全 文 ：·中药与免疫·
瑞香狼毒甲醇提取物抗瘤机理研究
王润田　张坤娟　佟慧　李全海　邓郁青
【摘要】　目的　研究瑞香狼毒甲醇提取物的抗瘤机理。方法　用不同剂量的瑞香狼毒甲醇提
取物(简称醇提物),观察其体内对荷瘤鼠和所荷肿瘤生长的作用;MTT法研究其体内对荷瘤鼠脾细胞
转化及NK活性 , 体外对正常鼠脾细胞生长 、转化和 NK活性以及对 3 株肿瘤细胞增殖的影响;流式细
胞术和透射电镜检测其体外对 K562的细胞周期和凋亡及 p53、bcl-2 和 c-myc基因表达的影响;台盼蓝
拒染法检测其体外对K562 增殖曲线的影响。结果　体内 , 每天 5μg kg醇提物可抑制肿瘤生长 , 提高
荷瘤鼠免疫功能。体外 , 0.1 ～ 10μg ml醇提物可刺激脾细胞增殖和协同最适量和亚适量 ConA 刺激脾
细胞转化 , 0.1 、1μg ml醇提物可提高脾细胞 NK杀伤活性 , 0.1～ 10μg ml醇提物对 K562、S180 和 YAC-1
的增殖均有抑制作用 , K562最为敏感。 0.5μg ml醇提物作用的 K562 , 处于 G0 G1 期的细胞和凋亡细
胞显著增加 , p53 基因表达显著增加 , bcl-2 和 c-myc基因表达显著下降。K562 在 0.5μg ml醇提物作用
24 h后洗去或不洗去培养9 d ,细胞虽仍存活 , 但密度却不增加。结论　醇提物在一定剂量范围内可抑
制肿瘤细胞生长 ,提高荷瘤鼠免疫功能。抗瘤机理与其可刺激脾细胞增殖 ,协同 ConA 刺激脾细胞转
化和提高脾细胞 NK杀伤活性及阻滞肿瘤细胞周期 ,抑制其分裂增殖 , 促进其凋亡有关。
【关键词】　瑞香狼毒甲醇提取物;抗肿瘤;小鼠
Study on the anti-tumor mechanisms of the methanol extract of Stellera chamaejasme L　WANG Run-tian ,
ZHANGKun-juan , TONG Hui , LI Quan-hai , DENG Yu-qing.Department of Immunology , Institute of Basic
Medical Science , Hebei Medical University , Shijiazhuang 050017 , China
Corresponding author:WANGRun-tian , E-mail:wangrt@hebmu.edu.cn
【Abstract】　Objective　To study the anti-tumor mechanisms of the methanol extract of Stellera chamae-
jasme L.(meSCL).Methods　Using different doses of meSCL, the effects of them on the S180-bearing mice and
tumor growth were observed in vivo , on the transformation and NK activity of S180-bearing mouse splenocytes in
vivo , the growth , transformation and NK activity of normal mouse splenocytes and the growth of three kinds of tu-
mor lines were assayed in vitro by MTT method , on the cytocycle , apoptosis and gene expressions of p53 , bcl-2
and c-myc of K562 were investigated by FACS and transmission electron microscopy and on the effect growth curve
of K562 was checked by the trypan blue staining-rejecting method.Results　Per day 5μg kg meSCL could inhibit
the tumor growth and improve the immune function of S180-bearing mice.In vitro , 0.1～ 10μg ml meSCL could
stimulate normal murine splenocytes to proliferate and to transform in coordination with the optimal and suboptimal
doses of ConA and enhance splenocyte NK activity.meSCL had proliferation-inhibitory effect on K562 , S180 and
YAC-1 in vitro and K562 cells were the most sensitive ones.The cells of apoptosis and at G0 G1 phase of K562 in-
cubating with meSCL were remarkably increased , the p53 gene expression was substantially increased and the gene
expressions of bcl-2 and c-myc were significantly decreased.In the period of culturing K562 cells with 0.5μg ml
meSCL for nine day s , the tumor cells were all alive but the cell density did not increase.Conclusion　A certain
dose of meSCL can inhibit the tumor growth and improve the immune function of tumor-bearing mice.The anti-tu-
mor mechanisms of meSCL could be explained by stimulation of the proliferation of splenocyte alone or in coordina-
tion with ConA and increase the activity of NK cells and it can hinder the cell cycle of tumor cells , inhibit their fis-
sion and proliferation , and promote their apoptosis.
