工艺。方法 以提取时间、乙醇体积分数、微波功率为
自变量，青藤碱得率为因变量，通过对自变量各水平的二项式拟合，用效应面法选取较佳工艺，并进行预测分析。结果
确定最优提取工艺为 20 倍量 75%乙醇 450 W 微波提取 2 次，每次 8． 30 min。在此最佳工艺条件下青藤碱得率为
0． 803%，理论值为0． 824%，与理论值相对误差小于 5%。结论 星点设计 －效应面法优选的青藤碱提取工艺方法简便，
所建立的数学模型预测性良好。
关键词:青藤碱; 提取工艺; 星点设计 －效应面法
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 03． 063
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2013) 03-0659-02
青风藤主要来源于防己科植物青藤(Sinoenium acutum
〔Thunb．〕Ｒehd． et Wils．)的藤茎。分布于长江流域及以南各地，
是一味常用中药。临床常用于治疗风湿性关节炎，肢体疼痛、麻
木等症［1］。研究表明，青风藤的主要有效成分即为青藤碱［2］。
近年来，诸多学者报道青藤碱的新活性，诸如消肿、利尿、降压、抗
心律失常、组织胺释放、免疫调节等［3］，可见，青藤碱是一个具有
良好开发前景的中药单体。因此，更为有效地提取青藤碱就成为
了一个重要的课题。星点设计具有精密度高、预测值接近真实值
等优点［4］，本实验采用星点设计法，结合效应面法优选青风藤中
青藤碱的提取工艺，旨在优化提取工艺的同时，为探讨星点设计
－效应面法应用于中药提取工艺的可行性提供依据。
1 材料与仪器
1． 1 材料与试剂 青风藤购自连云港康缘大药房，粉碎过 60 目
筛;青藤碱标准品(批号:0774 － 200206)中国药品生物研究所;甲
醇、乙腈、三乙胺均为色谱纯(上海晶纯试剂公司) ，其他试剂为
分析纯。水为哇哈哈纯净水。
1． 2 仪器与设备 XH － 100B 电脑微波催化合成 /萃取仪(北京
祥鹄科技发展有限公司) ，LC2010AHT 高效液相色谱仪(日本岛
津) ，JB /T 5374 － 1991 电子天平(梅特勒 － 托利多仪器有限公
司)。
2 方法
2． 1 青藤碱含量测定方法的建立
2． 1． 1 色谱条件 色谱柱为岛津 VP － ODS 色谱柱(4． 6 mm ×
150 mm，5 μm) ，柱温为 40 ℃;流动相为乙腈:pH9 缓冲盐(30∶
60) ，其中缓冲盐为质量浓度 0． 05% 磷酸二氢钾 ∶ 质量浓度
0． 05%磷酸氢二钾∶ 质量浓度 0． 01%三乙胺(15∶ 100∶ 2)的混
合溶液;流速为 0． 8 ml·min －1;检测波长为 262 nm;进样量为 10
μl。理论板数按青藤碱峰计不低于 3 000。
2． 1． 2 对照品溶液及标准曲线的制备 精密称取对照品青藤碱
0． 1 mg，置 10 ml容量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释至刻度，即得
对照品的储备溶液。再精密量取 1 ml该储备溶液，置 10 ml量瓶
中，制成每毫升含青藤碱 0． 001 mg 的对照品溶液。精密吸取对
照品溶液一定量按倍数关系稀释成 6 种不同质量浓度的溶液，分
别吸取 10 μl，进行 HPLC 分析。以峰面积与质量浓度进行线性
拟合，得线性方程 Y =1． 166 × 109X － 11 959． 667，r = 0． 999 5。线
性范围:0． 000 2 ～ 0． 001 mg·ml －1。
2． 1． 3 供试品溶液的制备及含量测定方法 称取青风藤药材 30
g按表 2 星点设计优化实验用乙醇微波提取，所得提取液滤过、
浓缩，置 500 ml容量瓶中加乙醇至刻度。精密吸取提取液(提取
液来源为按表 2 星点设计优化实验所得)0． 1 ml，置 100 ml 容量
瓶中，加乙醇至刻度，即得。测定时，吸取 10 μl 样品溶液，进行
HPLC分析。根据标准曲线进行青藤碱含量计算。
2． 1． 4 精密度试验 取青风藤样品，制备供试品溶液，连续进样
6 次，结果青藤碱峰面积的 ＲSD值为 2． 48%。
2． 1． 5 稳定性试验 取青风藤样品，制备供试品溶液，分别于 0，
2，4，6，8 h进样，结果青藤碱峰面积的 ＲSD值为 1． 92%。表明供
试品溶液在 8 h内稳定性良好。
2． 1． 6 重现性试验 取青风藤样品，平行制备 6 份供试品溶液，
分别测定，结果青藤碱质量分数的 ＲSD为 2． 10%。
2． 1． 7 加样回收率试验 分别精密称取青风藤粉末样品约 1 g
(约含有青藤碱 7 mg)9 份，分成高、中、低 3 组，加入一定量的青
藤碱对照品，制备供试品溶液测定，计算得平均回收率为
97． 98%，ＲSD为 2． 28%。
2． 2 青风藤中青藤碱提取工艺优化
2． 2． 1 星点实验设计 取青风藤 30 g，加适量溶剂微波辅助提
取，根据预实验及单因素实验结果，提取溶剂选择乙醇，考察因素
选择影响较显著的提取时间、乙醇体积百分数和微波功率，料液
比选择预实验中得率最大的 1∶ 20，提取次数为 2 次。根据星点
