全 文 ： 药理药化
收稿日期:2008-07-03;　修订日期:2008-12-22
基金项目:四川省中医药管理局资助课题(No.200606)
作者简介:许小红(1974-),男(汉族),甘肃泾川人 ,现任成都医学院药学
院副教授 ,博士学位 ,主要从事中药新剂型研究工作.
高效液相色谱法测定贯叶连翘提取物中 4种成分的含量
许小红 , 廖丽云 , 陈龙江
(成都医学院·药学院 ,四川 成都　610083)
摘要:目的 建立高效液相色谱法(HPLC)测定贯叶连翘提取物中金丝桃素 、金丝桃苷 、芦丁和槲皮素含量的方法。方法
色谱柱为 C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm);测定金丝桃苷 、芦丁和槲皮素时 , 流动相为甲醇 -乙睛 -0.3%磷酸溶液 , 梯
度洗脱 , 检测波长 360nm;测定金丝桃素时 ,流动相为甲醇 -0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液 , 检测波长 580 nm。结果 金
丝桃苷 , 槲皮素 , 芦丁 、金丝桃素线性范围分别为 1.97 ～ 20.3 μg· ml-1(r=0.999 2), 2.47 ～ 24.7 μg· ml-1(r=
0.999 1), 2.25 ～ 22.5 μg· ml-1(r=0.999 1), 0.08 ～ 0.4 μg· ml-1(r=0.999 5), 方法回收率均不低于 98%。结论
该方法简便 、准确 、重复性好 , 可用作贯叶连翘提取物中此 4种成分的含量测定。
关键词:贯叶连翘提取物;　金丝桃素;　金丝桃苷;　高效液相色谱法
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)06-1317-02
DeterminationofFourComponentsintheHypericumperforatumL.ExtractsbyHPLC
XUXiao-hong, LIAOLi-yun, CHENLong-jiang
(DepartmentofPharmacology, ChengduMedicalColege, Chengdu, Sichuan, 610083, China)
Abstract:ObjectiveTodeveloparapidhigh-performanceliquidchromatographymethodfordeterminationofhypericin, hy-
peroside, rutinandquercetininHypericumperforatumL.extracts.MethodsHPLCmethodwasemployedonC18 column(250mm×4.6 mm, 5 μm).Thehyperoside, rutinandquercetinweredetectedat360 nm, elutedwithgradientthreemobilephase
(methanol-acetonitrile-0.3% phosophoricacid).TheHypericinwasdetectedat580 nmandthemobilephaseconsistedof
methanoland0.02mol· L-1 KH2PO4.ResultsTheHPLCmethodshowedagoodlinearrelationshipintherangeof1.97 ～ 20.3
μg/ml(r=0.999 2)forhyperoside, 2.47～ 24.7μg/ml(r=0.999 1)forquercetin, 2.25 ～ 22.5μg· ml-1(r=0.999 1)for
rutinand0.08 ～ 0.4 μg/ml(r=0.999 5)forhyperin.Recoveriesforthefourcomponentswereallabove98%.CondusionThis
HPLCmethodissimple, accurateandrepeatableandcanbeusedfordeterminationofthefourcomponentsinHypericumperfora-
tumL.exatracts.
Keywords:HypericumperforatumL.extracts;　Hyperin;　Hyperoside;　HPLC
　　贯叶连翘 HypericumperformatumL.为藤黄科金丝桃属多年
生草本植物 , 其味苦 、辛 , 性平 ,可清心明目 、调经活血 、止血生肌 、
解毒消炎 [ 1] , 国外在抗抑郁症方面也有广泛应用 [ 2] 。贯叶连翘
其提取物主要成分有金丝桃素 (hypericin)、金丝桃苷 、芦丁和槲
皮素等 , 结构式如图 1。其中金丝桃素为萘骈二蒽酮类结构 , 在
酸性溶液中溶解度极低;其余 3种物质为黄酮类结构 ,采用 HPLC
测定含量时一般需偏酸性流动相 ,因此较难用同种方法同时测定
此 4种物质。金丝桃苷与芦丁均为槲皮素与不同糖苷形成的苷 ,
采用等度 HPLC分离度较难达到要求。 因此本文分别建立了金
丝桃素 HPLC测定法与金丝桃苷 、芦丁和槲皮素 HPLC梯度洗脱
测定法 , 以期为贯叶连翘提取物的质量控制及制剂的开发提供含
量测定的方法。