【Key words】　Methanol extract of stellera chamaejasme L;Anti-tumor;Mouse
作者单位:050017石家庄 ,河北医科大学基础所免疫研究室
通讯作者:王润田(E-mail:wangrt@hebmu.edu.cn)
　　瑞香狼毒属于瑞香科植物〔1〕 ,其提取物近年已
用于恶性肿瘤治疗 ,取得了一定疗效。有关瑞香狼
毒的已有研究多集中于抗瘤化学成分分析〔2 , 3〕和体
内外抗瘤效果的观察〔4, 5〕 ,其抗瘤机制 ,特别是抗瘤
免疫机制研究报道较少 ,也不深入。我们应用瑞香
狼毒甲醇提取物在体内外较为系统地研究了其对肿
瘤细胞及免疫细胞的影响 。
材料和方法
主要试剂:瑞香狼毒甲醇提取物(简称醇提物),
(methanol extract of Stellera chamaejasme L , meSCL),河
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北医科大学科技总公司提供 ,以川产瑞香狼毒根按
文献〔3〕提取 ,最后获得的醇提物为白色粉末 ,化学
成分以二萜类为主。因其不能直接水溶 ,临用前先
用少量二甲基亚砜(DMSO)溶解 ,再用完全培液稀释
供细胞培养用或生理盐水稀释供腹腔注射用 ,DMSO
终浓度均为 1%。RPMI 1640(GIBCO 公司);ConA
(Sigma公司);MTT(华美公司)。
动物与细胞株:昆明小鼠 ,18 ～ 22g ,河北省实验
动物中心提供;小鼠肥大细胞瘤株 S180 、小鼠胸腺瘤
株YAC-1和人红白血病细胞株 K562 ,均由河北医科
大学实验动物中心吕占军教授惠赠 。
醇提物体内对荷瘤鼠作用:小鼠称体重后均于
右腋皮下接种 S180 细胞 ,每只 2×106 0.2ml , 24 h
后 ,随机分组 ,每组 10只 。实验组腹腔注射 0.2ml不
同剂量的醇提物 ,对照组注射等量生理盐水 ,每日 1
次 ,连续注射 14 d 。每日观察小鼠一般活动情况和
肿瘤生长情况 。于第 15 天将小鼠全部处死 ,称体
重 、瘤重 ,每组随机取 4只小鼠测定脾细胞数并用
MTT 法测定 ConA 作刺激剂的脾细胞转化〔6〕和用
YAC-1作靶细胞的脾细胞NK杀伤活性〔6〕。
醇提物体外对正常脾细胞生长的影响:小鼠脾
细胞悬液加入 96孔 ,每孔 5×105 。实验孔加不同剂
量的醇提物 ,对照孔加等量完全培液 ,均设 3复孔。
37℃,5%CO2 条件下分别培养 24 、48 、72 h ,MTT 法测
定吸光度(A)值并计算生长指数 ,生长指数=实验孔
A 值÷对照孔 A 值。
醇提物体外对 ConA 刺激正常脾细胞转化的影
响:最适量(1.25μg ml)和亚适量(0.625μg ml)ConA
刺激的脾细胞转化孔中加入不同剂量醇提物作为实
验孔 ,培养 48 h ,按文献〔6〕计算刺激指数 。
醇提物体外对正常脾细胞 NK活性的影响:将
效应细胞(脾细胞 5×105 孔 ,E)和靶细胞(YAC-1 ,T)
按50∶1加入96孔 ,即 E+T 孔 ,另设单独的 E 、T 孔。
实验组各孔加不同剂量醇提物 ,对照组加等量完全
培液 。培养24 h后按文献〔6〕计算 NK杀伤率 。
醇提物体外对肿瘤细胞增殖的影响:分别将肿
瘤细胞 S180 、YAC-1和 K562 加入 96 孔 , 2×104 孔 ,
各加不同剂量的醇提物为实验孔 ,对照孔加等量完
全培液 。37℃, 5%CO 2 条件下培养 72 h ,MTT 法测
定 A值并按下式计算增殖抑制率 ,抑制率=(1-实
验孔 A ÷对照孔 A)×100%。
醇提物体外对 K562 的细胞周期和凋亡及 p53 、
bcl-2 和 c-myc 基因表达的影响:将终浓度分别为
10
5 ml K562和 0.5μg ml醇提物加入培养瓶共育 ,分
别于 24 h 、48 h 、72 h 3个时间点 ,(1)取 106 个细胞
用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率及 p53 、bcl-2
和 c-myc基因表达的变化;(2)取107 个细胞固定后 ,
透射电镜观察。对照以完全培液共育结束时的细胞
做如上检测。
醇提物对 K562增殖曲线的影响:终浓度分别为
10
4 ml K562和 0.5μg ml的醇提物加入 24孔 ,每孔总