设计的原理，设计因素水平表见表 1。
2． 2． 2 模型拟合与工艺优化 以青藤碱含量(Y% )为因变量，
乙醇体积百分数、微波功率和提取时间为自变量，利用统计软件
SAS(8． 01)进行二次多项式拟合。二次多项式模型:Y = b0 +
b1X1 + b2X2 + b3X3 + b4X1
2 + b5X2
2 + b6X3
2 + b7X1X2 + b8X1X3 +
b9X2X3。以拟合方程的 r
2 和 P值作指标，选取合适的数学模型。
并以指标值为纵坐标，其他两个自变量为横坐标，描绘三维效应
面，由图中的指标值选取最佳自变量值，用效应面法得出的工艺
条件提取药材，并进行预测分析，进行验证试验，最终得到优化的
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 3 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 3 期
书提取工艺条件。
表 1 星点设计因素与水平
因素 水平
对应代码值 ‐ 1． 68 ‐ 1 0 1 1． 68
时间 /min 4 6 9 12 14
乙醇体积百分数(%) 63 60 70 80 88
功率 /W 330 400 500 600 680
3 结果
3． 1 星点实验设计结果 取青藤碱 30 g，按照试验设计原理，采
用 3 因素 5 水平共计 20 个实验点进行响应面实验设计。实验结
果见表 2。
3． 2 模型拟合分析 以青藤碱提取量为因变量对各因素进行二
项式拟合，拟合模型如下:
Y = + 0． 798 1 － 0． 009 2X1 + 0． 056 0X2 － 0． 033 7X3 － 0． 037 3X1
2
－ 0． 044 6X2
2 － 0． 024 2X3
2 － 0． 030 1X1X2 － 0． 027 2X1X3 +
0． 013 00X2X3
式中，Y 为青藤碱得率(%) ，X1 萃取时间(min) ，X2 为乙醇
体积分数(%) ，X3 为微波功率(W)。回归方程各项的方差分析
见表 3。
表 2 星点实验设计与结果
试验号 X1 X2 X3 青藤碱得率 /%
1 － 1． 00 － 1． 00 1． 00 0． 595
2 － 1． 00 1． 00 1． 00 0． 760
3 1． 00 － 1． 00 － 1． 00 0． 753
4 0． 00 0． 00 0． 00 0． 793
5 1． 00 1． 00 1． 00 0． 663
6 1． 00 － 1． 00 1． 00 0． 570
7 0． 00 0． 00 0． 00 0． 789
8 0． 00 0． 00 0． 00 0． 803
9 － 1． 68 0． 00 0． 00 0． 729
10 0． 00 0． 00 － 1． 68 0． 781
11 1． 00 1． 00 － 1． 00 0． 745
12 0． 00 1． 68 0． 00 0． 785
13 0． 00 0． 00 1． 68 0． 694
14 0． 00 － 1． 68 0． 00 0． 575
15 1． 68 0． 00 0． 00 0． 671
16 0． 00 0． 00 0． 00 0． 784
17 0． 00 0． 00 0． 00 0． 800
18 － 1． 00 － 1． 00 － 1． 00 0． 621
19 － 1． 00 1． 00 － 1． 00 0． 783
20 0． 00 0． 00 0． 00 0． 817
表 3 方差分析表
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 显著水平 显著性
模型 0． 1226 9 0． 0136 33． 0707 ＜ 0． 0001 ＊＊
X1 0． 0012 1 0． 0012 2． 8192 0． 1241
X2 0． 0428 1 0． 0428 103． 8942 ＜ 0． 0001 ＊＊
X3 0． 0155 1 0． 0155 37． 6816 0． 0001 ＊＊
X12 0． 0201 1 0． 0201 48． 7624 ＜ 0． 0001 *
X22 0． 0287 1 0． 0287 69． 7265 ＜ 0． 0001 ＊＊
X32 0． 0085 1 0． 0085 20． 5445 0． 0011 *
X1X2 0． 0072 1 0． 0072 17． 5695 0． 0019 *
X1X3 0． 0059 1 0． 0059 14． 3294 0． 0036 *
X2X3 0． 0014 1 0． 0014 3． 2800 0． 1002
残差 0． 0041 10 0． 0004
失拟项 0． 0034 5 0． 0007 4． 9871 0． 0512
纯误差 0． 0007 5 0． 0001
总离差 0． 1267 19
＊＊Pr ＞ F值小于 0． 0001 为高度显著;* Pr ＞ F值小于 0． 05 为显著
3． 3 工艺优化和预测 依据各因素对其响应值所构成的三维立
体曲面图，可反映各因素对其响应值的影响。根据回归二项式方