1　仪器与试药
1.1　仪器 高效液相色谱仪(Dionex, 美国), 包括 P680四元泵 、
ASI-100自动进样器 、UV1700型检测器 , TC100柱温箱 , Chrome-
leon工作站 , PHS-3C型酸度计(上海精密科学仪器有限公司)。
1.2　试药 金丝桃素对照品(Sigma公司 , 规格 1mg, 批号 548 -
04-9);金丝桃苷对照品(批号 111521 -200303),槲皮素对照品
(批号 100081-200406),芦丁对照品(批号 100080-200306),均
购自中国生物制品检定所。贯叶连翘提取物 , 成都医学院天然
药化教研室制备。甲醇 、乙腈均为色谱纯 , 磷酸二氢钾 、磷酸为分
析纯 , 水为纯蒸水。
图 1　贯叶连翘提取物 4种主要成分的结构式
2　方法与结果
2.1　金丝桃素测定
2.1.1　色谱条件 色谱柱 AlltechC18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm);流动相为甲醇 -0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(2∶ 98)
(取1.36g磷酸二氢钾 , 加水 500 ml使溶解 , 用四丁基氢氧化铵
溶液调 pH值至 6.5);检测波长 580 nm;流速 1.0 ml· min-1;柱
温 40 ℃;进样量 20 μl。理论塔板数以金丝桃素峰计不得低于
3 000。结果见图 2。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.6 时珍国医国药 2009年第 20卷第 6期
a-对照品溶液　b-供试品溶液　1.金丝桃素
图 2　金丝桃素对照品溶液及贯叶连翘提取物供试品溶液 HPLC图
2.1.2　对照品贮备液的制备 取金丝桃素对照品 1 mg, 置 50 ml
棕色量瓶中 , 加甲醇超声溶解并稀释至刻度 , 摇匀制得浓度为 20
μg· ml-1的对照品贮备液。
2.1.3　供试品溶液的制备 取贯叶连翘提取物粉末 50 mg,置 25
ml量瓶中 ,加入适量甲醇 ,超声处理 30 min, 加甲醇定容至刻度 ,
0.22 μm微孔滤膜过滤 ,取续滤液即得。
2.1.4　线性范围考察 精密吸取 “ 2.1.2”项下金丝桃素对照品
贮备液 , 依次制备浓度为 0.40, 0.32, 0.24, 0.20, 0.16, 0.08 μg
· ml-1的系列标准品溶液 ,分别取 20 μl, 注入色谱仪 , 记录金丝
桃素峰面积 , 以峰面积值(A)为纵坐标 ,浓度 C(μg· ml-1)为横
坐标 , 进行线性回归 , 结果方程为:A=572.73C-0.212, r=
0.999 5,表明金丝桃素在 0.08 ～ 0.40 μg· ml-1范围内线性关系
良好。
2.1.5　稳定性实验 取置棕色量瓶中放置的供试品溶液 20 μl,
分别于 0, 1, 2, 3, 4 h注入色谱仪 , 测定金丝桃素峰面积的 RSD为
1.65% (n=6),表明供试品溶液在 4 h内基本稳定。
2.1.6　重复性实验 取同批样品约 50 mg, 精密称定 , 共 5份 ,
制备供试品溶液 , 精密吸取 20 μl, 注入液相色谱仪 ,测定峰面积 ,
金丝桃素含量为 1.21mg· g-1 , RSD为 1.4%(n=5)。本方法
的重复性良好。
2.1.7　加样回收率实验 取金丝桃素含量已知的提取物样品 5
份 , 每份约 50 mg, 精密称定 , 分别精密加入金丝桃素对照品贮
备液 1 ml, 按 “ 2.1.3”项下方法制备供试品溶液 , 进样 20 μl,计
算回收率。结果见表 1。
表 1　金丝桃素回收率实验
样品中含量
m/mg
测得量
m/mg
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
0.059 9 0.058 6 97.8
0.059 7 0.058 6 98.2
0.060 1 0.058 6 97.6 98.0 0.83
0.060 3 0.059 9 99.3
0.060 3 0.058 6 97.2
　　n=5
2.2　金丝桃苷 、槲皮素 、芦丁的测定
2.2.1　色谱条件 色谱柱 AltechC18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);流动相 A为磷酸(0.3%),流动相 B为乙腈 , 流动相 C为甲
醇;采用梯度洗脱法:0 ～ 10min(95 ～ 85∶5 ～ 15∶0), 10 ～ 30
min(85 ～ 70∶20 ～ 75∶0 ～ 10), 30 ～ 45 min(70 ～ 10∶20 ～ 75
∶10 ～ 15), 45 ～ 55 min(10 ～ 5∶75 ～ 80∶15), 55 ～ 56 min(5
～ 95∶80 ～ 5∶15 ～ 0), 56 ～ 60 min(95∶5∶0);检测波长 360
nm;流速 1.0 ml· min-1;柱温 40℃;进样量 20 μl。理论塔板数
以金丝桃苷峰计不得低于 5 000。结果见图 3。
a-混合对照品溶液　b-供试品溶液　1.金丝桃苷;　2.芦丁;　3.槲皮素
图 3　混合对照品溶液及贯叶连翘提取物供试品溶液 HPLC图