液量为 1.5ml ,一组在培养 24 h 后洗去醇提物 ,改加
1.5ml完全培液继续培养 ,另一组不洗去醇提物 。置
37℃,5%CO2 条件下培养 9 d。每日用台盼蓝拒染
法计数 200个细胞中活细胞数 ,计算活细胞百分率 ,
绘制增殖曲线。
统计学方法:采用 t检验和χ2 检验 , P<0.05为
差异有显著性。
结 果
1.醇提物体内对荷瘤鼠作用:与对照相比 ,每天
0.5μg kg 醇提物无明显作用;每天 5μg kg 组瘤的重
量轻 ,脾细胞数量增多 、转化及 NK 功能增强;每天
50μg kg 组仍有抗瘤作用 ,但已无明显免疫功能增强
作用;每天 500μg kg组瘤重明显增加 ,免疫功能降低
(表 1)。
表 1　不同剂量醇提物对荷瘤鼠的作用( x ±s)
Table 1.The effects of meSCL on S180-bearing mice( x ±s)
Group
Tumor weight(g)(n=10) Splenocy te(108)(n=4) Transfo rmationindex(n=4) NK activity(n=4)
A 0.680±0.305 1.938±0.517 1.754±0.234 21.43±0.305
B 0.398±0.251＊ 2.146±0.564＊ 2.015±0.208＊ 36.12±3.68＊
C 0.456±0.289＊ 2.154±0.348 1.683±0.287 22.30±0.422
D 1.092±0.121＊ 1.086±0.287＊ 1.489±0.124＊ 16.52±3.47＊
E 0.710±0.314 2.013±0.618 1.703±0.345 23.98±4.06
　　A:0.5μg kg per day;B:5μg kg per day;C:50μg kg per day;D:500μg kg per
day;E:contro l;＊:compared with group E , P<0.05
2.醇提物体外对正常脾细胞生长的影响:醇提
物与正常脾细胞共育 ,24 h时 , 0.001μg ml 、0.01μg ml
醇提物组的生长指数与对照无差异 ,而 0.1 ～ 10
μg ml醇提物可刺激脾细胞增殖(P <0.05),并呈剂
量依赖式;共育至 48 h 、72 h ,0.001 ～ 10μg ml醇提物
对脾细胞生长与对照无差异(P >0.05)见图 1。
3.醇提物体外对 ConA刺激正常脾细胞转化的
影响:0.001μg ml 、0.01μg ml醇提物对 ConA 刺激的
正常脾细胞转化无影响;0.1 ～ 10μg ml 醇提物与最
适量和亚适量 ConA均具有协同刺激作用(表 2)。
4.醇提物体外对正常脾细胞 NK活性的影响:
0.1μg ml和 1μg ml醇提物作用的脾细胞 NK活性分
别为 35.16%±1.73%、36.53%±2.14%,与对照组
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(18.53%±1.98%)差异有显著性(P <0.05);而同
时间内醇提物本身对 YAC-1活性无明显影响 。
图 1　醇提物对正常脾细胞生长的影响
Fig 1.The effect of meSCL on normal splenocyte growth
表 2　醇提物与 ConA共刺激正常脾细胞转化的刺激指
数( x ±s)
Table 2.The stimulation index of normal splenocyte trans-
formation costimulated by meSCL and ConA( x ±s)
meSCL(μg ml)
0 0.001 0.01 0.1 1 10
A 1.812±0.236 1.822±0.221 2.055±0.306 2.711±0.400＊ 3.023±0.161＊ 2.721±0.201＊△
B 2.604±0.155 2.445±0.219 2.815±0.234 3.267±0.301＊ 3.597±0.308＊ 2.916±0.147＊△
　　A:meSCL and second proper amount ConA;B:meSCL and most proper
amount ConA;＊:compared with control induced by ConA , P<0.05;△:
compared with group of 1μg ml meSCL , P<0.05
5.醇提物体外对肿瘤细胞的增殖抑制作用:
0.001 ～ 10μg ml 醇提物对 K562增殖均有抑制作用
(P<0.05),其中 1μg ml和 10μg ml醇提物组抑制作
用最大 , 两组间差异无显著性(P >0.05);0.1 ～
10μg ml醇提物对S180和 YAC-1均有剂量依赖式的
增殖抑制作用(P <0.05), 10μg ml时抑制作用最明
显(图 2)。
图 2　meSCL对不同肿瘤细胞系的抑制率
Fig 2.Inhibition rates on tumor cells of meSCL
6.醇提物体外对 K562 的细胞周期和凋亡及
p53 、bcl-2和 c-myc基因表达的影响
(1)对细胞周期的影响:由表 3 可见 ,醇提物组
K562与对照组相比 , 24 h 时处于 G2 M 期的细胞降
低;48 h时 G2 M 期的细胞降低更为明显 ,同时处于
G0 G1 期的细胞增加 ,72 h时这种改变更为明显。
表 3　醇提物培养不同时间 K562 细胞中处于不同细胞
周期细胞的百分率(%)
Table 3.The cell percentages at different cycle of K562 in-
cubated with meSCL(%)
meSCL
24 h 48h 72h
Control
G 0 G1 69 80.7 81.4 73.0
S 15.4 7.2 9.4 12.1
G 2 M 15.6 12.1 9.2 17.6
　　Three meSCL groups compared with control , P<0.05
(2)对细胞凋亡的影响:流式细胞仪测定 24 h 、
48 h 、72 h醇提物组K562细胞凋亡率分别为 10.3%、
11.4%和 15.6%,对照组为 3.2%(图 3);电镜形态
学观察 , 24 h 可见染色质轻度边聚 ,而 48 h 和 72 h
时 ,K562具有染色质边聚浓缩 、细胞核浓缩等凋亡
形态学改变(图 4)。
图 3　醇提物作用不同时间的 K562 细胞凋亡率
Fig 3. Apoptosis percentage of K562 incubated with
meSCL at different time
AP is the apoptosis peak
(3)对 p53 、bcl-2和 c-myc基因表达的影响:表 4
示 ,0.5μg ml醇提物作用的 K562细胞:① p53基因
表达 ,在 24 h时增加 ,48 h时增加最明显 , 72 h时虽
有降低但仍高于对照(P <0.05)。②c-myc基因表
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图 4　醇提物作用不同时间的 K562 细胞凋亡电镜照片(×3 500)
Fig 4.Transmission electron microscope photos of apoptosis cells of K562 induced by meSCL at different time(×3 500)
A:Control;B:24 h;C:48 h;D:72 h
达 ,在 24 h和 48 h时升高 , 72 h时下降至低于对照
(P<0.05)。 ③bcl-2基因表达 ,24 h时略有升高 ,48
h时明显下降 ,72 h最低 ,见表 4。
表 4　醇提物作用不同时间的 K562细胞 p53、bcl-2和 c-
myc基因表达阳性细胞率(%)
Table 4.The expression cell percentage of p53 , bcl-2 and
c-myc among K562 cells incubated with meSCL(%)
Group p53 bcl-2 c-myc
24 h 34.2 56.1 32.4
48 h 38.9 41.1 36.8
72 h 19.5 20.4 18.6
Control 15.8 55.0 26.7
　　The gene expression cell percentage in meSCL group compared with con-
trol , P<0.05
7.醇提物对 K562增殖曲线的影响:图 5示 ,醇
提物作用组 K562细胞虽存活 ,但密度不增(因培养