程，应用 SAS 9． 0 统计软件作三维效应面图。见图 1 ～ 3。
从图 1 可以看出，整体得率较高，提取时间与乙醇体积分数
对得率的影响极为显著，而且随着乙醇浓度的提高，青藤碱得率
增加明显，但提取时间太长青藤碱得率反而下降，在得率最大区
域提取时间取值在 － 0． 3 ～ － 0． 5，即提取时间在 7． 30 ～ 8． 30
min之间得率最大。而乙醇体积分数取值在 0． 5 ～ 0． 7 之间，即
75% ～77%浓度乙醇溶液用于提取最佳。从图 2 得知，当固定乙
醇体积分数为 70%时，改变功率和时间整体得率不大，功率过高
不利于青藤碱的提取，但此时稍增加提取时间有利于青藤碱的提
取。在得率最大区域微波功率取值在 － 0． 3 ～ － 0． 5，即微波功率
为 450 ～ 470 W提取较好。此时延长提取时间至 － 0． 2 水平，即
8． 30 分左右会获得最大得率。
从图 3 可知，整体得率较高，增大乙醇体积分数有利于青藤
碱的提取，微波功率不适于太高。在得率最大区域，乙醇体积分
数取值在 0． 5 ～ 0． 7 之间，即 75% ～ 77%浓度乙醇溶液用于提取
会获得最大得率。微波功率取值在 － 0． 5 水平左右，即 450 W左
右会获得最大得率。
综合考虑工业生产的实际情况，确定提取青藤碱的最佳工艺
条件为:提取时间 8． 30 min，乙醇体积分数 75%，微波功率 450
W，在此条件下，青藤碱得率理论上可达 0． 824%。采用上述优化
条件提取青藤碱，重复 3 次进行验证试验，在此条件下青藤碱实
际得率的平均值为 0． 803%，与理论预测值相比，其相对误差小
于 5%。因此，基于星点 －效应面法所得的优化提取工艺参数准
确可靠，具有一定的实用价值。
图 1 时间与乙醇体积分数对得率的影响
图 2 时间与功率对得率的影响
图 3 乙醇体积分数与功率对得率的影响
4 结论
本文采用星点 －效应面法优化青藤碱提取工艺的参数，相对
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 3 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 3
书于正交设计更接近客观实际和便于找到极值范围，水平的选取直
观明了，实验精度更高，预测性更好。
青藤碱是一种酚性碱，也可以用酸水提取，碱调 pH 值后，有
机溶剂萃取的方法提取［6］。但酸碱的使用不利于工业三废的处
理，有机溶剂的使用也会加大成本。本文的方法只使用乙醇，得
率较高。而且之后的纯化过程可以使用离子交换树脂等方法，绿
色高效。具体的工艺参数作者正在进行后续实验。
参考文献:
［1］ 国家药典委员会． 中国药典，一部［S］． 北京:化学工业出版社，
2005:135．
［2］ 傅绍萱．青藤碱的药理作用Ⅱ［J］．药学学报，1963，10(11) :673．
［3］ 陈惠红．青藤碱制剂的临床应用及实验研究进展［J］． 实用中医药
杂志，2006，22(5) :317．
［4］ 吴 伟，崔光华．星点设计 － 效应面优化法及其在药学中的应用
［J］．国外医学·药学分册，2000，27(5) :292．
［5］ 吴 伟，崔光华，陆 彬．实验设计中多指标的优化:星点设计和总
评“归一值”的应用［J］．中国药学杂志，2000，35(8) :530．
［6］ 吴立军． 天然药物化学(第 4 版) ［M］． 北京:人民卫生出版社，
2005:381．
收稿日期:2012-07-27; 修订日期:2012-12-30
基金项目:国家自然科学基金( No． 30860364) ;
贵州中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究专项
( No． 200850)
作者简介:卢 苇( 1987-) ，女( 彝族) ，贵州织金人，现为贵州大学在读硕
士研究生，主要从事中药化学与新药开发研究工作．
* 通讯作者简介:梁光义( 1952-) ，男( 汉族) ，四川岳池人，现任贵阳中医
学院教授，硕士学位，主要从事中药化学与新药开发研究工作．
四逆汤 HPLC指纹图谱研究
卢 苇1，梁光义2，4* ，杨玉琴2，秦利芬2，贺祝英3，刘金环2，曹佩雪4
(1．贵州大学，贵州 贵阳 550025; 2．贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002;
3．贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002;
4．贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002)
摘要:目的 建立四逆汤 HPLC指纹图谱，并比较传统汤剂、经方颗粒及配方颗粒的相似性，为其配方颗粒的制备提供科学
依据。方法 采用 HPLC法，色谱柱: Diamonsil C18 ( 4． 6mm ×150mm，5μm) ;流动相:乙腈 －0． 05mol /L磷酸水溶液梯度洗脱，
检测波长: 230 nm;分析时间 86 min;流速: 1． 0 ml /min。结果 建立了四逆汤的指纹图谱，确定 22 个共有峰，相似度均大于