2.2.2　对照品溶液的制备 分别精密称取金丝桃苷 、槲皮素 、芦
丁对照品 12.5, 10.30, 7.02 mg, 分别置 50 ml容量瓶 ,加甲醇稀
释至刻度 ,待用。依次取以上 3种对照品溶液 2.0, 3.0 , 4.0 ml
至 25ml容量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 , 得分别含金丝桃苷 、槲皮
素 、芦丁 20.0, 24.7, 22.4 μg· ml-1的混合对照品溶液。
2.2.3　供试品溶液的制备 同 “ 2.1.3”项下方法。
2.2.4　线性范围考察 精密吸取 “ 2.2.2”项下混合对照品溶液 ,
稀释制备成系列浓度的混合标准品溶液 ,分别取 20 μl注入色谱
仪 , 记录金丝桃苷 、槲皮素 、芦丁峰面积 , 以峰面积值 A为纵坐标 ,
浓度 C(μg· ml-1)为横坐标进行线性回归 , 方程及回归系数分
别为:金丝桃苷:A=0.583 5C-0.503 2, r=0.999 2(n=6);槲皮
素:A=1.530 6C-1.696 3, r=0.999 1;芦丁:A=0.490 6C-
0.365 2, r=0.999 1。 表明 3种成分分别在 1.97 ～ 20.3 μg·
ml-1 , 2.47～ 24.7 μg· ml-1 , 2.25 ～ 22.5 μg· ml-1范围内线性良
好。
2.2.5　稳定性实验 取置棕色量瓶中放置的供试品溶液 20 μl,
于 0, 1, 2, 3, 4 h分别注入液相色谱仪 ,测定金丝桃苷 、槲皮素 、芦
丁峰面积的 RSD分别为 1.88%, 1.27%, 1.45% (n=5)。表明
提取物供试品溶液中 3种成分在 4 h基本内稳定。
2.2.6　重复性实验 取同批样品约 50 mg, 精密称定 , 共 5份 ,
制备供试品溶液 ,精密吸取 20 μl, 注入液相色谱仪 , 测定金丝桃
苷 、槲皮素 、芦丁峰含量分别为 6.72, 13.52, 5.88 mg· g-1 , RSD
分别为 1.67%, 1.53%, 1.48% (n=5)。
2.2.7　回收率实验 采用加样回收法 , 称取已知金丝桃苷 、槲皮
素 、芦丁含量的提取物样品 5份 ,每份约 50mg,精密称定 , 分别精
密加入混合对照品溶液 2.0 ml, 按 “ 2.2.3”项下方法制备供试品
溶液 , 进样 20 μl, 计算回收率。结果见表 2。
表 2　金丝桃苷 、芦丁 、槲皮素回收率实验结果
成分 样品中含量m/mg
测得量
m/mg
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD
(%)
0.336 6 0.336 9 100.1
0.334 3 0.330 8 99.0
金丝桃苷 0.332 1 0.328 8 99.0 98.9 0.87
0.331 9 0.328 98.8
0.338 7 0.330 8 97.7
0.291 4 0.288 3 98.9
0.289 4 0.286 1 98.9
芦丁 0.287 4 0.284 9 99.1 99 0.26
0.287 3 0.283 3 98.6
0.293 2 0.291 1 99.3
0.663 2 0.655 5 98.8
0.658 5 0.652 1 99.0
槲皮素 0.654 2 0.646 6 98.8 98.8 0.53
0.653 8 0.64 97.9
0.667 3 0.660 3 99.0
　　n=5
2.3　样品测定 取连续 3批提取物 , 依法制备供试品溶液 , 分别
按上述色谱条件测定 4种成分。结果见表 3。
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 6期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.6
表 3　3批贯叶连翘提取物含量测定结果
成分 批号 含量 / mg· g-1 RSD(%)
070801 1.12 1.32
金丝桃素 070802 1.04 1.58
070803 1.23 1.67
070801 6.75 1.44
金丝桃苷 070802 7.12 1.72
070803 6.25 1.35
070801 13.42 1.48
芦丁 070802 14.56 1.68
070803 12.89 1.44
070801 6.62 1.5
槲皮素 070802 5.85 1.62
070803 5.28 1.55
　　n=3
3　讨论
金丝桃素仅溶于偏碱性水溶液中 ,在酸性流动相环境中不出
峰 , 很难与其它 3种成分同时测定 , 本实验调节流动相 pH值为
6.5时 ,金丝桃素峰峰形良好 ,适于该物质含量测定。
测定金丝桃苷 、芦丁和槲皮素时 , 在 270 nm及 360 nm波长
处均有较强吸收 ,但在 360 nm波长处杂质峰较少 , 分离效果好。
金丝桃苷与芦丁为槲皮素与不同糖苷形成的苷 ,理化性质差异较
小 , 等度 HPLC分离度难以达到要求 , 本文采用梯度洗脱的方法 ,
可完全分离金丝桃苷 、芦丁 , 分离度 >2.0。
参考文献:
[ 1 ] 　胡　然 ,库宝善 ,张永鹤.人类免疫缺陷病毒与疱疹病毒感染具有
相关性 [ J] .生理科学进展 , 2004, 35(1):63.