24 h后洗去醇提物与不洗去者差异无显著性 ,故在
图中以同一条线表示),而对照组 K562却增殖了 35
～ 40倍 。
图 5　醇提物对 K562 增殖曲线的影响
Fig 5.The effect of meSCL on the K562 proliferation
curve
讨 论
我们应用瑞香狼毒甲醇提取物研究了其体内抑
瘤作用 ,结果显示每天 0.5μg kg 醇提物体内对肿瘤
和免疫功能均无明显作用;每天 5μg kg 时对肿瘤有
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明显抑制作用 ,对免疫功能有显著提高作用;每天
50μg kg 时虽仍有抗瘤作用 ,但对免疫功能已无明显
提高作用;当剂量大至每天 500μg kg 时 ,小鼠免疫
功能明显降低 ,肿瘤生长加速 ,瘤重增加 ,并且最初
3 d小鼠饮食明显减少 ,3 d后虽饮食基本恢复(由饲
料称重得知 ,资料未列出),但仍萎靡消瘦。以上说
明 ,醇提物的有效剂量范围较窄 ,以每天 5μg kg 为
宜。药物体内抗肿瘤是药物对肿瘤细胞的直接作用
及对免疫功能影响的综合效应 ,为此 ,我们进一步在
体外分别研究了醇提物对免疫细胞和肿瘤细胞的作
用。
醇提物体外与脾细胞共育 24 ～ 72 h对脾细胞生
长无毒性作用 ,并且 24 h时 0.1 ～ 10μg ml醇提物还
对脾细胞有一过性的促增殖作用。ConA是一种 T
细胞丝裂原 ,0.1 ～ 10μg ml醇提物与 ConA 具有协同
刺激脾细胞转化的作用 ,结合其自身可刺激脾细胞
增殖 ,提示醇提物可能具有类似T 细胞丝裂原作用 ,
但也不排除其对非 T 细胞也有刺激作用 ,此需进一
步研究确定。我们还发现 ,醇提物可提高脾细胞NK
杀伤活性 ,相同时间内其本身对 YAC-1活性无明显
影响 ,因此 ,推断醇提物有可能是提高了脾细胞 NK
杀伤功能或增加了 YAC-1对 NK杀伤的敏感性 ,或
两种作用兼而有之。以上结果提示 ,瑞香狼毒抗瘤
免疫机制可能与其促进脾细胞中T 细胞活化和提高
脾细胞NK杀伤活性有关。
本研究发现 ,人来源的红白血病肿瘤细胞系
K562对醇提物的敏感性远高于小鼠来源的肿瘤细
胞系S180和 YAC-1 ,说明醇提物的抗瘤作用可能与
肿瘤细胞的物种来源有关。冯威健〔7 ,8〕等的研究资
料表明 ,瑞香狼毒甲醇提取物对小鼠 L1210和 P388
等血液系统来源的肿瘤细胞系的抗瘤效果好 。提
示 ,有可能人源性肿瘤细胞和血液来源的肿瘤细胞
对瑞香狼毒甲醇提取物更为敏感。
醇提物作用 24 h的K562分裂期细胞减少 ,p53 、
bcl-2和 c-myc的表达都有所增加 ,但凋亡基因 p53
表达增加显著 ,因此凋亡细胞增加 。醇提物继续作
用至 48 h ,分裂期细胞进一步减少 ,而 G0 G1 细胞明
显增加 , p53表达达最高值 ,bcl-2表达明显减低 ,因
此细胞凋亡率增加 ,电镜可见凋亡形态学改变 。醇
提物作用 72 h ,分裂期细胞更少 ,G0 G1 期细胞继续
增加;p53表达虽有下降 ,但仍高于对照 ,而 bcl-2和
c-myc表达均明显降低 ,发生凋亡的细胞更多 ,电镜
观察易见典型的凋亡形态改变 。以上结果提示 ,醇
提物抗瘤机理还可能与其能阻滞肿瘤细胞周期 ,抑
制肿瘤细胞分裂增殖和促进肿瘤细胞凋亡有关 。本
研究结果显示 ,培养24 h后洗去或不洗去醇提物对
K562细胞的增殖抑制作用无明显不同 ,说明醇提物
的这种作用在 24 h时即已发挥 ,且一旦发挥即可自
行维持至少 9 d。
已有对瑞香狼毒抗肿瘤成分的分析资料表明 ,
抗瘤活性成分主要存在于其醇提物中 ,并且醇提物
中多种成分均具有抗瘤作用〔4 , 5〕 。本实验所用甲醇
提取物是以二萜类化合物为主的多组分的混合物 ,
本研究所显示的体内外抗瘤作用 ,可能是其多种组
分的综合作用 ,也可能是其某一单独组分的作用 ,尚
需进一步研究。本研究显示适宜剂量醇提物体内应
用具有抑瘤和提高免疫力的作用 ,而大剂量具有毒
性作用 ,因此 ,临床应用瑞香狼毒对其剂量应十分慎
重 。
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(收稿日期:2002-11-28)
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