0． 97。结论 该指纹图谱检测方法简便、重现性好，可作为四逆汤各剂型质量控制标准，为临床应用提供科学依据。
关键词:四逆汤; 传统汤剂; 经方颗粒; 配方颗粒; 指纹图谱; 高效液相色谱法
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 03． 064
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 03-0661-02
Studies on HPLC Fingerprint of Sini Decoction
LU Wei1，LIANG Guang-yi2，4* ，YANG Yu-qin2，QIN Li-fen2，HE Zhu-ying3，LIU Jin-huan2，CAO Pei-xue4
( 1． Guizhou University，Guiyang 550025，China; 2． Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang
550002，China; 3． The First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang
550002，China; 4． The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese A-
cademy of Sciences，Guiyang 550002，China)
Abstract: Objective To establish the HPLC fingerprint of Sini decoction and compare the similarity of traditional decoction，
classical prescriptions，formula particles，So it can provide the scientific basis for the preparation of formula particles． Method-
s Using HPLC，Diamonsil C18( 4． 6mm × 150mm，5μm) ; flow phase: chromatographic column to acetonitrile － 0． 05mol /L phos-
phoric acid as flow phase for gradient elution and detected wavelength for 230 nm; analysis time for 86 min; flow rate: 1． 0ml /min．
Ｒesults The Sini decoction fingerprint has determined the 22 common peaks and similarity are greater than 0． 97． Conclusion The
fingerprint method is simple，good reproducibility and can be used as Sini decoction formulations quality control standards to pro-
vide a scientific basis for clinical application．
Key words: Sini Decoction; Traditional decoction; Classical prescriptions; Formula particles; Fingerprint; High per-
formance liquid chromatography
四逆汤出自张仲景《伤寒论》，由附子 10 g，干姜 6 g，炙甘草
10 g组成。该方具有温中逐寒，回阳救逆之功，用于阳虚欲脱、冷
汗自出、四肢厥逆、下利清谷、脉微欲绝等症的治疗。中药复方是
祖国中医药学的一个重要组成部分，但复方汤剂的应用受到一些
因素的影响，如药材的质量难以控制，煎煮过程缺乏规范性，使用
不方便等。然而如果将其制成经方颗粒或单位配方颗粒，就能解
决传统汤剂的不足;但三者临床疗效是否一致，化学成分组成是
否存在差异，是首要解决的问题。本研究建立四逆汤 HPLC指纹
图谱，并比较了传统汤剂、复方颗粒及配方颗粒的相似性，为其复
方颗粒、配方颗粒的制备及相关制剂质量控制，经典名优复方的
二次开发及临床应用提供科学依据。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 Aglient 1100 高效液相色谱仪(自动进样器，四元泵，
DAD检测器) ，HP1100 / WIND3D 化学工作站;国家药典委员会
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 3 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 3 期