[ 2 ] 　杨得坡 ,甘良春 ,胡海燕.国外对贯叶连翘抗抑郁疗效的临床验证
[ J] .中西医结合学报 , 2004, 2(3):231.
收稿日期:2008-08-18;　修订日期:2008-12-22
基金项目:教育部留学回国人员科研启动基金
作者简介:葛　建(1979-),男(汉族),安徽蚌埠人 ,现任中国计量学院生命科学学院讲师 ,博士学位 ,主要从事天然产物分析及药物动力学研究工作.
＊通讯作者简介:卢秀莲(1970-),女(汉族),福建龙岩人 ,现任中国计量学院生命科学学院副教授 ,博士学位 ,主要从事化学药物合成研究工作.
反相高效液相色谱法同时测定参苓白术颗粒中
白术内酯 Ⅱ和白术内酯 Ⅲ的含量
葛　建 ,楼纪东 ,林　芳 ,黄丽红 ,姜　威 ,李明揆 ,卢秀莲＊
(中国计量学院 ·生命科学学院 ,浙江 杭州　310018)
摘要:目的 建立一种同时测定白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的高效液相色谱检测方法 , 并分析中成药参苓白术颗粒中白术
内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量。 方法 样品采用液 -液萃取 , 以乙腈 -水(50∶50)为流动相 , 流速 1.0 ml· min-1 ,采用
SHIMADZUODS柱(150 mm×4.6 mm;5 μm)色谱柱分离;检测波长 220 nm。结果 标准曲线线性范围为 0.5 ～ 50.0 μg
· ml-1 ,线性关系良好(r>0.99),定量限为 0.5 μg/ml, 回收率 98%以上 ,方法的稳定性 、重复性和精密度均较好(RSD<
3%)。结论 该法操作简便 、快速 、灵敏 、准确 , 已经成功地用于中成药参苓白术颗粒中白术内酯Ⅱ和白术内酯 Ⅲ的含量
测定。
关键词:白术内酯Ⅱ;　白术内酯Ⅲ;　高效液相色谱 -紫外检测法;　参苓白术颗粒
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)06-1319-02
SimultaneousDeterminationofAtractylenolideIIandIIIinShenlingBaizhuGranuleby
RP-HPLC
GEJian, LOUJi-dong, LINFang, HUANGLi-hong, JIANGWei, LIMing-kui, LUXiu-lian＊
(DepartmentofPharmacology, ColegeofLifeSciences, ChinaMetrologicalColege, Hangzhou, Zhejiang,
310018 China)
Abstract:ObjectiveTodevelopanHPLC-UVmethodforthesimultaneousdeterminationofatractylenolideIIandIIandto
detectthecontentofatractylenolideIIandIIIinChinesemedicinalpreparation.MethodsAfterasimpleliquid-liquidextrac-
tion, atractylenolideIIandIIIwereseparatedonSHIMADZUC18 column(4.6 mm×150 mm, 5μm)anddetectedbyUVspec-
trometry.Thedetectionwavelengthwassetat220nm.Themobilephaseconsistedofacetonitrile-water(50∶50)ataflowrate
of1.0 ml· min-1.ThecontentofatractylenolideIIandIIIinChinesemedicinalpreparation(ShenlingBaizhuGranule)wassim-
ultaneouslydeterminedbythemethodaboveaftersimpleliquid-liquidextraction.ResultsThelinearcalibrationcurveswereob-
tainedintheconcentrationrangeof0.5 ～ 50.0 μg· ml-1(r>0.99).Thelowerlimitofquantificationwas0.5μg· ml-1.The
recoveriesweremorethan98.0%, andthestability, repeatabilityandprecisionofthemethodwereallbetterinallcases(RSD<
3%).ConclusionTheRP-HPLCmethodisspecific, simple, sensitiveandaccurate.Andthismethodwassuccessfulyapplied
tosimultaneouslyquantitateatractylenolideIIandIIIinChinesemedicinalpreparation(ShenlingBaizhuGranule).
Keywords:AtractylenolideII;　AtractylenolideII;　RP-HPLC;　ShenlingBaizhuGranule
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.6 时珍国医国药 2009年第 20卷第 6期